馬寧珠 張建國 王振霖 齊娜

[摘要]目的：篩選最優(yōu)處方制備含蒺藜與百部的微乳凝膠面膜，研究蒺藜與百部中藥提取物的抗氧化活性及酪氨酸酶活性抑制作用。方法：通過構建偽三元相圖和正交試驗篩選微乳形成的最優(yōu)處方；通過對中藥面膜穩(wěn)定性考察和感官評價判斷面膜質(zhì)量；采用2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）自由基和超氧陰離子自由基清除實驗考察中藥提取物的體外抗氧化作用，并對中藥提取物和中藥面膜抑制酪氨酸酶活性作用進行研究。結(jié)果：微乳平均粒徑為35.26 nm，PDI為0.029，理化性質(zhì)穩(wěn)定；中藥面膜穩(wěn)定性和感官評價良好。中藥提取物對于DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力稍弱于維生素C，抗氧化性良好；中藥提取物和中藥面膜對酪氨酸酶活性具有較好的抑制作用，稍弱于維生素C（P＜0.05），具有良好的美白作用。結(jié)論：本研究確定了含蒺藜、百部的復方中藥微乳凝膠面膜的最佳制備處方，制備的面膜粘度適中，易于涂抹，穩(wěn)定性良好，具有良好的抗氧化和美白作用。

[關鍵詞]復方中藥；微乳凝膠面膜；抗氧化；酪氨酸酶活性抑制

[中圖分類號]TQ258.29? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）04-0059-06

Preparation and Whitening Effect of Tribulus Terrestris and Stemona Microemulsion Gel Mask

MA Ningzhu1， ZHANG Jianguo1， WANG Zhenlin1， QI Na1，2

（1.Department of Pharmacy， Guilin Medical University， Guilin 541004， Guangxi， China; 2.Department of Pharmacy， Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510315， Guangdong， China）

Abstract： Objective? The optimal formula of the microemulsion gel mask containing Tribulus terrestris and Stemona Stemona was screened， and the antioxidant activity and tyrosinase activity inhibition of extracts from Tribulus terrestris and Stemona Stemona were studied. Methods? The optimal formulation of microemulsion was screened by constructing pseudo ternary phase diagram and orthogonal test. The quality of Chinese herbal masks was judged by the stability investigation and sensory evaluation. DPPH free radical and superoxide anion free radical scavenging experiments were used to investigate the antioxidant activity of Chinese herbal extracts in vitro， and the inhibitory effects of Chinese herbal extracts and Chinese herbal masks on tyrosinase activity were studied. Results? The average particle size of microemulsion is 35.26 nm， PDI is 0.029， and its physicochemical properties are stable. The stability and perception of Chinese herbal masks are well evaluated. The scavenging ability of Chinese herbal extract for DPPH free radical and superoxide anion free radical is slightly weaker than that of vitamin C， and the antioxidant activity is good. Chinese herbal extracts and Chinese herbal masks have a good inhibitory effect on tyrosinase activity， which is slightly weaker than vitamin C （P＜0.05） and has a good whitening effect. Conclusion? In this study， the best preparation formula of compound Chinese medicine microemulsion gel mask containing Tribulus terrestris and Stemona Stemona was determined. The prepared mask has moderate viscosity， easy application， good stability， good antioxidation and whitening effect.

Key words： compound traditional Chinese medicine; microemulsion gel mask; antioxidant; tyrosinase activity inhibition

皮膚對人體抵御外界環(huán)境的干擾具有重要意義，但會受到紫外線照射和外來物質(zhì)的傷害，其中紫外線照射對其影響最大[1]。皮膚經(jīng)紫外線照射時間過長會使體內(nèi)活性氧含量過多，黑色素增加，使皮膚暗沉，嚴重者會產(chǎn)生皮炎和皮膚癌[2-3]。因此，降低體內(nèi)活性氧和黑色素含量是現(xiàn)在急需要解決的問題。

蒺藜是蒺藜科蒺藜屬植物蒺藜（Tribulus terrestris L.）的果實，具有抗氧化和抗炎等多種藥理活性，對糖尿病和心血管疾病等具有較好的治療作用[4-5]。蒺藜提取物在一定濃度范圍內(nèi)可以對酪氨酸酶活性產(chǎn)生抑制效應，具有美白作用。百部為百部科植物直立百部（Stemona sessilifolia Miq.）、蔓生百部（Stemona japonica Miq.）或?qū)θ~百部（Stemona tuberosa lour）的干燥塊根，具有抗炎、抗氧化和鎮(zhèn)咳等藥理活性，常用于治療呼吸系統(tǒng)疾病[6]。百部根提取物對DPPH、ABTS抗氧化自由基均具有清除作用。微乳分散性好，能改善藥物透皮吸收能力，在口服制劑、注射劑和透皮吸收制劑等方面都具有良好的應用[7]。其在經(jīng)皮給藥中具有滲透性好、藥物吸收快和刺激性小的優(yōu)點[8]。本研究制備蒺藜和百部微乳凝膠面膜，并探究蒺藜和百部提取物的抗氧化作用及其和中藥面膜的美白作用，現(xiàn)報道如下。

1? 材料和方法

1.1 實驗試劑：棕櫚酸異丙酯，抗壞血酸（西隴科學股份有限公司，廣東）；左旋多巴，L-酪氨酸，吐溫-80（北京索萊寶科技有限公司，北京）；無水乙醇（科隆化學品有限公司，四川）；鄰苯三酚（Kayon公司，美國）；泊洛沙姆188（德國BASF公司，德國）；酪氨酸酶（Worthington公司，美國）。

1.2 實驗儀器：渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；納米粒度分析儀（英國Malvern有限公司）；氣浴恒溫振蕩器（常州國華有限公司）；集熱式恒溫磁力加熱攪拌器（上海力辰儀器科技有限公司）；電子分析天平（德國Sartirius公司）；酶標儀（瑞士Tecan公司）；紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 復方中藥提?。悍Q取60.0 g復方中藥樣品（蒺藜和百部各30.0 g），300 ml 75%乙醇浸泡6 h，按乙醇∶中藥粗粉濾渣=5∶1（ml/g）的比例，80℃冷凝回流提取60 min，超聲提取60 min。濾液濃縮成約15 ml浸膏。

1.3.2 偽三元相圖構建：以偽三元相圖微乳區(qū)面積為指標評價微乳形成難易程度，微乳區(qū)面積大小與易于形成微乳的程度成正相關[9]。將乳化劑和助乳化劑混合得到混合相記為Smix，將Smix和油相按質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混勻，將水相緩慢滴加至混合油相中，記錄體系由渾濁變?yōu)槌吻鍟r對應的水相加入量[10]。

1.3.3 處方篩選：將油相、乳化劑、助乳化劑作為試驗因素，記作A、B、C，進行三因素三水平正交試驗，選用L9（34）正交表。因素水平見表1，正交試驗方案見表2。制備微乳并采用Origin 8.0軟件繪制偽三元相圖。

1.3.4 中藥微乳質(zhì)量評價：在微乳中滴加去離子水，觀察其與水混溶情況確定類型并使用馬爾文粒度儀測定其粒徑以及多分散性指數(shù)PDI，采用透射電鏡拍攝觀察微乳形態(tài)。將微乳以4 000 r/min離心15 min，觀察有無分層或沉淀出現(xiàn)來考察其離心穩(wěn)定性。

1.3.5 中藥面膜的制備：將卡波姆940研細后加入中藥微乳中，待其充分溶脹后攪拌均勻，加入三乙醇胺調(diào)節(jié)pH值，制得中藥微乳凝膠面膜。

1.3.6 中藥面膜質(zhì)量評價：將面膜于（40±1）℃和（-5±1）℃條件下保存24 h，實驗前后面膜外觀和pH值有明顯變化記為（+），反之記為（-）[9]。將面膜以4 000 r/min離心15 min，離心后有分層或沉淀出現(xiàn)記為（+），反之記為（-）。3位面膜使用者根據(jù)表3對面膜進行評分，取平均值作為感官評價結(jié)果。

1.3.7 抗氧化性考察

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力：以5、10、25、40、50、100、150μg/ml中藥提取物或維生素C為樣品溶液。50μl樣品加150μl DPPH溶液作為樣品組，50μl樣品加150μl無水乙醇為對照組，50μl去離子水加150μl DPPH溶液為空白組，37℃避光反應40 min后于516 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率計算公式：清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。式中Ai是樣品組吸光度值；Aj是對照組吸光度值；Ac是空白組吸光度值。

1.3.7.2 超氧陰離子自由基清除能力：10、50、65、100、200μg/ml中藥提取物或維生素C為樣品溶液。加入150μl Trist-HCl、50μl樣品和20μl鄰苯三酚為樣品組，0.01 mol/L HCl代替鄰苯三酚為對照組，去離子水代替樣品為空白組，325 nm處測定反應10 min每分鐘的吸光度記為A1、A2和A3。以吸光值A對反應時間t作線性關系圖，斜率為Vt，超氧陰離子自由基清除率計算公式：清除率（%）=[1-（Vt1-Vt2）/Vt3]×100%。式中Vt1是樣品組線性關系斜率；Vt2是對照組線性關系斜率；Vt3是空白組線性關系斜率。

1.3.8 酪氨酸酶活性抑制：通過文獻報導和預實驗結(jié)果，將酪氨酸單酚酶和二酚酶檢測時間定為反應后20 min和15 min。

1.3.8.1 二酚酶活性抑制率測定：10、100、300、500、800、1 200μg/ml中藥提取物或中藥面膜或維生素C為樣品溶液。加入50μl樣品、100μl PBS和100μl左旋多巴為樣品組，不加樣品為空白組，不加酪氨酸酶為對照組，不加樣品和酪氨酸酶為空白對照組，37℃反應10 min后，加入50μl酪氨酸酶，恒溫反應15 min于490 nm處測定吸光度。

1.3.8.2 單酚酶活性抑制率測定：10、50、100、300、500、800μg/ml中藥提取物或中藥面膜或維生素C為樣品溶液。加入50μl樣品、100μl PBS和100μl 0.5 mmol/L的L-酪氨酸作為樣品組，不加樣品作為空白組；不加酪氨酸酶作為對照組；不加樣品和酪氨酸酶為空白對照組，37℃反應10 min后，加入50μl酪氨酸酶，恒溫反應20 min于490 nm處測定吸光度。以樣品濃度對酪氨酸酶抑制率作圖并計算IC50值。酪氨酸酶活性抑制率計算公式：抑制率（%）=[（A2-A3）-（A1-A4）]/（A2-A3）×100%。式中A1為樣品組吸光度，A2為空白組吸光度，A3為空白對照組吸光度，A4為對照組吸光度。

1.4 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 5及Origin 8進行作圖分析。采用SPSS 25進行統(tǒng)計學分析。

2? 結(jié)果

2.1 微乳處方篩選：使用偽三元相圖和正交試驗對微乳處方進行篩選，圖1A～I分別對應正交試驗方案中1～9號試驗處方得到的偽三元相圖。微乳面積大小分別為G＞H＞A＞B＞I＞C＞D＞E＞F，說明7號處方最容易形成微乳，6號處方最不容易形成微乳。A因素即油相為影響微乳區(qū)面積占比的主要因素，B因素和C因素即乳化劑和助乳化劑為次要因素，最優(yōu)組合為A3B1C2（見表4）。并且7號處方制備得到的微乳區(qū)面積占比最大，最容易形成微乳，因此選擇7號處方制備微乳。有研究表明相比于單一表面活性劑，兩種表面活性劑混合制備的微乳粒徑更小，穩(wěn)定性更好，載藥量更高[11]。綜合考慮，油相選擇橄欖油和棕櫚酸異丙酯，乳化劑選擇安全性較高的吐溫80和泊洛沙姆188；助乳化劑選擇丙二醇和丙三醇。中藥面膜處方的各成分及比例見表5。

2.2 微乳質(zhì)量評價：樣品加入蒸餾水后離心，未見分層，說明制備的微乳為O/W型。微乳平均粒徑為35.26 nm，PDI為0.029，分散性良好。結(jié)果顯示，微乳為類球形，分散均勻，不聚集。離心后的微乳未出現(xiàn)分層和明顯沉淀現(xiàn)象，表明微乳具有良好穩(wěn)定性。見圖2。

2.3 中藥面膜質(zhì)量評價：結(jié)果顯示，樣品在耐寒、耐熱和離心穩(wěn)定性實驗中，其外觀和pH等均未出現(xiàn)明顯變化，未出現(xiàn)分層和沉淀現(xiàn)象，說明制備得到的面膜穩(wěn)定性良好。中藥面膜在感官上表現(xiàn)為黏度適中[（3.3±0.10）分]、延展性適中[（3.5±0.12）分]、細膩度良好[（4.3±0.10）分]。

2.4 抗氧化性考察

2.4.1 DPPH自由基清除能力：結(jié)果顯示，中藥提取物對DPPH自由基具有清除能力并呈劑量依賴性，濃度越高，其對DPPH自由基的清除能力越強。總體上來看，其對于DPPH自由基的清除能力稍弱于維生素C（見圖3）。維生素C對于DPPH自由基的IC50值為15.24μg/ml，中藥提取物為20.89μg/ml，維生素C當量為0.73，這表明中藥提取物具有較好的抗氧化性，但其抗氧化性不如維生素C。見表6。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力：結(jié)果顯示，與維生素C比較，中藥提取物對于超氧陰離子自由基的清除率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。維生素C對超氧陰離子自由基的IC50值為23.73μg/ml，中藥提取物為36.94μg/ml，其維生素C當量為0.64，這表明中藥提取物對于超氧陰離子自由基的清除能力略低于維生素C，抗氧化性良好。見表7。

2.5 酪氨酸酶活性考察

2.5.1 酪氨酸單酚酶活性抑制率：結(jié)果顯示，與維生素C比較，中藥面膜對單酚酶活性的抑制作用差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但仍具有較好的抑制作用和良好的美白效果（見圖5）。與中藥面膜比較，中藥提取物對單酚酶活性的抑制作用差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且中藥面膜對單酚酶活性的抑制作用強于中藥提取物。

注：*表示與維生素C組比較，P＜0.05，**表示與維生素C組比較，P＜0.01；#表示與提取物組比較，P＜0.01

圖5? 不同濃度維生素C、中藥提取物和中藥面膜對酪氨酸單酚酶活性抑制率比較

2.5.2 酪氨酸二酚酶活性抑制率：結(jié)果顯示，與維生素C比較，中藥面膜對二酚酶活性抑制作用差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與中藥面膜比較，中藥提取物對二酚酶活性抑制作用差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且中藥面膜對二酚酶活性抑制作用強于中藥提取物，這表明將提取物制備成面膜后可以提高其對酪氨酸二酚酶活性抑制作用，與文獻報道的將中藥成分制備成微乳提高其對酪氨酸酶活性抑制作用是一致的[12]（見圖6）。維生素C、中藥提取物和中藥面膜對于單酚酶的IC50值高于二酚酶，這表明上述藥物對于酪氨酸二酚酶抑制作用更強。對于單酚酶和二酚酶，中藥提取物對其IC50值均高于中藥面膜IC50值，中藥提取物的維生素C當量均低于中藥面膜的維生素C當量，這表明將提取物制備成面膜后，其對酪氨酸酶活性的抑制作用增強。見表8。

3? 討論

面膜是一種美白護膚產(chǎn)品，對皮膚具有較好的保護作用，可以起到抗氧化、美白、淡斑和延緩衰老的作用，使皮膚更加細膩有光澤[13]。對于微乳凝膠面膜，一般需要加入乳化劑和助乳化劑來形成微乳，其中，毒性較小的非離子型表面活性劑如吐溫-80是比較好的一種乳化劑[14]。助乳化劑一般選用丙二醇和丙三醇，刺激性和毒性較小，能增加微乳穩(wěn)定性和保濕性[15]。本研究選用無刺激性和無毒性的卡波姆940作為凝膠劑，增加皮膚對面膜的吸收，并延長作用時間。制備得到的中藥微乳凝膠面膜黏度和延展性好，穩(wěn)定性良好。

白蒺藜的美白作用已得到明確證實，其水提物和醇提物對酪氨酸酶均具有較好的抑制作用，且其對于酪氨酸酶的作用具有雙向調(diào)節(jié)性，表現(xiàn)為低濃度抑制和高濃度促進[16]。白蒺藜所含蒺藜皂苷具有抗氧化[17]和抑菌抗炎作用[18]，有研究表明其能夠降低體內(nèi)丙二醛含量，提高谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，更好地清除自由基，起到抗氧化作用。百部具有抗氧化和抑菌能力，對酪氨酸酶抑制作用弱，其中百部多糖具有較好的抗氧化活性，對于超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基均具有清除作用，抗氧化性良好[6，19]。將蒺藜和百部提取物應用于化妝品中具有美白保濕和淡斑的作用。本研究比較了蒺藜、百部提取物和維生素C對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，以及中藥提取物、中藥面膜和維生素C對酪氨酸酶的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物對上述自由基的清除能力略低于維生素C，抗氧化性良好。中藥提取物和面膜對酪氨酸酶抑制作用均低于維生素C，具有較好的酪氨酸酶抑制作用和美白作用，因此本實驗中復方中藥對抗氧化作用以及對酪氨酸酶活性的抑制作用為蒺藜和百部提取物的共同作用。蒺藜和百部制備成面膜仍具有較好的抗氧化和美白作用。

綜上所述，蒺藜、百部微乳凝膠面膜粘度和延展性好，穩(wěn)定性良好，具有較好的抗氧化活性和美白作用，有開發(fā)和應用的價值，為后續(xù)開發(fā)蒺藜和百部化妝品提供理論依據(jù)。

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[收稿日期]2022-12-14

本文引用格式：馬寧珠，張建國，王振霖，等.蒺藜與百部微乳凝膠面膜的制備及其抗氧化和美白作用研究[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（4）：59-64.