羅婷 祁琳 李杰 薛文舒 田晨晨 曹清文 王越

基金項(xiàng)目：1.天津伊特生命科學(xué)研發(fā)有限公司項(xiàng)目（編號(hào)：HX2023-7）；2.天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：18JCZDJC33200）；3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（編號(hào)：ZXYCXLX202119、ZXYCXLX202213）

作者簡介：羅婷（1989.5-），女，湖南湘潭人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔種植外科研究

通訊作者：王越（1968.8-），女，天津人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合抗骨丟失分子機(jī)制的研究

摘要：目的? 研究氯化鈷（CoCl2）模擬的低氧條件下紅景天苷（SAL）對(duì)小鼠成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法? 用CoCl2模擬低氧條件（1%O2），建立體外低氧模型。采用MTS法研究低氧條件下不同濃度SAL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響，磷酸苯二鈉法研究低氧條件下SAL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）、Western blot及ELISA技術(shù)檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果? 確定用0.5 mmol/L的CoCl2來模擬低氧（1%O2）環(huán)境。低氧可明顯抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖及分化。經(jīng)SAL預(yù)處理后，可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖及分化，其中SAL（10 nmol/L）可顯著上調(diào)HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)水平及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平，并下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)論? 低氧條件下SAL促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖與分化。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可能與HIF-1α/VEGF信號(hào)通路有關(guān)。關(guān)鍵詞：紅景天苷；成骨細(xì)胞；增殖；分化；骨結(jié)合；HIF-1α/VEGF通路

中圖分類號(hào)：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.019

文章編號(hào)：1006-1959（2024）09-0101-06

Regulatory Effect of Salidroside on Mouse Osteoblasts Under Hypoxic Conditions Simulated

by Cobalt Chloride

LUO Ting1，QI Lin2，LI Jie1，XUE Wen-shu3，TIAN Chen-chen3，CAO Qing-wen3，WANG Yue3

（1.Department of Stomatology，General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China;

2.Department of Pharmacy，Characteristic Medical Center of PAP，Tianjin 300162，China;

3.School of Integrative Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract：Objective? To study the regulatory effect of salidroside （SAL） on mouse osteoblasts under hypoxic conditions simulated by cobalt chloride （CoCl2）.Methods? CoCl2 was used to simulate hypoxic conditions （1%O2） to establish an in vitro hypoxic model. MTS method was used to study the effect of different concentrations of SAL on the proliferation of MC3T3-E1 cells under hypoxic conditions. The effect of SAL on the differentiation of MC3T3-E1 cells under hypoxic conditions was studied by disodium phenyl phosphate method. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）， Western blot and ELISA were used to detect the mRNA and protein expression levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and downs.Results? 0.5 mmol/L CoCl2 was used to simulate the hypoxic （1%O2） environment. Hypoxia could significantly inhibit the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. After pretreatment with SAL， the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells were significantly promoted. SAL （10 nmol/L） significantly up-regulated the mRNA expression levels of HIF-1α and VEGF and the protein expression level of HIF-1α， and down-regulated the expression of VEGF protein.Conclusion? SAL promotes the proliferation and differentiation of mouse osteoblasts under hypoxia. The specific mechanism needs to be further studied， which may be related to the HIF-1α/VEGF signaling pathway.

Key words：Salidroside;Osteoblasts;Proliferation;Differentiation;Osseointegration;HIF-1α/VEGF pathway

口腔種植術(shù)后容易導(dǎo)致手術(shù)區(qū)域血供不足、微循環(huán)受阻，從而出現(xiàn)術(shù)區(qū)的低氧環(huán)境。術(shù)區(qū)牙周組織的低氧，致使周圍骨穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致骨量的損失，最終引起種植體的松動(dòng)或脫落。如何促進(jìn)種植區(qū)新骨形成和避免種植區(qū)牙槽骨的吸收萎縮，對(duì)于種植體繼發(fā)性初期穩(wěn)定性具有重要的臨床意義。紅景天苷（salidroside， SAL）是藏藥紅景天主要活性成分，具有抗缺氧、促血管新生、抗骨質(zhì)疏松、抗細(xì)胞凋亡、抗癌、抗炎、抗衰老、抗疲勞、抗缺氧、抗纖維化、抗病毒、等多種藥理作用[1，2]。低氧條件下骨組織通過血流再分配、增加無氧代謝等代償反應(yīng)來適應(yīng)低氧微環(huán)境[3]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha， HIF-1α）對(duì)組織的缺氧比較敏感，可在特異性缺氧狀態(tài)下迅速發(fā)揮活性。HIF-1α是細(xì)胞缺氧的重要指標(biāo)之一，在血管新生、骨改建、炎癥反應(yīng)等多種生理和病理過程中均有表達(dá)，通過活化下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）來調(diào)節(jié)骨改建。VEGF是促進(jìn)骨組織周圍血管新生的主要細(xì)胞因子。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4，5]，常氧條件下SAL促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化以及HIF-1α依賴的VEGF的表達(dá)。王潔等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，低氧通過激活HIF-1α/VEGF通路，促進(jìn)牙周組織成骨能力。持續(xù)的缺氧通過調(diào)控c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）和核因子κB抑制蛋白α磷酸化抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收[7]。而低氧環(huán)境下SAL是否通過激活HIF-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖與分化功能從而調(diào)節(jié)骨重建的研究少見報(bào)道。本研究以小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1為細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究CoCl2模擬的低氧條件下SAL對(duì)其影響，旨在為促進(jìn)種植骨結(jié)合的藥物治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑? SAL：中國藥品生物制品鑒定所（純度99.9%）。CoCl2：美國Sigma公司（純度＞92.5%）。胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）及DMEM高糖培養(yǎng)基：美國GIBCO公司。乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）及羥乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic， HEPES）：美國Sigma公司。青鏈霉素混合液：南京凱基生物科技公司。胰蛋白酶及二甲基亞砜（Dimathyl sulfoxide， DMSO）：北京索萊寶科技有限公司。MTS細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒：上海貝博（BestBio）公司。堿性磷酸酶（AKP）測試盒：南京建成生物工程研究所；引物：南京金思特科技公司。Trizol Reagent：美國Invitrogen公司。cDNA合成試劑盒及RT-qPCR擴(kuò)增試劑：上海Yeasen生物技術(shù)公司。HIF-1α及VEGF引物：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。BCA蛋白定量試劑盒、HiFi Script cDNA Synthesis Kit：康為世紀(jì)生物科技有限公司。HIF-1α抗體（ab2185，1∶1000）：Abcam公司。VEGF試劑盒：天津伊特生命科學(xué)研發(fā)有限公司。

1.2主要儀器? SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)公司。Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱：美國forma公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)? 小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。使用加入含有雙抗（100 IU/L青霉素及100 μg/ml鏈霉素）的10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。其置于CO2孵箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)，隔天換液。

1.4低氧模型及CoCl2模擬低氧模型的建立

1.4.1低氧模型的建立? 取對(duì)數(shù)生長期的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1消化后接種到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞飽和度達(dá)到80%左右，更換1% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基使細(xì)胞同步化24 h。然后將細(xì)胞放入低氧罐中密封培養(yǎng)，同時(shí)通入40 min的混合氣體（1%O2），最后放入孵育箱培養(yǎng)24 h。

1.4.2 CoCl2模擬低氧模型的建立? 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種。在細(xì)胞同步化24 h后加入不同濃度CoCl2（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L），隨后放入CO2孵箱培養(yǎng)24 h。用MTS法檢測細(xì)胞增殖活性，Western blot法檢測關(guān)鍵蛋白HIF-1α的表達(dá)變化，按說明書比例配制含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解后按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定樣品濃度。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉孵育后顯影，用Image J分析條帶，使用GraphPad Prism 9作圖。

1.5 MTS法檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性? 取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1接種于96孔培養(yǎng)板上。24 h后，更換1% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基。設(shè)對(duì)照組、CoCl2組（0.5 mmol/L）及SAL干預(yù)組（0.1、1、10、100、1000、10 000 nmol/L）。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，CoCl2組和SAL干預(yù)組加入CoCl2，作用24 h。結(jié)束前4 h，避光加入MTS，置于CO2孵箱中培養(yǎng)4 h。4 h后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀，測量各孔波長492 nm的吸光度（A492）。

1.6 ALP法檢測MC3T3-E1細(xì)胞分化活性? 細(xì)胞處理同前，每組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。SAL干預(yù)組分別加入相應(yīng)濃度的SAL，分別作用2、6、9、12 d。培養(yǎng)結(jié)束前24 h加入CoCl2。0.01 mol/L PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，吸干。其次加入0.1% Triton X-100，用移液器充分吹打，作用3 min，收集入1.5 ml Ependorf管中。然后低溫下用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，1500 rpm離心10 min。最后取上清液作為細(xì)胞內(nèi)ALP活性測定的標(biāo)本。按照說明書使用堿性磷酸酶試劑盒進(jìn)行ALP活性測定。

1.7 RT-PCR法檢測HIF-1α及VEGFmRNA表達(dá)水平? 取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞調(diào)整濃度后接種在6孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)共分對(duì)照組、CoCl2組和SAL干預(yù)組（終濃度10、100、1000、10 000 nmol/L）。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA備用，最后使用RT-qPCR擴(kuò)增試劑在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中將cDNA擴(kuò)增，記錄結(jié)果。目的基因數(shù)據(jù)用內(nèi)參基因β-actin矯正后，用Graphpad prism 9軟件作圖。

1.8 Western blot法檢測HIF-1α蛋白表達(dá)水平? 用Western blot法檢測加入SALHIF-1α蛋白表達(dá)水平。處理同上，引物見表1。

1.9 ELISA技術(shù)檢測VEGF蛋白表達(dá)水平? 收集對(duì)照組、CoCl2組和SAL干預(yù)組（終濃度10、100 nmol/L）細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依次加入樣品，每個(gè)樣品設(shè)置３個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀檢測OD值，檢測上清液中VEGF表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0以及GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表處理。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1 CoCl2模擬低氧模型的建立? 與對(duì)照組相比，低氧（1%O2）抑制小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖。選擇不同濃度CoCl2（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）模擬低氧條件，結(jié)果顯示，0.5 mmol/L CoCl2與低氧組（1%O2）對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響相近，見圖1，故選擇作為模擬低氧的濃度。

2.2 CoCl2模擬低氧條件下SAL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖活性的影響? 與以上結(jié)果一致，低氧可抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。SAL（0.1、1、10 nmol/L）可以促進(jìn)MC3T3-E1增殖（P＜0.05）。其中以10 nmol/L促增殖作用最為顯著（P＜0.01）。而高濃度的SAL（1000、10 000 nmol/L）則抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性（P＜0.05），見圖2。

2.3 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化的影響? ALP是成骨細(xì)胞早期分化的特異性標(biāo)志酶之一。檢測細(xì)胞上清液中的ALP活性可間接反映成骨細(xì)胞的分化程度。本研究進(jìn)一步檢測了SAL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化的影響。結(jié)果顯示，CoCl2模擬的低氧可抑制小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞分化（P＜0.01）。與CoCl2組相比，低氧條件下SAL作用2 d后，MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性增加，延長作用時(shí)間至6、9、12 d后，SAL對(duì)ALP活性的影響更加顯著，見圖3、圖4。提示低氧條件下SAL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP的升高作用可能具有時(shí)間依賴性，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對(duì)小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響? 誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境是HIF-1α主要功能之一。本研究進(jìn)一步研究了CoCl2模擬的低氧條件下SAL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 HIF-1α及其下游效應(yīng)分子VEGF的基因表達(dá)影響。CoCl2組HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表達(dá)水平較其對(duì)照組顯著上調(diào)（P＜0.01），SAL干預(yù)組HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表達(dá)水平較低氧組上調(diào)，其中SAL（10 nmol/L）作用明顯（P＜0.05），見圖5，提示CoCl2模擬的低氧條件下SAL能夠激活HIF-1α/VEGF信號(hào)通路。

2.5 CoCl2模擬的低氧條件下SAL對(duì)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響? 為進(jìn)一步驗(yàn)證CoCl2模擬的低氧下SAL對(duì)成骨細(xì)胞HIF-1α通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，采用Western blot法檢測SAL預(yù)處理后HIF-1α蛋白表達(dá)的變化。與CoCl2組相比，SAL干預(yù)組HIF-1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)，且當(dāng)SAL濃度為10 nmol/L最為明顯（P＜0.05）。使用ELISA法測定加入濃度為10～100 nmol/L SAL的上清液中VEGF的表達(dá)，見圖6。結(jié)果顯示：CoCl2模擬的低氧條件下VEGF蛋白表達(dá)增加，加入SAL后對(duì)其蛋白表達(dá)有一定抑制作用。

3討論

骨結(jié)合即種植體表面與周圍骨組織的直接結(jié)合，兩者界面之間無纖維組織長入。骨結(jié)合是種植手術(shù)成功的基礎(chǔ)?；谀壳把芯匡@示[8，9]，促進(jìn)種植體骨結(jié)合的基礎(chǔ)研究方法主要包括調(diào)節(jié)骨代謝、種植體表面改性、干細(xì)胞相關(guān)療法和調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境等。種植體周圍的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的骨穩(wěn)態(tài)直接影響骨結(jié)合。種植術(shù)后常見的微血管供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致組織缺氧，從而影響骨重建。基于SAL抗缺氧、促血管新生及抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[1，2]，本實(shí)驗(yàn)利用CoCl2來模擬細(xì)胞體外的低氧環(huán)境。運(yùn)用MTS比色法檢測低氧條件下SAL對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，此方法具有重復(fù)性好、靈敏度高和操作簡便等特點(diǎn)，可反映存活細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CoCl2模擬的低氧抑制小鼠成骨細(xì)胞的增殖，SAL預(yù)處理后促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞的增殖。

成骨細(xì)胞的分化為礦化提供骨基質(zhì)，促進(jìn)骨重建過程中新骨的形成。ALP是反映成骨細(xì)胞的活化及骨形成的特異性標(biāo)志酶。成骨細(xì)胞活性增加，則ALP的合成和分泌增加。ALP是一種外分泌性糖蛋白，可作為成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志酶。檢測細(xì)胞上清液中的ALP活性，即可間接反映出成骨細(xì)胞分化成熟程度[10，11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低氧條件下成骨細(xì)胞分化受到抑制，這與高文魁等[12]的研究結(jié)果一致。劉紫杉等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，125 μmol/L CoCl2作用MC3T3-E1 48 h后，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提示CoCl2濃度及作用時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞的分化影響可能不一致。CoCl2模擬的低氧條件下加入SAL則能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

細(xì)胞能依靠氧感受器和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異地調(diào)節(jié)相應(yīng)基因或蛋白的表達(dá)來適應(yīng)低氧環(huán)境[14]。機(jī)體在對(duì)外界低氧的應(yīng)答過程中HIF-1α發(fā)揮了核心作用。HIF-1α對(duì)于機(jī)體組織的急性缺氧的恢復(fù)的十分關(guān)鍵的。HIF-1α通過上調(diào)與血管生成相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，如VEGF及其受體，增加血流量，降低組織損傷[15]。HIF-1α/VEGF在調(diào)節(jié)骨代謝過程中發(fā)揮重要作用[16]。目前普遍認(rèn)為HIF-1α是上調(diào)VEGF的主要調(diào)節(jié)因子[17]。VEGF是一種多功能糖蛋白，分布于血管附近的細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，從而達(dá)到促進(jìn)血管生成的作用[18]。在骨形成早期階段，VEGF被分泌釋放到細(xì)胞外并激活血管的生成，為骨重建區(qū)提供血供和氧氣[19]。VEGF可通過激活VEGFR-2的表達(dá)促進(jìn)血管生成；同時(shí)還可以通過激活VCAM-1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的黏附與增殖[20]。本實(shí)驗(yàn)中CoCl2模擬的低氧條件下SAL可顯著上調(diào)小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA和HIF-1α蛋白的表達(dá)量，而VEGF蛋白表達(dá)量降低。所以HIF-1α蛋白質(zhì)翻譯修飾后與其它相關(guān)蛋白間如何相互作用，影響VEGF mRNA翻譯的相關(guān)因素，以及低氧條件下信號(hào)轉(zhuǎn)錄的精確過程還需進(jìn)一步研究。提示低氧條件下SAL促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，0.5 mmol/L CoCl2模擬的低氧條件下，SAL促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖與分化。其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究以利于SAL用于調(diào)整種植術(shù)后骨重建。

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收稿日期：2023-07-28；修回日期：2023-08-22

編輯/肖婷婷