鄭洋群 尹以杭 余思廷 趙曉雷 關(guān)信 鄭元

文章編號：2096-398X2024）03-0057-08

（西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 云南 昆明 650224）

摘 要：牛樟芝是我國臺灣特有的珍稀藥食兩用真菌，含有豐富活性成分，具有抗癌、抗腫瘤和保肝等多種藥理作用，三萜類化合物被認(rèn)為是牛樟芝中的重要藥用物質(zhì)，不同提取工藝對牛樟芝總?cè)频寐视绊懖煌?為探究牛樟芝總?cè)谱罴烟崛」に嚰捌淇寡趸钚?選取不同提取溶劑、溫度、時(shí)間、液料比，采用單因素試驗(yàn)方法和正交試驗(yàn)方法探究不同因素對牛樟芝總?cè)频寐实挠绊懀⑼ㄟ^高效液相色譜（HPLC）分析不同溶劑提取工藝之間的成分差異，比較分析其抗氧化活性.結(jié)果表明，牛樟芝總?cè)铺崛∽罴压に嚍椋憾燃淄闉樘崛∪軇?、液料?∶320 g·mL-1、45 ℃提取5 h.在此條件下，牛樟芝總?cè)频寐蕿?0.16±0.077 6%，通過HPLC分析，所得粗提物成分豐富且具有較好的抗氧化活性，其中DPPH清除能力的IC50值達(dá)0.137 6，總還原能力達(dá)58.03%.通過對牛樟芝提取工藝優(yōu)化顯著提高了牛樟芝總?cè)频寐?，為牛樟芝活性成分提取、化合物分離及開發(fā)利用提供理論參考.

關(guān)鍵詞：牛樟芝； 總?cè)疲?正交試驗(yàn)； 抗氧化活性

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Study on optimization of extraction process of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea and its antioxidant activity

HENG Yang-qun， YIN Yi-hang， YU Si-ting， HAO Xiao-lei， GUAN Xin， HENG Yuan*

Forestry College， Southwest Forestry University， unming 650224， China）

Abstract：Antrodia cinnamomea is a rare medicinal and edible fungus unique to Taiwan，China.It contains rich active ingredients and has various pharmacological effects such as anticancer，anti-tumor，and liver protection.Triterpenoids are considered important medicinal substances in Antrodia cinnamomea，and different extraction processes have different effects on the total triterpenoids yield of Antrodia cinnamomea.In order to explore the optimal extraction process and antioxidant activity of total triterpenoids in Antrodia cinnamomea.Different extraction solvents，temperature，time，and liquid-solid ratio were selected.Single factor experiments and orthogonal experiments were used to investigate the effects of different factors on the yield of total triterpenoids in Antrodia cinnamomea.High performance liquid chromatography HPLC） was used to analyze the compositional differences between different solvent extraction processes and compare their antioxidant activity.The results showed that the optimal extraction process for total triterpenes in Antrodia cinnamomea was dichloromethane as the extraction solvent，a liquid to material ratio of 1∶320 g·mL-1，and extraction at 45 ℃ for 5 hours.Under these conditions，the yield of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea was 10.16±0.077 6%.Through HPLC analysis，the crude extract obtained is rich in components and has good antioxidant activity.The IC50 value of DPPH scavenging ability was 0.137 6，and the total reducing ability was 58.03%.By optimizing the extraction process of Antrodia cinnamomea，the total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea was significantly improved，providing theoretical reference for the extraction of active ingredients，compound separation，and development and utilization of Antrodia cinnamomea.

Key words：Antrodia cinnamomea； total triterpenoids； orthogonal test； antioxidant activity

0 引言

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）隸屬于多孔菌科（Fomitopsidaceae）、薄孔菌屬（Antrodia），是我國臺灣特有的珍稀藥食兩用真菌.在自然條件下牛樟芝僅腐生于我國臺灣保育樹種牛樟（Cinnamomum kanehirai）腐朽的樹干心材內(nèi)壁或倒伏的樹干潮濕表面［1，2］.牛樟芝含有豐富的三萜類、甾醇類、泛醌類及琥珀酸和馬來酸衍生物等活性成分，具有良好的抗癌、抗腫瘤、抗氧化、保肝、抑菌消炎等作用，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”，其中三萜類化合物被認(rèn)為是牛樟芝中的主要藥用物質(zhì)，野生牛樟芝子實(shí)體的三萜類化合物含量超過10%，遠(yuǎn)高于靈芝的1%～3%，對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等治療有良好作用［3-8］.牛樟芝因其特殊抗癌功效具有廣闊的市場前景，在臺灣地區(qū)已有人工種植，目前已在醫(yī)療、保健、化妝品等領(lǐng)域推廣應(yīng)用，且價(jià)格不菲.

目前，對于牛樟芝提取多采用傳統(tǒng)室溫提取或超聲輔助提取以及CO2超臨界萃取技術(shù)，所用提取溶劑多為甲醇或乙醇［9-11］.而有關(guān)不同提取溶劑、溫度、液料比及時(shí)間對牛樟芝總?cè)坪考翱寡趸钚缘挠绊懙难芯坑写钊胩接?不同提取溶劑極性不同，對于不同成分溶解性也不同，導(dǎo)致提取效果存在較大差異［12，13］.本研究基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過正交試驗(yàn)方法進(jìn)行牛樟芝提取工藝優(yōu)化，探究不同因素對牛樟芝總?cè)频寐实挠绊?，通過HPLC分析不同溶劑提取之間的成分差異，并研究其抗氧化活性，為牛樟芝活性成分的提取分離及開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

香草醛，分析純，天津奧普升化工有限公司；高氯酸、乙酸乙酯、冰醋酸，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、95%乙醇，均為分析純，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；齊墩果酸，HPLC≥98%，上海麥克林生化科技服份有限公司；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈，色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?，1-二苯基-2-三硝基苯肼，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司.

1.1.2 主要儀器

TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-6100型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；AX224H/E電子天平，奧豪斯儀器有限公司；SpectraMax 190酶標(biāo)儀，美國Biorad 公司；HWS-250恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HCJ-4磁力攪拌水浴鍋，匡貝實(shí)業(yè)有限公司；AW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SO510C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀、Agilen ORBAX SB-C18色譜柱，美國 安捷倫科技有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛樟芝菌絲體粉末制備

牛樟芝菌株（AC002）經(jīng)ITS及形態(tài)鑒定，現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.選用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行牛樟芝培養(yǎng)，在超凈工作臺接種活化牛樟芝，于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃暗培養(yǎng)30 d.將達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間的牛樟芝菌絲體烘干后粉碎過80目篩備用.

1.2.2 牛樟芝總?cè)频寐蕼y定

參照馮路瑤［14］的方法，以齊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇配制成質(zhì)量濃度200 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL具塞試管中，隨后將試管置于100 ℃沸水中揮干，分別向試管中加入1 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸溶液，混勻于60 ℃水浴加熱20 min，隨后取出試管于冰水中冷卻后加入5 mL冰醋酸混勻，在550 nm波長處測量吸光值.以吸光值和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算牛樟芝樣品總?cè)坪?牛樟芝樣品總?cè)茰y量方法同以上步驟，用公式（1）計(jì)算牛樟芝總?cè)频寐?

三萜得率=m×vM×V×100（1）

式（1）中：m為標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算牛樟芝總?cè)坪浚é蘥·mL-1），v為提取時(shí)提取液體積mL；M為牛樟芝質(zhì)量（g）；V為吸取供試品溶液（mL）.

1.2.3 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對提取溶劑、液料比、溫度及時(shí)間4個重要因素進(jìn)行優(yōu)化.精確稱取牛樟芝菌絲體粉末0.1 g，按照液料比1∶160 g·mL-1分別加入甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液，25 ℃提取5 h，主要考察提取溶劑對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐视绊?牛樟芝菌絲體粉末與甲醇按照液料比1∶40 g·mL-1、1∶80 g·mL-1、1∶160 g·mL-1、1∶320 g·mL-1、1∶640 g·mL-1、1∶1 280 g·mL-1混合均勻，25 ℃提取5 h，主要考察提取液料比對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐视绊?牛樟芝菌絲體按照1∶160 g·mL-1與甲醇混合均勻后分別在10? ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃提取5 h，主要考察提取溫度對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐实挠绊?牛樟芝菌絲體粉末與甲醇按照1∶160 g·mL-1混勻，25 ℃提取0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，主要考察提取時(shí)間對牛樟芝菌絲體三萜得率影響，每組試驗(yàn)平行重復(fù)三次.

1.2.4 正交試驗(yàn)方法

在單因素試驗(yàn)結(jié)果上，選取對牛樟芝總?cè)朴绊戄^為顯著的提取溶劑（A）、溫度（B）、液料比（C）采用L 933）正交試驗(yàn)方法，設(shè)3個因素，每個因素設(shè)置3個水平，以總?cè)频寐蕿榭疾熘笜?biāo)，因素與水平見表1，每組試驗(yàn)平行重復(fù)三次.

1.2.5 高效液相試驗(yàn)方法

將不同溶劑提取下牛樟芝菌絲體粗提物，用甲醇配制成100 mg·mL-1溶液，0.45 μm有機(jī)膜過濾，使用Agilen ORBAX SB-C18色譜柱9.4×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），洗脫梯度：0～60 min，30%～100%A；流速：3 mL·min-1；波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL.

1.2.6 牛樟芝菌絲體抗氧化活性測定

通過樣品對DPPH自由基清除能力、總還原能力和抗氧化能力綜合指數(shù)對不同提取方式下樣品的抗氧化活性進(jìn)行綜合評價(jià).參照范琳等［15］的方法，通過牛樟芝樣品對DPPH自由基清除的IC50值評價(jià)牛樟芝抗氧化活性，數(shù)值越小表示其清除能力越強(qiáng)反之越弱.將不同提取方式下牛樟芝粗提物用95%乙醇稀釋成1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.062 5 mg·mL-1、0.031 3 mg·mL-1、0.015 6 mg·mL-1樣品溶液，以VC（0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.003 9 mg·mL-1、0.007 8 mg·mL-1、0.015 6 mg·mL-1、0.031 3 mg·mL-1）作為陽性對照，在96孔板中加入不同濃度待測樣品溶液100 μL，再分別加入100 μL的95%乙醇配制的DPPH（0.1 mmol·mL-1）溶液，搖勻置室溫避光反應(yīng)30 min，以95%乙醇代替樣品作為對照，使用酶標(biāo)儀在517 nm波長處測定樣品吸光度.每個處理平行測定3次.使用公式（2）計(jì)算樣品對DPPH自由基清除率，根據(jù)牛樟芝樣品濃度與清除率計(jì)算樣品IC50值（清除率為50%時(shí)對應(yīng)樣品濃度）.

清除率=1-D1-D2D×100%（2）

式（2）中：D1為樣品與DPPH混合溶液吸光值，D2為95%乙醇代替DPPH吸光值，D為乙醇代替樣品吸光值.

采用鐵氰化鉀顯色法進(jìn)行總還原能力測定，參照楊玲等［16］的方法，將不同提取條件下的牛樟芝粗提物用95%乙醇稀釋成2 mg·mL-1樣品溶液，以VC（2 mg·mL-1）作為陽性對照進(jìn)行測定.取不同處理樣品溶液100 μL于2 mL試管中分別加入100 μL的0.2 mol·L-1的PBS緩沖液和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃水浴下反應(yīng)20 min后冷卻，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸放入離心機(jī)離心（4 000 r/min），取100 μL上清液于96孔板中加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵溶液，混合均勻后在酶標(biāo)儀700 nm波長處測定吸光值.使用公式（3）計(jì)算樣品的總還原能力，每個處理平行測定3次.

總還原力=A1-A0（3）

式（3）中：A1為樣品吸光度，A0為蒸餾水代替樣品吸光值，結(jié)果數(shù)值越大總還原能力越好.

通過抗氧化能力綜合指數(shù)對樣品的抗氧化活性進(jìn)行綜合評價(jià)，抗氧化能力綜合指數(shù)為樣品的DPPH清除能力指數(shù)和總還原能力指數(shù)兩者的平均值.抗氧化能力綜合指數(shù)計(jì)算參照考Seeram等［17］的方法.將DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的樣品的清除能力指數(shù)定義為100，按照公式（4）分別計(jì)算其余樣品的DPPH自由基清除能力指數(shù).定義總還原能力最強(qiáng)的樣品的總還原能力指數(shù)為100，按照公式（5）計(jì)算其余樣品的總還原能力指數(shù).

自由基清除能力指數(shù)=IC50，b/IC50，s×100（4）

式（4）中：IC50，S為樣品的IC50值，IC50，b為自由基清除能力最強(qiáng)的樣品的IC50值.

總還原能力指數(shù)=AS/Ab×100%（5）

式（5）中：As為樣品的總還原能力，Ab為樣品中最高的總還原能力.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用WPS Office 2020和SPSS 23.0軟件［18］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析及LSD多重比較法進(jìn)行各處理間的差異顯著性分析（P＜0.05），圖表中小寫字母代表不同處理在P＜0.05水平差異顯著.各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 牛樟芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制牛樟芝總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示，所得標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為y=0.004 2x + 0.102 4（R2=0.998 1）.每個處理平行測定3次.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溶劑對牛樟芝總?cè)坪坑绊?/p>

目前，對于牛樟芝的提取中所用提取溶劑多為甲醇或乙醇，然而不同提取溶劑極性不同，溶解性也不同，導(dǎo)致提取效果存在較大差異，因此選取合適的提取溶劑進(jìn)行工藝優(yōu)化具有重要意義，合適提[JP3]取溶劑能使目標(biāo)產(chǎn)物充分提取，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物得率，減少損失.本試驗(yàn)按照液料比1∶160 g·mL-1分別加入甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液，25 ℃提取5 h，主要考察提取溶劑對牛樟芝總?cè)频寐视绊?結(jié)果如圖2所示，通過差異顯著性分析，二氯甲烷與其余溶劑處理相比牛樟芝總?cè)频寐示嬖陲@著差異（P＜0.05）.不同提取溶劑對牛樟芝總?cè)频寐视绊懖煌瑥男〉酱笠来螢椋憾燃淄椋颈炯状迹疽宜嵋阴ィ救燃淄椋?5%乙醇，不同提取溶劑極性不同，使得牛樟芝中總?cè)迫芙舛炔煌?，提取溶液極性與牛樟芝所含三萜極性相似則有利于溶出［19］.當(dāng)提取溶劑為二氯甲烷、丙酮和甲醇時(shí)牛樟芝總?cè)迫艹鲚^高.

2.2.2 提取液料比對牛樟芝總?cè)坪坑绊?/p>

牛樟芝菌絲體粉末與甲醇按照液料比1∶40 g·mL-1、1∶80 g·mL-1、1∶160 g·mL-1、1∶320 g·mL-1、1∶640 g·mL-1、1∶1 280 g·mL-1混合均勻，25 ℃提取5 h，主要考察提取液料比對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐视绊?結(jié)果如圖3所示，通過差異顯著性分析，液料比1∶640 g·mL-1與其余處理相比牛樟芝總?cè)频寐示嬖陲@著差異（P＜0.05）.隨著液料比增加牛樟芝總?cè)瞥尸F(xiàn)先上升后下降趨勢，在液料比1∶40 g·mL-1到1∶640 g·mL-1之間，總?cè)坪侩S液料比增加而增加，液料比增加提升牛樟芝粉末與提取溶劑濃度差，增加接觸有利于牛樟芝總?cè)瞥煞窒蛉軇┲袛U(kuò)[JP5]散.當(dāng)液料比大于1∶640 g·mL-1時(shí)，牛樟芝得率不再增加并開始下降，其原因可能是在1∶640 g·mL-1時(shí)大部分牛樟芝總?cè)埔呀?jīng)提取出，繼續(xù)增加的液料比增加溶液中非目標(biāo)產(chǎn)物并導(dǎo)致稀釋效應(yīng)，使得牛樟芝總?cè)频寐氏陆担?0］.

2.2.3 提取溫度對牛樟芝總?cè)坪坑绊?/p>

牛樟芝菌絲體按照1∶160 g·L-1與甲醇混合均勻，在溫度為10 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃提取5 h，主要考察提取溫度對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐视绊?，結(jié)果如圖4所示，通過差異顯著性分析，不同提取溫度處理間均存在顯著差異（P＜0.05）.在試驗(yàn)范圍內(nèi)牛樟芝總?cè)频寐孰S著溫度升高而升高并趨于平緩，溫度升高促進(jìn)分子運(yùn)動，加快擴(kuò)散速度提高擴(kuò)散能力，低溫不利于三萜化合物溶出，而過高溫度會破壞三萜化合物結(jié)構(gòu)或?qū)е缕渌煞秩艹鲇绊懩繕?biāo)產(chǎn)物含量［21］.

2.2.4 提取時(shí)間對牛樟芝總?cè)坪坑绊?/p>

牛樟芝菌絲體粉末與甲醇按照1∶160 g·L-1混勻，25 ℃提取0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，主要考察提取時(shí)間對牛樟芝菌絲體總?cè)频寐视绊?結(jié)果如圖5所示，通過差異顯著性分析，0.5和1 h與其余處理間均存在顯著差異（P＜0.05），其余處理之間差異不顯著.隨著提取時(shí)間增加牛樟芝總?cè)频寐首兓厔轂橄壬吆笾饾u下降趨勢.在5 h之前，隨著提取時(shí)間增加總?cè)坪恐饾u增加，牛樟芝粉末與提取溶劑接觸時(shí)間提升有利于牛樟芝總?cè)迫艹觯? h時(shí)達(dá)最大值，之后再延長提取時(shí)間，牛樟芝總?cè)凭徛陆?，其原因可能是隨著時(shí)間延長提取溶液趨于飽和，導(dǎo)致一定程度析出［22］.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

三萜類化合物被認(rèn)為是牛樟芝中重要的藥用活性成分，因此本試驗(yàn)以總?cè)频寐蕿樵u價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行牛樟芝總?cè)铺崛」に噧?yōu)化.根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知時(shí)間對牛樟芝總?cè)频寐视绊懨黠@小于另外三個因素，因此在正交試驗(yàn)中選取提取溶劑（A），液料比（B），溫度（C）三個因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察其對牛樟芝總?cè)频寐视绊?，試?yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示.

由表2可知，對牛樟芝總?cè)频寐视绊懸蛩卮笮№樞蛞来螢椋禾崛∪軇ˋ）＞液料比（B）＞溫度（C），最佳提取工藝為A2B2C2，即牛樟芝菌絲體粉末以二氯甲烷為提取溶劑，液料比1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h，在此條件下，牛樟芝總?cè)频寐瘦^其余處理提高5.13倍（組合7）～0.73倍（組合6）.由表3可知，三個因素對于牛樟芝總?cè)频寐视绊懢催_(dá)顯著水平.黃紅雨等［23］和鄧春萌等［24］對牛樟芝提取工藝優(yōu)化，三萜得率為3.43%～5.26%.本試驗(yàn)中通過工藝優(yōu)化，牛樟芝總?cè)频寐蕿?0.16%，顯著高于前人研究，前人研究中多采用甲醇或乙醇提取，而本試驗(yàn)中篩選出的最佳提取溶劑為二氯甲烷.

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝為A2B2C2，即牛樟芝菌絲體粉末以二氯甲烷為提取溶劑，液料比1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h，對此提取條件進(jìn)行6組平行試驗(yàn)，牛樟芝菌絲體總?cè)频寐蕿?0.16±0.077 6%，與正交試驗(yàn)10.11%相符，具有較好重復(fù)性.

2.5 抗氧化能力

2.5.1 DPPH自由基清除能力

不同提取方式下粗提物對DPPH自由基清除能力以IC50值表示，值越小表示清除能力強(qiáng)，以VC作為陽性對照.對正交試驗(yàn)9個不同組合方式所得粗提物分別進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果如表4、圖6所示.由表4可知，不同處理下粗提物清除能力均低于陽性對照，通過差異顯著性分析，VC陽性對照和組合7與其余提取組合方式下DPPH自由基清除能力（IC50）存在顯著差異（P＜0.05）.在不同組合間，組合5的IC50最小為0.137 6，表明其對DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其DPPH自由基清除能力較其余組合處理提高4.50倍組合7）～0.21倍組合6）.由圖6可知，隨著樣品濃度增加清除能力也隨之加強(qiáng)，呈多項(xiàng)式函數(shù)關(guān)系，當(dāng)測量濃度為1 mg·mL-1時(shí)，不同提取方式下清除率達(dá)76.24%（組合7）～97.53%（組合6）之間，以上結(jié)果表明牛樟芝菌絲體具有較好DPPH清除能力.

2.5.2 總還原能力

采用鐵氰化鉀顯色法測定樣品對Fe3+的還原能力是評價(jià)樣品抗氧化能力的常用指標(biāo)之一，以VC為陽性對照，測定不同提取方式下牛樟芝總還原能力.不同提取方式下牛樟芝總還原能力均低于VC（394%）對照.經(jīng)差異顯著性分析，組合5和組合6與其余組合處理間牛樟芝總?cè)拼嬖陲@著差異（P＜0.05），其余處理之間差異不顯著.不同提取組合的總還原能力結(jié)果如圖7所示，當(dāng)提取溶劑為二氯甲烷時(shí)總還原能力顯著高于其余處理溶劑，其中組合5總還原能力最高達(dá)58.03%，高于其余處理組合47.84倍（組合7）～0.02倍（組合6）.

2.5.3 抗氧化能力綜合指數(shù)比較

通過抗氧化能力綜合指數(shù)對不同提取方式下樣品的抗氧化活性進(jìn)行綜合評價(jià)，結(jié)果如圖8所示.

經(jīng)差異顯著性分析組合5、組合6和組合7與其余組合處理間均存在顯著差異（P＜0.05），其余處理之間差異不顯著.由圖8可知，對比抗氧化能力綜合指數(shù)可知，牛樟芝粗提物抗氧化活性大小為：組合5＞組合6＞組合4＞組合3＞組合2＞組合9＞組合1＞組合8＞組合7.牛樟芝粗提物抗氧化活性均以二氯為提取溶劑時(shí)最高，其中組合5最高，組合6次之，且組合5為正交試驗(yàn)中篩選最佳提取工藝組合.這可能是因?yàn)槎燃淄樘崛〉拇痔嵛锟側(cè)坪扛哂谄溆嗳軇┨崛〉拇痔嵛?，以及二氯甲烷更有利于抗氧化活性成分提?汪雯翰等［25］研究中發(fā)現(xiàn)牛樟芝二氯甲烷萃取物對于過氧化氫清除能力優(yōu)于石油醚與正丁醇.

2.5.4 牛樟芝總?cè)坪颗c抗氧化活性的相關(guān)性

牛樟芝總?cè)坪颗c抗氧化活性的相關(guān)性如表5所示.由表5可知，牛樟芝總?cè)坪颗cDPPH自由基清除能力、總還原能力和抗氧化能力綜合指數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=1，P＜0.01）.表明三萜含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)，已有大量研究表明三萜類化合物具有較好的抗氧化作用［26］.常超等［27］研究發(fā)現(xiàn)日本莢蒾果實(shí)提取物對DPPH自由基清除能力隨其三萜含量增加而升高.夏必幫等［28］對桂花精油研究表明三萜類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化能力.趙玲艷等［29］對枸骨抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，枸骨的抗氧化能力來源于由于其體內(nèi)富含的枸骨三萜皂苷.三萜成分能夠提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，這些酶參與消除有害的活性氧，從而抑制氧化反應(yīng)，起到抗氧化作用［30，31］.本試驗(yàn)中提取工藝優(yōu)化顯著提高了牛樟芝總?cè)坪?，繼而增強(qiáng)其抗氧化活性.

2.5.5 高效液相結(jié)果分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇甲醇（MeOH）、二氯甲烷（DCM）、丙酮（PA）三種提取溶劑的最優(yōu)提取條件進(jìn)行牛樟芝提取，并通過高效液相分析不同提取處理間的物質(zhì)成分差異.三種提取溶劑的最優(yōu)條件分別為：甲醇，液料比1∶640 g·mL-1，45 ℃，提取5 h；二氯甲烷，1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h；丙酮，1∶640 g·mL-1，55 ℃提取5 h，其結(jié)果如圖9所示.

由圖9可知，不同處理下牛樟芝粗提物的成分豐富程度依次為：二氯甲烷提?。颈崛。炯状继崛?，且以二氯甲烷為提取溶劑，所得粗提物的成分含量及豐富程度明顯優(yōu)于其余兩種提取溶劑.在2.9 min檢測出現(xiàn)第一個高峰面積大小為：DCM提?。綧eOH提?。綪A提取，其中DCM粗提物檢測出的峰面積較MeOH和PA粗提物分別提高了12.7倍和1.10倍.隨后檢測出的物質(zhì)峰面積為：DCM提?。綪A提?。綧eOH提取，其中7.5 min檢測出的第二個高峰中DCM粗提物檢測出的峰面積較PA和MeOH粗提物分別提高了1.26倍和12.90倍.30 min前，MeOH粗提物的峰值主要出現(xiàn)在此時(shí)間段，主要為中小極性物質(zhì)；30 min后所出現(xiàn)峰多為DCM和PA粗提物特有，表明DCM和PA能提取更多中大極性化合物.從HPLC分析結(jié)果得知，二氯甲烷為最佳提取溶劑.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以總?cè)频寐蕿樵u價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行牛樟芝總?cè)铺崛」に噧?yōu)化，選取不同提取溶劑、溫度、時(shí)間、液料比四個因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn).本研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝總?cè)频淖顑?yōu)提取工藝為：二氯甲烷提、液料比1∶320 g·mL-1、45 ℃提取5 h，在此條件下，顯著提高了牛樟芝總?cè)频寐?，總?cè)频寐蔬_(dá)10.16±0.077 6%，通過HPLC分析，所得粗提物的成分含量和豐富度顯著高于其余處理，且具有良好抗氧化活性，DPPH清除能力IC50值達(dá)0.137 6，總還原能力達(dá)58.03%.本研究結(jié)果為牛樟芝提取、化合物分離及開發(fā)利用提供參考.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160736）； 云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（202101BD070001-020）； 云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（202101AT070044）； “興滇英才支持計(jì)劃”青年人才專項(xiàng)項(xiàng)目（XDYC-QNRC-2022-0245）.

作者簡介：鄭洋群（1998—），女，貴州銅仁人，在讀碩士研究生，研究方向：植物生理生態(tài)和藥食用菌學(xué)

通訊作者：鄭 元（1982—），男，云南昆明人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物生理生態(tài)和藥食用菌學(xué)，m19969240964@163.com