劉 平,張 毅,劉俐君,董春霞,盧 美,侯 建,石代鈺,徐全剛,孫向東,王幼明*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266032;2.遵義醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,貴州遵義 563000;3.四川達州市動物疫病預防控制中心,四川達州 635000;4.重慶市動物疫病預防控制中心,重慶 401123)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的牛、羊、豬、鹿、犬等哺乳動物和人類共患的一種傳染病[1],在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。全球范圍內(nèi)每年新增約50萬人間病例[2],2021年我國人間感染病例達到6.9萬例[3]。布魯氏菌病造成畜牧生產(chǎn)損失的同時,嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。動物布魯氏菌病防控是布魯氏菌病防控的關鍵,該病早期很難通過臨床癥狀進行診斷,實驗室檢測就顯得尤為重要[4]?；⒓t平板凝集試驗(rose bengal plate test,RBT)是目前基層動物疫病預防控制機構對風險動物進行檢測的主要手段[5]。前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn),基層很多實驗室技術人員對不同廠家生產(chǎn)RBT試劑檢測結果的可靠性和一致性存疑。本研究對目前市場上常見的不同廠家RBT試劑盒進行比較,評價其檢測效果,以期為基層動物疫病預防控制機構選擇適合的RBT試劑提供方法,為疫病流行狀況估計和疫病凈化效果等的評估分析工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(complement-enzyme linked immunosorbent assay,cELISA)是世界動物衛(wèi)生組織推薦的布魯氏菌病確診試驗,敏感性和特異性分別為0.95≤Se≤1和0.96≤Sp≤1[6]。參考前期研究[7],本研究選取cELISA檢測結果作為相對金標準。布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒(批號:20221104),武漢某生物股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 參考血清 布魯氏菌抗體陽性(批號:010032001)和陰性參考血清(批號:010021901),青島立見生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床血清樣品 2022-2023年間,收集背景信息清楚的臨床羊血清樣品200份,均來自布魯氏菌病未免疫羊場。用cELISA方法對其進行檢測,最終選擇60份布魯氏菌抗體陽性血清和50份布魯氏菌抗體陰性血清用于5種試劑盒的比較試驗。

1.1.4 虎紅平板凝集試驗試劑盒 選取地方動物疫病預防控制機構在用的5個不同廠家的RBT試劑盒,分別命名為A、B、C、D、E。

1.2 方法

1.2.1 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗 取包被板將稀釋好的待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清分別加入到板孔中,50 μL/孔,其中陽性對照血清和陰性對照血清各加2孔;再立即加入稀釋好的單克隆抗體溶液50 μL,室溫反應45 min;棄去孔中的溶液,每孔加入稀釋好的洗滌液300 μL,靜置1 min后,棄去洗滌液;洗滌5次后在吸水紙上拍干;加入酶標記物100 μL,室溫反應45 min,棄去孔中的溶液,洗滌5次;每孔加入底物顯色液100 μL,避光顯色10 min;每孔加入終止液50 μL,10 min內(nèi)在酶標儀上測定每孔OD 450 nm值。結果判斷參照說明書建議標準。

1.2.2 虎紅平板凝集試驗 利用5種試劑盒分別對110份臨床血清和標準血清進行檢測。試驗操作和結果判斷按照試劑盒說明書進行(各廠家試劑盒操作步驟基本一致)。試驗前,將血清和抗原在室溫下放置30～60 min;將玻璃板上標記被檢血清號,同時設置陰性血清、陽性血清對照;然后加相應被檢血清0.03 mL;在被檢血清的旁邊加入虎紅平板凝集抗原0.03 mL;用滅菌的牙簽攪動血清和抗原,使之充分混合,在5 min內(nèi)觀察結果。檢測結果按照表1格式整理。

表1 檢測結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.2.3 評價指標 評價指標包括敏感性、特異性、符合率和Kappa值。使用表1數(shù)據(jù),計算方法如下。

敏感性Se=a/(a+c);

特異性Sp=d/(b+d);

符合率=(a+d)/n;

Kappa值=[n(a+d)-(r1c1+r2c2)]/[n2-(r1c1+r2c2)][8]。

其中,符合率是指兩種檢測方法結果相一致的總和占所有檢測樣品的百分比。Kappa值用于描述兩種檢測結果的一致性。一般認為,Kappa值≥0.75為一致性極好,0.4～0.75為中、高度一致,≤0.4認為一致性差[9]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 原始數(shù)據(jù)用Excel整理,使用Epitool在線工具計算各試劑盒的符合率、敏感性和特異性及95%置信區(qū)間。用SPSS 25.0軟件計算Kappa值,對配對二分類數(shù)據(jù)進行McNemar卡方檢驗[10-11],比較兩樣本差異。其中,P<0.05表示有顯著性差異,P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 敏感性和特異性

結果顯示(表2),不同廠家的RBT試劑盒敏感性存在較大差異,其中B廠家的敏感性最低,為70%(95%CI,56.79%～81.15%),E廠家最高,為91.67%(95%CI,81.61%～97.24%)。各廠家試劑盒特異性差異較小,在94%～100%之間。其中A和D廠家的特異性為100%(95%CI,92.89%～100%)。

表2 5種試劑盒的敏感性和特異性

2.2 符合率和Kappa值

從符合率來看(表3),5種試劑盒的符合率均在80%以上,其中C、D、E廠家的符合率超過90%,Kappa值在0.8以上,說明上述3種試劑盒與cELISA結果一致性較高。其中,C、E廠家的結果與cELISA結果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 5種試劑盒的符合率、Kappa值和McNemar卡方檢驗情況

3 討論

與既往研究不同[12-14],本研究著重對市面上常用的同一方法的5種試劑盒開展評價。結果顯示,不同廠家的敏感性差異較大,E廠家試劑的敏感性最高,為91.67%。A、D廠家試劑特異性最高,均為100%。從符合率結果來看,C、D、E廠家試劑的符合率接近,Kappa值均在0.8以上,只有C、E廠家與cElisa的結果無統(tǒng)計學差異。在評估布病流行狀態(tài)時,我國多采用RBT初篩,再使用試管凝集或cELISA確診的垂直策略,將陽性動物在總體中的占比作為當?shù)夭疾×餍新蔥15-16],但即使是垂直策略,檢測的敏感性和特異性仍不足1,對于估計疫病真實流行率有較大影響。尤其在真實流行率較低時,其檢測得到的表觀流行率和真實流行率差異較大。因此,各地區(qū)在使用RBT方法開展檢測工作之前,有必要使用本研究篩選的方法,對所用試劑盒開展評估,了解其試驗特性。

隨著《畜間布病防控五年行動方案(2022-2026年)》和《全國畜間人獸共患病防治規(guī)劃(2022-2030年)》等文件和政策的落實,各地大力推動牛、羊布魯氏菌病的凈化、無疫小區(qū)和無疫區(qū)的建設。對于開展凈化的養(yǎng)殖場,布魯氏菌病流行率必然有從高到低的過程。在凈化階段,即使使用同一種試劑,即敏感性和特異性保持不變,但因流行率逐漸降低,其陽性預測值也會逐漸降低,陰性預測值逐漸升高,導致誤殺率升高。因此,在凈化初期,場內(nèi)流行率較高時,可只選擇敏感性較高的RBT試劑進行初篩,發(fā)現(xiàn)更多陽性動物,迅速降低流行率;在凈化后期,場內(nèi)流行率很低,可采用特異性較高的試劑或可提升特異性的垂直策略開展檢測,提高陽性預測值,降低誤殺率;或在淘汰貴重/珍稀動物時,應采用特異性較高的方法,防止誤判,減少損失。

開展布魯氏菌病凈化時,按照本研究建立的方法,明確檢測試劑的敏感性和特異性,還可粗略估計凈化周期。假設養(yǎng)殖場凈化初期,布魯氏菌感染率為15%,選用的RBT試劑敏感性和特異性分別為85%和95%,檢測發(fā)現(xiàn)陽性動物及時淘汰,則在檢測3次后,雖表觀流行率為5.35%,但真實流行率為0.44%,即可轉段進入控制階段。

本研究有局限性,一是每種試劑只做了一個批次,不能評價同一公司同種試劑不同批次間的穩(wěn)定性;二是選用的cELISA檢測試劑敏感性和特異性不足100%,盡管不影響主要結論,但會有測量偏倚。