趙娟 左文杰 張殿朋 秦文韜 盧彩鴿

摘要

為獲得對(duì)番茄灰霉病具有良好防效的生防芽胞桿菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)、雙層平板以及生防相關(guān)特性檢測(cè)等方法篩選高活性拮抗菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及多基因測(cè)序進(jìn)行菌株種類鑒定，通過(guò)離體果實(shí)和盆栽試驗(yàn)明確供試菌株的防病促生效果。結(jié)果表明，芽胞桿菌JZB301對(duì)番茄灰霉病菌等10余種植物病原真菌和細(xì)菌具有廣譜抑菌活性;該菌株具有合成蛋白酶、纖維素酶、脂肽類物質(zhì)，分泌鐵載體、生長(zhǎng)激素及溶磷等特性，經(jīng)鑒定其為解淀粉芽胞桿菌Bacillus?amyloliquefaciens;菌株JZB301無(wú)菌發(fā)酵濾液50倍液噴施處理，對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防效為95.0%，發(fā)酵液10倍稀釋液灌根，番茄株高、鮮重分別較對(duì)照增加25.7%和28.4%。相關(guān)結(jié)果為利用解淀粉芽胞桿菌JZB301進(jìn)行番茄灰霉病生物防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞

番茄灰霉病;?解淀粉芽胞桿菌;?抑菌活性;?功能基因;?生物防治

中圖分類號(hào)：

S?476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023160

Identification?of?Bacillus?strain?JZB301?and?its?biological?control?effect?on?tomato?grey?mould

ZHAO?Juan1，2，?ZUO?Wenjie1，3，?ZHANG?Dianpeng1，2，?QIN?Wentao1，2，?LU?Caige1，2*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，?Beijing?Academy?of?Agriculture?and?Forestry?Sciences，?Beijing?100097，?China;?2.?Key

Laboratory?of?EnvironmentFriendly?Management?on?Fruit?and?Vegetable?Pests?in?North?China?（Coconstruction?by

Ministry?and?Province），?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Beijing?100097，?China;?3.?College?of?Bioscience，

Resources?and?Environment，?Beijing?University?of?Agriculture，?Beijing?102206，?China）

Abstract

To?obtain?a?Bacillus?strain?with?significant?control?effect?on?tomato?grey?mould，?antagonistic?bacteria?were?screened?by?confrontation?culture?and?twolayer?plate?methods，?along?with?the?detection?of?characteristics?related?to?biocontrol.?Its?taxonomic?status?was?identified?based?on?morphological?features，?physiologicalbiochemical?characteristics，?and?multiple?gene?sequences?analyses.?The?diseaseprevention?and?growth?promotion?effects?of?the?obtained?strain?were?evaluated?by?applying?the?fermentation?filtrate?of?the?strain?to?tomato?fruits?and?potted?tomato?seedlings，?respectively.?The?results?showed?that?Bacillus?strain?JZB301?exhibited?an?obvious?inhibitory?effect?on?Botrytis?cinerea，?as?well?as?broadspectrum?antifungal?and?antibacterial?activities?against?more?than?ten?plant?pathogens.?The?strain?was?identified?as?Bacillus?amyloliquefaciens，?which?have?features?of?synthesizing?protease，?cellulase?and?lipopeptide

，?secreting?siderophore，?indoleacetic?acid?and?solubilizing?phosphate.?The?50fold?sterile?fermention?filtrate?of?JZB301?displayed?an?obvious?biocontrol?effect?on?tomato?fruit?grey?mould，?with?a?95.0%?reduction?in?disease?incidence?compared?to?the?control.?In?addition，?the?plant?height?and?fresh?weight?increased?by?25.7%?and?28.4%，?respectively，?after?rootirrigation?with?a?10fold?dilution?of?the?fermentation.?The?study?provides?a?theoretical?foundation?for?considering?B.amyloliquefaciens?strain?JZB301?as?a?potential?biocontrol?strain?against?tomato?grey?mould.

Key?words

tomato?grey?mould;?Bacillus?amyloliquefaciens;?antagonistic?activity;?functional?genes;?biological?control

由灰葡萄孢Botrytis?cinerea侵染引起的灰霉病是保護(hù)地番茄栽培中常見(jiàn)真菌病害?；移咸焰呖汕秩痉训那o、葉、花、果實(shí)，常導(dǎo)致大面積減產(chǎn)從而給種植戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前化學(xué)防治仍然是生產(chǎn)上防控番茄灰霉病的主要措施，但容易引起病原菌抗藥性、生態(tài)環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。生物防治因具有不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)環(huán)境安全友好等特點(diǎn)，已逐漸成為番茄灰霉病等果蔬病害綠色防控的有效替代措施。目前已有木霉［2］、鏈霉菌［3］等生防微生物用于抑制灰葡萄孢的報(bào)道。芽胞桿菌可以產(chǎn)生抗高溫、抗紫外線輻射的芽胞，具有抗逆性強(qiáng)、抑菌譜廣、繁殖快、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要生防菌類群［4］。朱明明等［5］的研究表明，分離自馬鈴薯健康植株根際土壤的貝萊斯芽胞桿菌Bacillus?velezensis對(duì)馬鈴薯黑痣病具有明顯抑制效果。方佩等［6］篩選出一株對(duì)黃瓜灰霉病具有良好盆栽防效的海洋芽胞桿菌Jeotgalibacillus?marinus，該菌株發(fā)酵上清液能夠抑制灰霉病菌孢子萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲畸形以及原生質(zhì)體外滲。微生物生理生化特性中與植物健康生長(zhǎng)相關(guān)的一些特性是評(píng)價(jià)其生防潛力的關(guān)鍵方面［78］。芽胞桿菌產(chǎn)生的一些胞外酶和抗菌蛋白類活性物質(zhì)，在果蔬作物真菌病害生物防治方面具有巨大應(yīng)用價(jià)值。潘虹余等［9］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens?B15菌株產(chǎn)生的伊枯草菌素和芬芥素對(duì)葡萄灰霉病菌具有良好抑制效果。篩選具有優(yōu)良生防活性的功能菌株是植物病害生物防治的前提和關(guān)鍵。作者前期從海南紅樹林特殊生境分離篩選到多株對(duì)番茄灰霉病菌具有拮抗作用的芽胞桿菌，本研究對(duì)其中拮抗效果明顯且具有廣譜抑菌活性的JZB301菌株進(jìn)行生防相關(guān)特性檢測(cè)、種類鑒定以及防病促生效果評(píng)價(jià)，以期為番茄等果蔬作物灰霉病生物防治提供生防菌種資源和理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試病原菌

植物病原真菌包括番茄灰霉病菌Botrytis?cinerea、番茄葉斑病菌Alternaria?alternata、西瓜枯萎病菌Fusarium?oxysporum?f.sp.?niveum、黃瓜枯萎病菌F.oxysporum?f.sp.?cucumerinum、芹菜菌核病菌Sclerotinia?sclerotiorum、小麥紋枯病菌Rhizoctonia?cerealis、百合根腐病菌F.oxysporum?f.sp.?lilii、甘藍(lán)枯萎病菌F.oxysporum?f.sp.?conglutinans、葡萄白腐病菌Coniella?diplodiella、葡萄潰瘍病菌Botryosphaeria?dothidea、韭菜灰霉病菌Botrytis?squamosa、葡萄蔓枯病菌Diaporthe?eres、棉鈴疫病菌Phytophthora?boehmeriae等13種。

植物病原細(xì)菌包括黃瓜角斑病菌Pseudomonas?syringae、平菇褐斑病菌Pseudomonas?tolaasii、大白菜黑腐病菌Xanthomonas?campestris?pv.?campestris、茄子青枯病菌Ralstonia?solanacearum、辣椒瘡痂病菌Xanthomonas?campestris?pv.?vesicatoria、芒果細(xì)菌性角斑病菌Xanthomonas?campestris?pv.?mangiferaeindicae等6種。

上述供試病原菌由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所、生物技術(shù)研究所和河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

番茄品種為‘硬粉8號(hào)，購(gòu)自京研益農(nóng)北京種業(yè)科技有限公司。

1.1.2?供試培養(yǎng)基及試劑

細(xì)菌分離培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基、KB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基，病原真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基［10］。菌株蛋白酶、纖維素酶分泌活性檢測(cè)采用蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基［11］、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基［12］，溶磷活性檢測(cè)采用無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基［13］，產(chǎn)鐵載體活性檢測(cè)采用CAS培養(yǎng)基［14］，IAA活性檢測(cè)采用DF培養(yǎng)基及Salkowski比色液［15］。

1.2?方法

1.2.1?土壤芽胞桿菌的分離純化

采用稀釋平板分離法［10］對(duì)采集自海南紅樹林土壤中的芽胞桿菌進(jìn)行分離。取風(fēng)干后的供試土壤10?g放入含90?mL無(wú)菌水的三角瓶中，混合均勻后將稀釋液在85℃的水浴鍋中水浴30?min。用無(wú)菌水稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀釋液，吸取100?μL各稀釋液均勻涂布于NA平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24?h，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落劃線純化，純化后的菌株保存于4℃冰箱備用。

1.2.2?拮抗菌株抑菌譜測(cè)定

采用瓊脂塊法從分離獲得的芽胞桿菌中篩選對(duì)番茄灰霉病菌具有拮抗活性的菌株。選取拮抗效果顯著的菌株采用對(duì)峙培養(yǎng)法［16］測(cè)定其對(duì)番茄葉斑病菌等13種植物病原真菌的抑制活性；采用雙層平板法［17］測(cè)定其對(duì)黃瓜角斑病菌等6種植物病原細(xì)菌的抑制活性。將直徑6?mm的靶標(biāo)病原真菌菌餅接種在PDA培養(yǎng)基中央，待測(cè)菌株劃線接種在病原菌兩側(cè)距離中心位置2?cm處，28℃培養(yǎng)4?d后測(cè)量供試菌株對(duì)靶標(biāo)病原的抑菌帶寬度，統(tǒng)計(jì)其對(duì)病原真菌的抑菌譜。將待測(cè)菌株點(diǎn)接于KB平板上28℃培養(yǎng)40?h，用3?mL氯仿熏蒸殺死細(xì)菌菌體，靜置10～12?h待氯仿?lián)]發(fā)完全后，將100?μL靶標(biāo)病原細(xì)菌菌懸液（108?cfu/mL）與3?mL融化并冷卻至50℃的水瓊脂迅速混勻，倒入上述平板鋪成均勻薄層，28℃培養(yǎng)36?h后觀察待測(cè)菌株代謝產(chǎn)物對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3?拮抗菌株形態(tài)觀察和生理生化特性測(cè)定

將篩選獲得的芽胞桿菌菌株接種LB平板并于28℃恒溫培養(yǎng)48?h，觀察菌落形狀、顏色、質(zhì)地等特征，進(jìn)行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，包括碳源利用、甲基紅和VP試驗(yàn)、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解和H2S產(chǎn)生等［18］。

1.2.4?拮抗菌株多基因測(cè)序分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

挑取純化后的芽胞桿菌單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180?r/min振蕩培養(yǎng)24?h后收集菌體，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（索萊寶）提取菌株基因組DNA。采用引物對(duì)27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）/1492R（5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′）擴(kuò)增菌株16S?rDNA基因［19］，通過(guò)序列比對(duì)初步確定細(xì)菌屬級(jí)水平的分類地位。采用引物對(duì)gyrAF（5′CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT3′）/gyrAR（5′CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT3′）［20］和rpoBF（5′AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC3′）/rpoBR（5′AAGAACCGTAACCGGCAACTT3′）［21］分別對(duì)該菌株看家基因gyrA和rpoB進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而明確待測(cè)菌株種級(jí)分類地位。

PCR反應(yīng)體系總體積25?μL，包含2×Taq?PCR?Master?Mix?12.5?μL，ddH2O?10.5?μL，正、反向引物各0.5?μL和模板DNA?1?μL。16S?rDNA基因PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4?min;94℃變性30?s，50℃退火1?min，72℃延伸1?min30?s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。gyrA基因PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4?min;95℃變性10?s，62℃退火1?min，72℃延伸2?min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8?min。rpoB基因PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2?min;94℃變性30?s，50℃退火45?s，68℃延伸40?s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。所獲序列通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST同源性搜索，并下載相關(guān)菌株對(duì)應(yīng)基因序列。Clustal?X?軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，將菌株16S?rDNA、gyrA和rpoB基因采用Bioedit軟件拼接后，采用PAUP?4.0b10軟件中的最大簡(jiǎn)約法（maximum?parsimony，MP）進(jìn)行聚類分析確定待鑒定菌株的種類歸屬。

1.2.5?拮抗菌株生防相關(guān)代謝產(chǎn)物的測(cè)定

將待測(cè)菌株分別接種于蛋白酶、纖維素酶、鐵載體以及無(wú)機(jī)磷檢測(cè)培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3次重復(fù)，28℃條件下培養(yǎng)3?d后觀察菌落周圍是否有透明圈及其直徑大小，評(píng)價(jià)菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、鐵載體以及溶磷活性。配制不同濃度梯度的吲哚乙酸（IAA）標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)其在530?nm處吸光度并繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將菌株接種于含500?μg/mL色氨酸或不含色氨酸的DF基本培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48?h。將獲得的培養(yǎng)液1?2000?r/min離心10?min，取2?mL上清液于試管中加入Salkowski?比色液，避光放置30?min后根據(jù)顏色變化及吸光度，檢測(cè)菌株是否具有產(chǎn)IAA活性及IAA含量［15］。

1.2.6?拮抗菌株生防相關(guān)功能基因擴(kuò)增

利用表1所示引物序列及條件［2223］對(duì)供試菌株進(jìn)行脂肽類抗生素合成酶相關(guān)基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)，包括抗霉枯草菌素合成相關(guān)基因（mycB）、豐原素合成相關(guān)基因（fenB）、伊枯草菌素A合成相關(guān)基因（ituA）、表面活性素合成調(diào)控基因（sfp）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物及其片段大小進(jìn)行檢測(cè)，并委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，所獲序列通過(guò)NCBI的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)和搜索。

1.2.7?拮抗菌株對(duì)番茄防病促生效果評(píng)價(jià)

拮抗菌株發(fā)酵液的制備：將拮抗菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180?r/min振蕩培養(yǎng)12?h后，按1%接種量轉(zhuǎn)接于裝有100?mL?LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)48?h。獲得的發(fā)酵液12?000?r/min離心10?min，上清過(guò)0.22?μm濾膜獲得菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液。

離體防病試驗(yàn)：選取大小且成熟度一致的健康番茄果實(shí)，2%（m/V）次氯酸鈉消毒3?min，無(wú)菌水沖洗干凈。用接種針在番茄果實(shí)腰部等距離刺傷，傷口晾干后接種10?μL上述制備好的菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液。待無(wú)菌發(fā)酵濾液完全吸收后，接種10?μL番茄灰霉病菌孢子懸浮液（106個(gè)/mL）于相同部位。以無(wú)菌水和LB液體培養(yǎng)基代替細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵濾液作為對(duì)照，50%啶酰菌胺水分散粒劑1?000倍液為化學(xué)藥劑對(duì)照，10%多抗霉素可濕性粉劑1?000倍液為生物農(nóng)藥對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，25℃保濕培養(yǎng)3?d。根據(jù)參考文獻(xiàn)描述［24］劃分病害嚴(yán)重度等級(jí)，統(tǒng)計(jì)不同處理病情指數(shù)并計(jì)算防治效果。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病果數(shù)×對(duì)應(yīng)病害嚴(yán)重度等級(jí)）/（調(diào)查總果數(shù)×病害最高嚴(yán)重度等級(jí)）×100，防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

盆栽促生試驗(yàn)：將番茄種子清水沖洗干凈室溫浸泡24?h后，放置在鋪有2層無(wú)菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫培養(yǎng)箱孵育催芽至種子露白進(jìn)行播種，待番茄幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期將幼苗轉(zhuǎn)移至盆中。移栽10?d后，采用上述菌株發(fā)酵液（108?cfu/mL）?10倍稀釋液進(jìn)行灌根處理，每株幼苗灌根10?mL，以LB培養(yǎng)液灌根作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5盆，每盆2株苗。移栽后40?d時(shí)隨機(jī)挑選15株苗，取樣調(diào)查番茄株高、鮮重、根長(zhǎng)及須根數(shù)等生物學(xué)指標(biāo)。

1.2.8?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel?2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS?19.0軟件中的最小顯著差異法（least?significant?difference，?LSD）進(jìn)行組間差異顯著性分析，t檢驗(yàn)（Students?ttest）進(jìn)行兩組間差異顯著性分析（P<0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?拮抗芽胞桿菌篩選

從海南紅樹林土壤中分離純化得到34株芽胞桿菌，通過(guò)瓊脂塊法篩選得到5株對(duì)番茄灰霉病菌抑菌效果顯著且活性穩(wěn)定的菌株，其中菌株JZB301的拮抗效果最佳。對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)JZB301對(duì)番茄灰霉病菌、番茄葉斑病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、芹菜菌核病菌、小麥紋枯病菌、百合根腐病菌、甘藍(lán)枯萎病菌、葡萄白腐病菌、葡萄潰瘍病菌、韭菜灰霉病菌、葡萄蔓枯病菌、棉鈴疫病菌等病原真菌具有明顯的抑制作用，抑菌帶寬度在9.5～15.0?mm，其中對(duì)番茄灰霉病菌抑菌帶寬度為15.0?mm，對(duì)番茄葉斑病菌抑菌帶寬度為14.0?mm（表2，圖1）。通過(guò)雙層平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)供試菌株對(duì)黃瓜角斑病菌、平菇褐斑病菌、大白菜黑腐病菌、茄子青枯病菌、辣椒瘡痂病菌、芒果角斑病菌等具有抑制作用，抑菌圈直徑為18.0～50.0?mm，其中對(duì)大白菜黑腐病菌和芒果角斑病菌抑菌圈直徑分別為50.0?mm和47.0?mm（表2，圖2）。

2.2?拮抗芽胞桿菌形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

供試菌株在NA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48?h后，菌落乳白色、圓形，不透明，表面干燥有皺褶，邊緣不整齊（圖3a和3b）。菌體呈桿狀，大?。?.5～4.0）?μm×（0.4～0.6）?μm，單個(gè)或成對(duì)，革蘭氏染色呈陽(yáng)性（圖3c）。對(duì)菌株生理生化特性測(cè)定結(jié)果表明，該菌株能分解利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖和檸檬酸鹽，明膠液化、淀粉水解、VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸還原反應(yīng)和硫化氫產(chǎn)生均呈陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陰性（表3），根據(jù)菌株形態(tài)和生理生化特性，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步將菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillus?amyloliquefaciens。

2.3?拮抗芽胞桿菌分子生物學(xué)鑒定

以菌株JZB301的基因組DNA為模板，擴(kuò)增其16S?rDNA、gyrA和rpoB基因片段，獲得長(zhǎng)度分別為1?420，1?010，1?050?bp的序列。通過(guò)對(duì)基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株JZB301的16S?rDNA、gyrA、rpoB基因與解淀粉芽胞桿菌Bacillus?amyloliquefaciens和貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis對(duì)應(yīng)序列同源性均為100%。利用PAUP?4.0b10軟件，以最大簡(jiǎn)約法（maximum?parsimony，MP）構(gòu)建基于菌株16S?rDNA、gyrA、rpoB基因的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，供試菌株JZB301與B.amyloliquefaciens聚于一起，自展值為90%（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化特性鑒定結(jié)果，確定菌株JZB301為解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。

2.4?拮抗芽胞桿菌生防相關(guān)特性檢測(cè)

平板產(chǎn)胞外酶和生物活性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明，菌株JZB301在產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上能形成直徑為（41.3±0.6）?mm的透明圈;在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生明顯的水解圈，其直徑為（32.7±1.5）?mm;同時(shí)菌株JZB301在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上能產(chǎn)生一定的水解圈，說(shuō)明其具有溶磷活性;在產(chǎn)鐵載體活性檢測(cè)培養(yǎng)基上，該菌株能夠快速生長(zhǎng)且產(chǎn)生淡橘色的水解圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)鐵載體活性（圖5）。產(chǎn)生長(zhǎng)激素檢測(cè)結(jié)果表明，菌株JZB301在含有500?μg/mL色氨酸的DF培養(yǎng)基中培養(yǎng)96?h時(shí)IAA含量為5.86?μg/mL，在不含有色氨酸的DF培養(yǎng)基中IAA產(chǎn)量為1.48?μg/mL。

2.5?脂肽類抗生素合成相關(guān)功能基因檢測(cè)

以菌株JZB301基因組DNA為模板，分別對(duì)其抗霉枯草菌素合成相關(guān)基因（mycB）、豐原素合成相關(guān)基因（fenB）、伊枯草菌素合成相關(guān)基因（ituA）和表面活性素合成調(diào)控基因（sfp）進(jìn)行PCR?擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均能獲得對(duì)應(yīng)目標(biāo)片段（圖6）。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST分析，菌株JZB?301的mycB基因與B.amyloliquefaciens?JT84的mycB基因（KX351426）相似性為95%;fenB基因與B.amyloliquefaciens菌株YNM3（KP967585）和6256（KP967586）中的fengycin?synthetase?B基因（fenB）相似性為100%和99%;ituA基因與B.amyloliquefaciens?MH71菌株的ituA（KJ452560）相似性為98%;sfp基因與B.amyloliquefaciens?H2O1菌株surfactin基因（MK570509）相似性為98%。推測(cè)菌株JZB301基因組中可能存在抗霉枯草菌素、豐原素、伊枯草菌素、表面活性素等脂肽類抗生素合成或調(diào)控相關(guān)基因，說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)生上述脂肽抗生素的潛力。

2.6?拮抗芽胞桿菌對(duì)番茄的防病促生效果

在離體條件下測(cè)定菌株JZB301發(fā)酵液對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防控效果，結(jié)果表明，菌株發(fā)酵液50倍稀釋液處理能夠明顯降低番茄果實(shí)灰霉病嚴(yán)重程度，防控效果達(dá)95.0%，優(yōu)于50%啶酰菌胺水分散粒劑1?000倍液和10%多抗霉素可濕性粉劑1?000倍液防控效果（表4，圖7）。采用菌株JZB301發(fā)酵液10倍稀釋液進(jìn)行灌根處理，番茄幼苗株高、鮮重、根長(zhǎng)和須根數(shù)分別較對(duì)照有所增加，其中株高和鮮重分別較對(duì)照增加了25.7%和28.4%，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。菌株發(fā)酵液10倍稀釋液處理，番茄幼苗平均根長(zhǎng)由11.0?mm增加到12.7?mm，平均須根數(shù)由47條增加到60條。說(shuō)明供試菌株JZB301對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)具有良好促進(jìn)作用（圖8）。

3?結(jié)論與討論

本研究從分離自海南紅樹林特殊生境土壤的芽胞桿菌中，篩選到一株對(duì)番茄灰霉病菌具有顯著拮抗活性的芽胞桿菌JZB301，該菌株對(duì)多種植物病原真菌和病原細(xì)菌具有廣譜抑菌活性，能夠產(chǎn)生胞外酶和生防相關(guān)活性物質(zhì)，基因組具有豐原素、表面活性素等脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)的編碼基因序列，對(duì)番茄果實(shí)灰霉病具有明顯防控效果且能促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)。芽胞桿菌在生物防治、食品發(fā)酵、藥物研發(fā)和工業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用［25］，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外利用芽胞桿菌進(jìn)行植物病害生物防治的報(bào)道越來(lái)越多［2627］。本研究中解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens?JZB301對(duì)番茄灰霉病菌等13種植物病原真菌和大白菜黑腐病菌等6種植物病原細(xì)菌表現(xiàn)出明顯拮抗作用，同時(shí)對(duì)番茄果實(shí)灰霉病表現(xiàn)出良好防效，相關(guān)結(jié)果為解淀粉芽胞桿菌的生防功能研究以及番茄灰霉病生物防治提供了菌株資源。

芽胞桿菌的生防機(jī)制主要包括分泌胞外酶、抗菌蛋白等活性物質(zhì)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境資源和營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)植物抗病性等［9］。張霞等［28］發(fā)現(xiàn)暹羅芽胞桿菌?B.?siamensis?ZHX10菌懸液、揮發(fā)物以及發(fā)酵液均能有效抑制白絹病菌菌絲生長(zhǎng)，該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體能夠有效降低白絹病發(fā)病率。張瓊等［29］篩選的貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis?SZAD1能產(chǎn)生纖維素酶和幾丁質(zhì)酶，對(duì)棉花黃萎病防效良好。荊卓瓊等［30］篩選出一株具有產(chǎn)蛋白酶、果膠酶、β1，3葡聚糖酶和淀粉酶等活性的解淀粉芽胞桿菌HZ63。王海霞等［7］發(fā)現(xiàn)分離自燕麥的解淀粉芽胞桿菌YNJ3能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)顯著抑制燕麥病原菌生長(zhǎng);并且通過(guò)解磷、解鉀、產(chǎn)植物生長(zhǎng)激素等方式促進(jìn)燕麥生長(zhǎng)。本研究通過(guò)生防相關(guān)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株JZB301具有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶等胞外酶活性，以及產(chǎn)鐵載體、生長(zhǎng)激素和溶磷等促生相關(guān)活性。功能基因擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果表明，菌株JZB301基因組中含有抗霉枯草菌素、豐原素、表面活性素、伊枯草菌素等脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)基因編碼序列。已有研究顯示，mycB、ituA?和sfp基因所編碼的蛋白在合成枯草菌素和表面活性素的過(guò)程中發(fā)揮重要功能，fenB基因與脂肽類物質(zhì)豐原素合成密切相關(guān)［3132］。這些生防相關(guān)特性可能與菌株JZB301對(duì)番茄的抑菌防病和促生活性具有密切關(guān)系。

解淀粉芽胞桿菌和貝萊斯芽胞桿菌具有很高的同源性，通過(guò)表型特征和生理生化特征難以區(qū)分。雖然16S?rDNA基因序列廣泛應(yīng)用于細(xì)菌種類鑒定，但親緣關(guān)系很近的類群常由于序列間相似度太高而無(wú)法區(qū)分到種。本研究通過(guò)BLAST同源性搜索和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)JZB301菌株16S?rDNA與解淀粉芽胞桿菌和貝萊斯芽胞桿菌相應(yīng)序列相似性均在100%，表明16S?rDNA基因序列不能有效區(qū)分二者。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)以編碼蛋白的基因作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標(biāo)記可以彌補(bǔ)16S?rDNA基因的不足，如gyr基因［20］、rpo基因等［21］，本研究通過(guò)擴(kuò)增JZB301菌株的gyrA和rpoB基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，供試菌株與解淀粉芽胞桿菌的相似性為99%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚在同一分支上，從而將其準(zhǔn)確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。

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