李生慧 于鈺 張明月

[摘要]目的：研究含有復(fù)合多肽的精華液對于衰老皮膚的改善效果。方法：通過體外人成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblast， HFS）細(xì)胞增殖實驗、HFS中Ⅰ型膠原蛋白含量測定實驗來觀察其抗衰效果。人體評價采用隨機雙盲、自身左右、陰性對照試驗。選取30名受試者，每日早晚分別使用試驗樣品和對照樣品，分別在基線（D0）、第14天（D14）、第28天（D28）進行皮膚彈性值[皮膚粘彈性值（VE值）、皮膚楊氏彈性模量（E值）和皮膚回縮時間（R值）]測量、VISIA面部拍照和皮膚超聲檢測。第28天（D28）進行受試者主觀評價。結(jié)果：體外實驗結(jié)果顯示試驗樣品具有顯著促進HSF活力和Ⅰ型膠原蛋白生成的作用。人體評價結(jié)果顯示，在使用試驗樣品和對照樣品第28天后，試驗側(cè)皮膚彈性值與D0相比有明顯改善（P＜0.001）；試驗側(cè)皮膚的毛孔計數(shù)值在D14、D28均低于基線值（P＜0.001），而對照側(cè)不同時間點皮膚彈性值和毛孔計數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。皮膚超聲觀察結(jié)果顯示，與D0相比，D28試驗側(cè)皮膚真皮層內(nèi)高回聲區(qū)域顯著增加，真皮層密度提升，有效率為90%，優(yōu)于對照側(cè)。受試者主觀評價顯示，使用試驗樣品和對照樣品28 d（D28）后，兩側(cè)皮膚水潤度、細(xì)紋均有改善，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），試驗側(cè)皮膚緊實度、彈性改善程度明顯優(yōu)于對照側(cè)（P＜0.05）。結(jié)論：試驗樣品能顯著提升HFS活力，促進Ⅰ型膠原生成，顯著改善面部皮膚彈性值，顯著減小面部毛孔，增加真皮層密度，有助于改善皮膚衰老。

[關(guān)鍵詞]復(fù)合多肽；衰老皮膚；成纖維細(xì)胞；皮膚彈性；皮膚超聲

[中圖分類號]TQ258? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）04-0065-05

Study on the Effect of Serum Containing Complex Peptides on Improving Skin Aging

LI Shenghui， YU Yu， ZHANG Mingyue

（Qingdao Youdo Bioengineering Co.，Ltd.， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Objective? To observe the effect of serum containing complex peptides on aging skin. Methods? In vitro experiments， human skin fibroblast （HSF） cell proliferation experiment and determination of type Ⅰ collagen content in HSF.In humans， a randomized， double-blind， self-controlled trial with negative control was performed. Thirty subjects were selected， and the test product which contains complex peptides and control product without complex peptides were used in the morning and evening. Skin elasticity measurements， VISIA photography and skin ultrasound measurements were performed at baseline （D0）， day 14 （D14） and day 28 （D28）.Subject subjective evaluation was performed on day 28 （D28）. Results? In vitro experiment showed that the test sample could significantly promote the activity of human skin fibroblast （HSF） and the generation of type Ⅰ collagen. The results of human evaluation showed that the skin elasticity of the test side was significantly improved compared with that of D0 （P＜0.001） after 28 days of using the test sample and the matching product. Poreometer values of skin on the test side were lower than baseline values in D14 and D28 （P＜0.001）， but there was no significant difference in the properties and poreometer values at different time points in the control group （P＞0.05）. According to the skin ultrasound observation， after 28 days， compared with the baseline （D0）， the high-echo area in the dermis of the skin on test side was significantly increased， the dermis density was increased， and the effective case rate was 90%， which was significantly better than the control side . Subject subjective evaluation showed that after 28 days ， skin moisture and small wrinkles on both sides were improved compared with baseline value （D0） and without significant difference （P＞0.05）， skin firmness and elasticity on the test side were significantly better than those on the control side （P＜0.05）. Conclusion? The test samples can significantly enhance the HFS activity， promote the generation of type I collagen， significantly improve the elasticity of facial skin， significantly reduce facial pores， increase dermal density， and help to improve skin aging.

Key words： complex polypeptide; aging skin; fibroblast; skin elasticity; skin ultrasound

與年輕態(tài)皮膚相比，衰老皮膚更加干燥、黯淡，且多表現(xiàn)出一定程度的松弛皺紋及局部組織下垂[1]。研究數(shù)據(jù)顯示，中國北方40～50歲女性面部皮膚彈性值隨年齡增加呈下降趨勢，50歲后面部皮膚彈性則呈現(xiàn)迅速下降趨勢[2]。當(dāng)皮膚老化時，真皮層成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)目減少、增殖能力減弱、代謝功能下降，彈性蛋白及膠原蛋白分泌量減少。因此，提升成纖維細(xì)胞活力，促進膠原蛋白合成可以提高皮膚的彈性和緊致度。多肽具有生物相容性好、水溶性好、分子量低等優(yōu)點，同時還具有保護、修復(fù)受損細(xì)胞和促進細(xì)胞生長的功能[3]。本研究擬觀察一種含有棕櫚酰三肽-5、乙?；?8、三肽-1、乙?；碾?9等復(fù)合多肽精華液的面部抗衰作用，并用不含有復(fù)合多肽的安慰劑作為陰性對照，現(xiàn)報道如下。

1? 資料和方法

1.1 樣品：試驗樣品為多肽精華液[青島優(yōu)度生物工程有限公司自制，產(chǎn)品批號：D2211116，含有水（99.38%），透明質(zhì)酸鈉（0.1%），乙?；?8（0.0015%），棕櫚酰三肽-5（0.015%），三肽-1（0.0012%），六肽-9（＜0.0012%），乙?；碾?9（＜0.0012%），防腐劑（0.5%）]。對照樣品為不含多肽的安慰劑[青島優(yōu)度生物工程有限公司自制，產(chǎn)品批號：YFD221102，含有水（99.4%），透明質(zhì)酸鈉（0.1%），防腐劑（0.5%）]。

1.2 試劑與儀器：16000型胎牛血清，Gibco公司；C11995500BT型高糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；15140122型青霉素-鏈霉素溶液，Gibco公司；25200-056型胰蛋白酶-EDTA溶液，Gibco公司；ml057630型人Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）試劑盒試劑盒（96T），上海酶聯(lián)公司；CM088-5HP型Recombinant TGF beta 1，Chamot公司。VISIA CR面部圖像分析系統(tǒng)，美國Canfield公司；皮膚彈性、超聲測試儀Dermalab Series Skin Lab Combo，丹麥Cortex公司。

1.3 體外實驗方法

1.3.1 CKK-8法體外人皮膚成纖維細(xì)胞增殖實驗：采用實驗用人成纖維細(xì)胞，用CCK-8檢測細(xì)胞毒性方法測試受試物的細(xì)胞毒性。用完全培養(yǎng)基將樣品稀釋為5%、3%、1%、0.1%、0.01%的濃度（%為體積分?jǐn)?shù)），加入至融合度為20%的細(xì)胞中，培養(yǎng)24～48 h后，使用CCK-8試劑檢測細(xì)胞存活率。

細(xì)胞活力（%）=[A（樣品）-A（空白）]/[A（0）-A（空白）]×100%

式中：A（樣品）為具有細(xì)胞、CCK-8溶液和樣品溶液的孔的OD值；A（0）為具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有樣品溶液的孔的OD值；A（空白）為沒有細(xì)胞的孔的OD值。

1.3.2 ELISA法檢測Ⅰ型膠原蛋白含量：將來自冷凍保存的細(xì)胞穩(wěn)定傳代兩次后接種于96孔板，于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄掉96孔板中的培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果選擇1%、0.1%、0.01%濃度的測試樣品與100μg/ml TGF-β1作為陽性對照進行Ⅰ型膠原蛋白含量測定，空白對照組為完全培養(yǎng)基組。每組設(shè)置3個平行組，開展給藥操作。給藥完畢后將96孔板放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)（24±2）h孵育結(jié)束后，按照人Ⅰ型膠原酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法進行檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各樣本孔的吸光值[4]。以吸光度OD值為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)（Y），做得相應(yīng)的曲線，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。最終取各組3個復(fù)孔的平均值作為最終的Ⅰ型膠原蛋白結(jié)果。Ⅰ型膠原蛋白上調(diào)率計算公式：上調(diào)率（%）=（T/C-1）×100%。式中：T為受試物Ⅰ型膠原蛋白含量平均值；C為空白對照Ⅰ型膠原蛋白含量平均值。

1.4 人體評價方法

1.4.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)《人體皮膚衰老評價標(biāo)準(zhǔn)》（TB/ZGKSL 001-2022）皮膚衰老量表，入選者皮膚機械力學(xué)狀態(tài)符合中度至重度標(biāo)準(zhǔn)[5]：皮膚的飽滿充盈消失，皮膚輕度到中度松弛，彈性明顯降低，皮膚輕度下垂、變?。虎谑茉囌吣挲g在35～60周歲之間，男女不限；③受試者愿意在整個研究測試期間按照測試要求配合完成測試，并且不同時使用其他相同類型產(chǎn)品；④受試者在測試期間不得進行長時間日曬、戶外等活動；⑤依據(jù)《赫爾辛基宣言》本次無創(chuàng)測試經(jīng)受試者本人自愿，在測試前告知受試者本次測試的目的、詳情、潛在的風(fēng)險，簽署《知情同意書》。

1.4.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于妊娠、分娩后半年內(nèi)，哺乳期或備孕期女性；②室外工作無法避免日曬者；③對化妝品有過敏或高度敏感風(fēng)險者；④近3個月內(nèi)接受過或正在接受皮膚疾病或全身性疾病的藥物或物理治療；⑤近6個月內(nèi)接受過面部美容治療者；⑥研究者認(rèn)為不適合參加試驗者[6-7]。

1.4.3 雙盲操作法：30名受試者，每名受試者面部左右兩側(cè)隨機分為對照側(cè)和試驗側(cè)，對照側(cè)使用空白樣品，試驗側(cè)使用測試樣品。兩種測試樣品外觀規(guī)格一致，無法分辨，根據(jù)隨機分組結(jié)果為每名受試者分配好樣品，并在包裝上標(biāo)注左側(cè)和右側(cè)。受試者根據(jù)樣品標(biāo)注信息，每天早晚分別于面部兩側(cè)使用相應(yīng)樣品。測試期間受試者其他護膚習(xí)慣保持不變，測試期間不得同時使用其他具有抗衰、緊致等功效的化妝品或藥品，持續(xù)使用4周[6]。

1.4.4 客觀評價：分別于基線（D0）、第14天（D14）、第28天（D28）進行面部固定區(qū)域彈性數(shù)據(jù)測量、皮膚超聲和面部皮膚圖像采集。測試當(dāng)天受試者清潔面部后在溫度（21℃～23℃）、相對濕度（40%～60%）的房間內(nèi)安靜休息15 min后進行數(shù)據(jù)采集。本研究中使用多功能皮膚測試儀Dermalab Series SkinLab Combo來獲取彈性數(shù)據(jù)，皮膚彈性值通過皮膚粘彈性值（VE值）、皮膚楊氏彈性模量（E值）和皮膚回縮時間（R值）三個參數(shù)進行測量，E值的計算基礎(chǔ)是測量彈性探頭室內(nèi)的皮膚在施加了特定和預(yù)設(shè)的負(fù)壓時所拉伸的距離，其數(shù)值越高，代表皮膚彈性越好；R值是指以毫秒為單位的時間，皮膚從完全提升到皮膚回縮到峰值高度的33%時所需的時間，R值越低，說明皮膚彈性越好；VE是通過回彈時間除以彈性模量所得參數(shù)，其值越高，說明皮膚彈性越好。彈性數(shù)據(jù)每個測試區(qū)域測量3次，取平均值，測試部位為受試者兩側(cè)臉頰；使用Dermalab Series SkinLab Combo來獲取受試者面部皮膚超聲圖像，測試部位為受試者臉頰兩側(cè)；VISIA CR面部圖像分析系統(tǒng)拍攝受試者正面、右側(cè)、左側(cè)面部圖像并分析毛孔數(shù)量[9]

1.4.5 主觀評價：測試4周結(jié)束后，受試者進行主觀評價，分別就兩側(cè)皮膚的水潤度、細(xì)紋、緊實度、彈性的改善情況進行打分。滿分5分，5=非常明顯，4=比較明顯，3=一般，2=不太明顯，1=不明顯。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用Excel軟件，對各個測量值進行描述性統(tǒng)計，包括數(shù)量、均值、標(biāo)準(zhǔn)差等。應(yīng)用SPSS分析軟件，將不同時間點的測量值與基線值進行比較，進行配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 體外評價

2.1.1 CKK-8法體外人皮膚成纖維細(xì)胞增殖實驗：不同濃度測試樣品對HFS活力的影響測定結(jié)果顯示，1%、0.1%的測試樣品均具有較好的促進HSF細(xì)胞增殖作用。見圖1。

2.1.2 ELISA法檢測Ⅰ型膠原蛋白含量：結(jié)果顯示，與空白對照組相比，1%樣品組和0.1%樣品組的Ⅰ型膠原蛋白含量有顯著性增長，上調(diào)率分別為22.03%和14.12%，說明受試物在該受試濃度下具有促進Ⅰ型膠原蛋白合成的作用。見表1、圖2。

2.2 人體評價

2.2.1 皮膚彈性變化：在D0、D14、D28對受試者進行皮膚彈性檢測，皮膚粘彈性值（VE值）、皮膚楊氏彈性模量（E值）和皮膚回縮時間（R值）的測定結(jié)果見表2。28 d后，試驗側(cè)的VE值、E值、R值均比基線時顯著改善（P＜0.001）；對照側(cè)VE值、E值、R值與基線比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～4。

2.2.2 皮膚毛孔變化：根據(jù)VISIA圖像分析數(shù)據(jù)觀察面部毛孔數(shù)據(jù)的改善情況。結(jié)果顯示，試驗側(cè)D14、D28時毛孔數(shù)量顯著低于D0時（P＜0.001），而對照側(cè)三個時間點的毛孔數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖5。

2.2.3 皮膚超聲：在超聲圖像中，顏色表示反射的超聲信號的強度，深色表示強度低，而白色（黃色）表示強度高，真皮是多種顏色的混合。皮膚中非均勻結(jié)構(gòu)，例如完整膠原蛋白、彈性蛋白等，由于聲學(xué)特性的變化會引起較高強度的回聲和反射。因此，測試樣品對于皮膚的抗衰效果可以通過觀察真皮層內(nèi)高回聲區(qū)域的增加，即超聲圖像中白色（黃色）顏色區(qū)域的增加和真皮層密度的改變來評價[10]。根據(jù)超聲圖像，試驗側(cè)超過90%受試者的真皮層內(nèi)高回聲區(qū)域增加，真皮層密度增加。說明測試樣品具有提升真皮層密度，促進真皮層內(nèi)膠原蛋白等物質(zhì)增加的作用，具有一定的抗衰效果。部分受試者超聲圖像見圖6～9。

2.2.4 受試者自我評分：受試者自我評分結(jié)果顯示，使用試驗樣品和對照樣品28 d后，兩側(cè)皮膚水潤度、細(xì)紋均有改善，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），試驗側(cè)皮膚緊實度、彈性改善明顯優(yōu)于對照側(cè)（P＜0.05）。評分結(jié)果見表4。

3? 討論

肽是由氨基酸通過肽鍵鏈接形成的一類化合物，是具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)片段。由于氨基酸種類的多樣性和肽鏈空間構(gòu)象的高自由度，使得肽具備生物學(xué)作用的多樣性，可分為信號肽、載體肽、酶抑制肽、神經(jīng)遞質(zhì)抑制等[11]。

信號肽主要通過對細(xì)胞外基質(zhì)合成酶的促進和對金屬蛋白酶的抑制，從而調(diào)節(jié)皮膚組織蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，增加細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、彈性蛋白和蛋白多糖的合成，使皮膚緊致，對抗衰老。載體肽是指可以加速和促進生物活性分子進入皮膚的肽，也被稱為細(xì)胞穿透肽或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，主要用于抵抗皮膚光老化現(xiàn)象的出現(xiàn)。神經(jīng)遞質(zhì)抑制肽，如乙酰基六肽-8，主要通過干擾SNARE復(fù)合體的形成和干擾乙酰膽堿的釋放，從而起到類似肉毒素阻斷神經(jīng)的效果，但又不會帶來肉毒素的副作用，還具有促進膠原蛋白合成以及脂肪組織再生的功能，主要用于延緩皮膚衰老和抗皺[12-13]。

本研究試驗樣品成分中，棕櫚酰三肽-5可以提升成纖維細(xì)胞活力，促進細(xì)胞再生，促進膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖的合成；寡肽-1可以促進表皮細(xì)胞再生，改善皮膚質(zhì)地；乙?；?8作為神經(jīng)遞質(zhì)抑制肽，可以舒緩放松肌肉，改善面部皺紋；乙酰基四肽-9可增強真皮致密度和緊實度，提升皮膚彈性[13]。

體外實驗中，Ⅰ型膠原蛋白是真皮細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，通過比較空白與測試樣品組Ⅰ型膠原蛋白含量的上調(diào)率，評價受試物在促進膠原蛋白合成方面是否具有功效[14]。結(jié)果顯示，1%、0.1%濃度的測試樣品對人成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生具有顯著促進作用，對人成纖維細(xì)胞的增殖有顯著促進作用。濃度為1%的樣品組人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力為139.452%；100μg/ml TGF-β1和1%樣品的Ⅰ型膠原蛋白上調(diào)率分別為21.659%和22.026%。說明測試樣品具有較好的促進細(xì)胞再生和促進細(xì)胞外基質(zhì)合成的效果。

本研究人體測試顯示，使用測試樣品28 d后試驗側(cè)的皮膚彈性值（E值、R值和VE值）均較D0時顯著改善，說明測試樣品能顯著提升皮膚彈性。隨著皮膚衰老，面部皮膚彈性降低，真皮層膠原纖維減少，導(dǎo)致皮膚毛孔周圍的支撐結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致面部毛孔增加[15]，使用測試樣品28 d后，試驗側(cè)毛孔特征計數(shù)顯著減少，結(jié)合超聲圖像，試驗側(cè)超過90%受試者的真皮層內(nèi)高回聲區(qū)域增加，真皮層密度密度增加。說明測試樣品可提升真皮層致密度，細(xì)化毛孔。受試者自我評估顯示，測試4周后皮膚細(xì)紋、水潤度，彈性和緊實度都得到了較好的改善。

綜上所述，試驗樣品能顯著提升HFS活力，促進Ⅰ型膠原生成，顯著改善面部皮膚彈性，減小面部毛孔，增加真皮層密度，有助于改善皮膚衰老，在抗衰方面具有良好的應(yīng)用前景。

聲明：本研究僅為學(xué)術(shù)研究，只供學(xué)術(shù)交流使用。

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[收稿日期]2023-02-07

本文引用格式：李生慧，于鈺，張明月.含有復(fù)合多肽的精華液改善皮膚衰老的功效研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（4）：65-69.