王一波 孫泓希 史普想 孫繼軍 韓寧 任亮 張麗麗 王海新

王一波，孫泓希，史普想，等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在農(nóng)業(yè)病害檢測(cè)中的應(yīng)用綜述［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：17-24.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.003（遼寧省沙地治理與利用研究所，遼寧阜新 123000）

摘要：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理是當(dāng)溫度為60～65 ℃時(shí)，DNA處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，DNA雙鏈打開，此時(shí)依賴Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，使DNA可以在60～65 ℃的恒溫下進(jìn)行合成。其擴(kuò)增引物是基于靶基因的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增階段需要引物與樣品DNA完全結(jié)合，才可以進(jìn)行擴(kuò)增，所以LAMP技術(shù)具有高特異性與高靈敏性。其反應(yīng)溫度恒定，不需要額外的控溫設(shè)備，理想條件下僅需保溫杯，即可進(jìn)行DNA擴(kuò)增。在田間檢測(cè)時(shí)，只需提取樣品總DNA，即可于田間進(jìn)行病害檢測(cè)，縮短了檢測(cè)流程及時(shí)間，使病害檢測(cè)更高效更便捷。在反應(yīng)前或反應(yīng)后加入特定染色劑，即可通過(guò)染色劑的變色情況進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的判定，使反應(yīng)結(jié)果可視化。目前該技術(shù)已憑借其特異性高、靈敏性高、所用儀器簡(jiǎn)單（恒溫水浴鍋或保溫杯即可）、檢測(cè)效率高和檢測(cè)結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物檢測(cè)、食品微生物檢測(cè)、環(huán)境微生物檢測(cè)、植物或微生物基因鑒定等領(lǐng)域。在農(nóng)業(yè)病害的病原微生物（真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲）快速檢測(cè)和診斷領(lǐng)域，已有很多研究針對(duì)各種病害建立了相應(yīng)的LAMP檢測(cè)技術(shù)。本文簡(jiǎn)要綜述了LAMP技術(shù)原理、反應(yīng)結(jié)果判定、優(yōu)缺點(diǎn)和該技術(shù)目前在農(nóng)業(yè)常見(jiàn)病原物檢測(cè)中的應(yīng)用，并對(duì)LAMP技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了進(jìn)一步的展望。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；農(nóng)業(yè)病害；檢測(cè)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S431.9；S432.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：1002-1302（2024）07-0017-07

傳統(tǒng)的病害檢測(cè)和鑒定，主要依據(jù)科赫法則，對(duì)病原菌進(jìn)行分離回接鑒定，但這種方法會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力，同時(shí)要求實(shí)驗(yàn)人員具有很高的操作技能和知識(shí)儲(chǔ)備［1］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展出多種病害鑒定技術(shù)，比如熒光定量PCR、巢氏PCR、多重PCR等［2-4］。原理是使用特異性引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增，以PCR反應(yīng)結(jié)果鑒定病害，但這些基于PCR原理的檢測(cè)方法都需要依賴昂貴的控溫設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間較傳統(tǒng)檢測(cè)雖然大大縮短，但仍然需要較長(zhǎng)的時(shí)間，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能也有一定要求，這些原因限制了PCR檢測(cè)在基層的大范圍應(yīng)用。因此，各種不需要依賴控溫設(shè)備的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被發(fā)明出來(lái)，目前成熟的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有很多，比如基于核酸序列的擴(kuò)增（NASBA，也稱為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增，TMA）、解旋酶依賴性擴(kuò)增（HDA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、多重置換擴(kuò)增（MDA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和鏈置換擴(kuò)增（SDA）［5-11］。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的普遍優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)低廉、對(duì)DNA質(zhì)量要求低。但是，NASBA技術(shù)的檢測(cè)時(shí)間一般在2 h左右［12］；HDA技術(shù)因?yàn)榻庑傅臄U(kuò)增速度和連續(xù)性限制，只能擴(kuò)增相對(duì)小的片段［13］；RPA技術(shù)有時(shí)會(huì)有非特異性擴(kuò)增［14］；RCA技術(shù)的靈敏性也較低，同時(shí)反應(yīng)進(jìn)行前需要熱變性步驟［15］；MDA技術(shù)對(duì)基因中的高GC區(qū)域敏感，容易造成擴(kuò)增不均勻，同時(shí)嵌合體和非特異擴(kuò)增現(xiàn)象也比較嚴(yán)重［9］；SDA技術(shù)也是只能擴(kuò)增較短的片段，同時(shí)也需要熱變性步驟［16］。而LAMP技術(shù)因其高特異性、高靈敏性、檢測(cè)時(shí)間適當(dāng)、可以擴(kuò)增較長(zhǎng)的基因片段等綜合優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物檢測(cè)、食品微生物檢測(cè)、環(huán)境微生物檢測(cè)、植物或微生物基因鑒定等領(lǐng)域［11］。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害的病原生物快速檢測(cè)和診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文就該技術(shù)的原理、方法及已有的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 LAMP 技術(shù)特點(diǎn)及原理

2000年，日本學(xué)者報(bào)道了一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理是DNA在60～65 ℃的環(huán)境內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在這種環(huán)境下，DNA雙鏈打開，依賴Bst DNA聚合酶的鏈置換活性和特異性引物，使DNA可以在60～65 ℃進(jìn)行合成并不停地自我循環(huán)［17］。其特異性引物是基于靶基因序列的6個(gè)不同位點(diǎn)特殊設(shè)計(jì)而成的2對(duì)引物（內(nèi)、外引物），其中2條內(nèi)引物分別是由2個(gè)DNA片段鏈接而成的。此外還可以設(shè)計(jì)額外的環(huán)引物，其通過(guò)在反應(yīng)過(guò)程中與中間產(chǎn)物的頸環(huán)結(jié)構(gòu)雜交，進(jìn)而加快反應(yīng)速率（圖1）［18］。

LAMP反應(yīng)過(guò)程可以分為3個(gè)階段：首先起始物合成階段，DNA在所有引物和Bst聚合酶的作用下，合成并形成啞鈴狀DNA，作為下一階段的模板；隨后進(jìn)入環(huán)擴(kuò)增階段，在內(nèi)引物和聚合酶的作用下，合成并形成發(fā)卡狀DNA，并作為下一階段的模板；最后進(jìn)入延伸和循環(huán)擴(kuò)增階段，由之前形成的DNA模板，在內(nèi)引物和聚合酶的作用下，最終合成長(zhǎng)短不同的莖環(huán)狀DNA組成的混合物。

1.2 LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)

LAMP技術(shù)的關(guān)鍵在于靶基因的選擇和篩選特異性引物。根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)的不同，選擇不同保守程度的靶基因。例如，檢測(cè)同屬不同種的病害，選擇在種內(nèi)高度保守而在種間有足夠差異的靶基因；檢測(cè)同屬同種但是不同亞種的病害，則需要選擇各個(gè)亞種間有足夠差異的靶基因。引物設(shè)計(jì)一般采用由日本榮研株式會(huì)社開發(fā)的PrimerExplorer v5（http：//primerexplorer.jp/e/）在線設(shè)計(jì)引物，若輸入的DNA片段超過(guò)2 000 bp會(huì)報(bào)錯(cuò)。LAMP技術(shù)反應(yīng)過(guò)程中主要擴(kuò)增的DNA片段是F2位點(diǎn)的5′末端到B2位點(diǎn)的5′末端，引物設(shè)計(jì)要求這段DNA片段一般是在120～160 bp，因此LAMP引物設(shè)計(jì)完成后，反應(yīng)最長(zhǎng)擴(kuò)增片段（F3位點(diǎn)5′末端到B3位點(diǎn)5′末端）約為300 bp。靶基因一般不超過(guò) 500 bp，即可獲得多套引物。若靶基因過(guò)長(zhǎng)（1 000 bp），會(huì)生成過(guò)多套引物，增加引物篩選的難度及試驗(yàn)工作量。引物分別為雙向內(nèi)引物（FIP、BIP）和雙向外引物（F3、B3）。其中正向內(nèi)引物FIP由F2區(qū)和F1c區(qū)組成，反向內(nèi)引物BIP由B1c（B1區(qū)反向互補(bǔ)序列）和B2區(qū)域組成。相比于PCR引物設(shè)計(jì)，LAMP引物要考慮的因素更多，要求更高。一般要求F1c和B1c的Tm值相較于F2、F3、B2、B3的Tm值高 5 ℃ 較好。引物末端的穩(wěn)定性由自由能改變值（ΔG）來(lái)衡量，一般要求引物末端的ΔG小于或等于-4 kcal/mol，其中F2、B2、F3、B3為3′端，F(xiàn)1c、B1c為5′端。另外，設(shè)計(jì)的引物自身或引物間要求不能形成2級(jí)結(jié)構(gòu)。

Nagamine等發(fā)現(xiàn)，在LAMP反應(yīng)體系中加入環(huán)引物（LF、LB）能夠明顯加快反應(yīng)速度，提高檢測(cè)效率［18］。因此，若對(duì)檢測(cè)效率有較高要求，可以通過(guò)PrimerExplorer v5另行設(shè)計(jì)環(huán)引物，并加入反應(yīng)體系中。

1.3 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系中一般涉及引物、Bst DNA聚合酶、DNA擴(kuò)增緩沖液、dNTP、甜菜堿、Mg2SO4和水等條件要素。通常需要對(duì)引物及其濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、甜菜堿和Mg2+最適濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。引物設(shè)計(jì)的不同、DNA質(zhì)量差異等因素，均會(huì)對(duì)LAMP體系中各組分的最優(yōu)濃度、反應(yīng)溫度及時(shí)間造成影響，所以對(duì)以上這些條件均需要逐一優(yōu)化。

1.4 LAMP 反應(yīng)結(jié)果的判定

1.4.1 肉眼觀察法

LAMP反應(yīng)過(guò)程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子，會(huì)與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，從而產(chǎn)生乳白色焦磷酸鎂沉淀（圖2-A）。所以在理想的條件下，可以通過(guò)用肉眼觀察反應(yīng)管中是否有白色沉淀來(lái)判斷結(jié)果。若能觀察到白色沉淀，則反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。但大多數(shù)情況下，檢測(cè)過(guò)程并不能達(dá)到最理想的條件，導(dǎo)致焦磷酸鎂沉淀較少，白色沉淀不明顯，通過(guò)肉眼判定反應(yīng)結(jié)果會(huì)造成較大的人為誤差，所以一般通過(guò)其他方法來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果［19］。

1.4.2 染色檢測(cè)法

該方法是LAMP反應(yīng)結(jié)果判定最常用的方法，依據(jù)染色劑顏色變化判定反應(yīng)結(jié)果（圖2-B至圖2-H）。根據(jù)染色劑是否會(huì)干擾LAMP反應(yīng)過(guò)程，染色劑可分為反應(yīng)前加入和反應(yīng)后加入2類。最常使用的染料SYBR Green Ⅰ，通過(guò)結(jié)合雙鏈DNA發(fā)出綠色熒光，普遍認(rèn)為如果在反應(yīng)前加入到反應(yīng)體系中，會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行，若模板DNA含量過(guò)低，有可能造成假陰性結(jié)果，所以SYBR Green Ⅰ一般于反應(yīng)后加入。目前常用的染色劑類別及顯色結(jié)果見(jiàn)表1。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳法

LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物是多種長(zhǎng)短不一的莖環(huán)狀DNA組成的混合物，在經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后，會(huì)呈現(xiàn)典型的梯型狀條帶，所以可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后典型條帶的有無(wú)（圖2-I），判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性［21］。

1.4.4 儀器檢測(cè)法

目前已經(jīng)有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀的儀器，通過(guò)對(duì)體系中濁度的實(shí)時(shí)檢測(cè)和記錄，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，根據(jù)濁度變化繪制擴(kuò)增曲線（圖2-J），可以據(jù)此判斷反應(yīng)結(jié)果［24］。

另外，還可以在LAMP反應(yīng)體系中加入對(duì)反應(yīng)影響較小的熒光染料，例如EvaGreen（Biotium），使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，即可得到LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線（圖2-K），據(jù)此判斷檢測(cè)結(jié)果［25］。這種方法的缺點(diǎn)是，所用的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，也無(wú)法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.4.5 試紙條法

將LAMP引物進(jìn)行修飾，結(jié)合側(cè)流層析試紙條，即可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的試紙條可視化（圖2-L）。但是試紙條價(jià)格昂貴，并且對(duì)引物進(jìn)行進(jìn)一步修飾的價(jià)格也很昂貴。因此，試紙條法判定反應(yīng)結(jié)果在LAMP技術(shù)中使用得較少［26］。

1.5 LAMP技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

最主要的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)：引物設(shè)計(jì)是基于靶標(biāo)基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出特異性引物，檢測(cè)時(shí)，2對(duì)引物必須全部匹配才能夠進(jìn)行擴(kuò)增，從而避免了非特異擴(kuò)增；（2）靈敏度高：一般情況下，LAMP技術(shù)的檢測(cè)靈敏度比PCR高10倍；（3）儀器設(shè)備簡(jiǎn)單：一般不需要PCR儀等控溫設(shè)備，僅用能維持恒溫的設(shè)備（水浴鍋等）即可實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增；（4）檢測(cè)效率高：通常LAMP反應(yīng)在1 h內(nèi)完成；（5）結(jié)果可視化：檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)加入各種顯色劑，通過(guò)顏色改變進(jìn)行結(jié)果判定。

但是也存在不足：

（1）易造成假陽(yáng)性：當(dāng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果，或者開蓋加入熒光染料觀察結(jié)果時(shí)，極易產(chǎn)生氣溶膠污染，影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果，使假陽(yáng)性的概率變高；（2）引物要求高：靶基因選擇及引物篩選極為繁瑣；（3）不能進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)：LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物為不同片段大小的莖環(huán)DNA混合物，因此不能進(jìn)行測(cè)序和克隆等試驗(yàn)。

2 LAMP技術(shù)在農(nóng)業(yè)病害檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 真菌檢測(cè)

植物中78%～80%病害是真菌病害，真菌病害危害重、分布廣，快速檢測(cè)植物病原真菌的技術(shù)能有助于大大提高植物真菌病害的防治效率同時(shí)降低農(nóng)業(yè)成本。目前關(guān)于植物真菌病害相關(guān)的LAMP檢測(cè)技術(shù)蓬勃發(fā)展，每年都有大量的真菌病害LAMP檢測(cè)技術(shù)被報(bào)道。

比較常見(jiàn)的是通過(guò)染色檢測(cè)法，直接于田間進(jìn)行病害檢測(cè)，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。例如針對(duì)曲霉（Aspergillus spp.）建立的特異性LAMP檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合了便攜設(shè)備并使檢測(cè)結(jié)果可視化，一個(gè)反應(yīng)最低能夠檢測(cè)到10個(gè)分生孢子的病菌［27］；針對(duì)疫霉（Phytophthora spp.）建立的特異性LAMP檢測(cè)技術(shù)，以HNB作為染色劑，并且最低能夠檢測(cè)到 1 μg/L 的病原菌DNA［28］；針對(duì)腐霉（Pythium spp.）建立的玉米莖腐病LAMP檢測(cè)技術(shù)，同樣以HNB為染色劑，且最低能檢測(cè)到10 μg/L的病原菌DNA［29］；針對(duì)小麥白粉菌（Erysiphales）建立的特異性LAMP檢測(cè)技術(shù)，以鈣黃綠素為染色劑，最低能檢測(cè)到 0.3 μg/L 的病原菌DNA［30］。這些LAMP檢測(cè)技術(shù)完成現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)無(wú)需分離真菌與植物的DNA，直接進(jìn)行總DNA粗提后即可進(jìn)行病害檢測(cè)，且檢測(cè)限可達(dá)到10-9 mg級(jí)甚至10-12 mg級(jí)，其靈敏度遠(yuǎn)高于普通PCR方法。

但是在田間檢測(cè)時(shí)，很多植物組織提取DNA時(shí)常常帶有很多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)降低DNA質(zhì)量，也有的雜質(zhì)會(huì)干擾LAMP反應(yīng)進(jìn)程，最終會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，這是限制LAMP檢測(cè)效率的一大難題。因此有些LAMP技術(shù)會(huì)配套合適的DNA提取方法，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如針對(duì)蘋果樹腐爛病菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)同樣配套了田間快速DNA提取方法，能夠在田間得到純度較高的DNA，進(jìn)而得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果；以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到1 mg/L的病原菌DNA，一個(gè)反應(yīng)最低能檢測(cè)到10個(gè)分生孢子的病菌［11］。

2.2 細(xì)菌的檢測(cè)

針對(duì)細(xì)菌病害建立LAMP檢測(cè)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，因?yàn)楦锾m氏陰性菌在環(huán)境溫度過(guò)高時(shí)，細(xì)菌就會(huì)死亡進(jìn)而裂解，其DNA會(huì)自然暴露出來(lái)；在針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌建立LAMP檢測(cè)時(shí)，也需考慮DNA提取問(wèn)題，為了提高方法的靈敏度，核酸仍然需要分離和純化。

目前針對(duì)不同的細(xì)菌病害，已經(jīng)建立了很多對(duì)應(yīng)的LAMP檢測(cè)技術(shù)。例如針對(duì)馬鈴薯黑脛病菌建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到10 CFU/mL 病原菌或0.1 μg/L的病原菌DNA［31］；針對(duì)瓜類細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）和番茄細(xì)菌性潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，Cmm）的環(huán)LAMP檢測(cè)技術(shù)，[JP3]以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低分別能夠檢測(cè)到1.72×102 fg/L[JP]的Aac和0.126 μg/L的Cmm［32］；針對(duì)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)，分別對(duì)獼猴桃葉片、樹皮、[JP2]花粉等樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到100 CFU/mL[JP]的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌［33］；針對(duì)方中達(dá)迪克氏菌建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)，以SYBR GreenⅠ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到0.1 μg/L的病原菌DNA，而且能夠在多種植物上進(jìn)行該細(xì)菌的檢測(cè)［34］。

2.3 病毒的檢測(cè)

RNA病毒占植物病毒絕大多數(shù)，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR需先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR檢測(cè)。而LAMP技術(shù)可以通過(guò)在反應(yīng)體系內(nèi)加入逆轉(zhuǎn)錄酶，從而同步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及LAMP反應(yīng)，所以LAMP技術(shù)在植物病毒病害的檢測(cè)中有更廣泛的使用。最早于2003年，F(xiàn)ukuta等以RNA為模板，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和LAMP反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了對(duì)日本紅薯花葉病毒的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)觀察焦磷酸鎂沉淀來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果［35］。隨著各種不同染色劑的應(yīng)用，RT-LAMP技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用，如2020年，針對(duì)馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus，PLRV）建立了RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到5 μg/L的病原菌DNA［36］；2021年，針對(duì)玫瑰蓮座叢病毒（rose rosette virus，RRV）建立了RRV的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，以HNB為染色劑，最低能夠檢測(cè)到 1 μg/L 的病原菌DNA［37］。

2.4 線蟲的檢測(cè)

農(nóng)業(yè)線蟲病害一般是土傳病害，造成多種植物的根結(jié)線蟲病。在林業(yè)上也有線蟲侵害樹體，導(dǎo)致樹木無(wú)法成材，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失，因此建立線蟲的LAMP檢測(cè)技術(shù)在生產(chǎn)上有很重要的意義。LAMP檢測(cè)技術(shù)具有便捷性及高效性，能夠隨時(shí)進(jìn)行土壤檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害并進(jìn)行防治。

2016年，魏洪巖等建立了可以檢測(cè)蘋果根結(jié)線蟲（Meloidogyne mali）的LAMP檢測(cè)技術(shù)，以SYBR Green Ⅰ為染色劑和試紙條判定檢測(cè)結(jié)果，最低能夠檢測(cè)到1/20 000條線蟲DNA［38］；2019年，張磊等建立了一種可以快速檢測(cè)M. fallax和M. chitwoodi 2種根結(jié)線蟲的LAMP檢測(cè)方法，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測(cè)到10 μg/L的線蟲DNA［39］。

3 總結(jié)與展望

LAMP 技術(shù)最顯著的優(yōu)勢(shì)在于恒溫?cái)U(kuò)增，不用依賴于昂貴的控溫設(shè)備，而且其反應(yīng)速度快（1 h以內(nèi)完成反應(yīng)）、特異性高、靈敏性高、反應(yīng)結(jié)果判定簡(jiǎn)單，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，田間植物樣品中粗提的DNA即可進(jìn)行反應(yīng)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于地各個(gè)領(lǐng)域的病原生物檢測(cè)和監(jiān)控［40-41］。

對(duì)于LAMP技術(shù)被廣泛詬病的氣溶膠污染問(wèn)題，目前已有一種比較常用的解決辦法，可以在反應(yīng)體系中加入礦物油，用于控制PCR反應(yīng)后的氣溶膠污染，因?yàn)槠涿芏缺人?，而且不?huì)參與反應(yīng)，加入反應(yīng)體系后會(huì)浮在反應(yīng)體系的最上面，從而達(dá)到封閉反應(yīng)的作用［11］。因此，在加入礦物油的LAMP體系，即使反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入熒光染料，也不會(huì)造成氣溶膠污染。

LAMP技術(shù)是一種多用途的技術(shù)，在其基礎(chǔ)上稍加修改，就可以達(dá)到不同的檢測(cè)目的，如加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可進(jìn)行病毒檢測(cè)（reverse transcriptase loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP），加入熒光染料即可進(jìn)行實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)（real-time LAMP）和多套引物聯(lián)用檢測(cè)多種病害的多重LAMP檢測(cè)（multiplex LAMP）。CRISPR/Cas12a是一種RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，廣泛應(yīng)用于基因編輯中，能夠特異性識(shí)別DNA靶序列，并對(duì)其進(jìn)行切割。Wang等通過(guò)聯(lián)用CRISPR/Cas12a和LAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)高特異性的引物，使CRISPR/Cas12a能快速切割LAMP反應(yīng)中間產(chǎn)物，得到單鏈DNA，并結(jié)合側(cè)流層析試紙條，可視化檢測(cè)結(jié)果，使檢測(cè)效率得到進(jìn)一步提升［42］?？傊琇AMP技術(shù)用途廣泛，并可以與多種技術(shù)結(jié)合使用，可以根據(jù)科研任務(wù)的不同，設(shè)計(jì)不同的LAMP檢測(cè)體系，以達(dá)到科研目的。

農(nóng)業(yè)病害檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，還要考慮一個(gè)很重要的因素就是價(jià)格。LAMP檢測(cè)技術(shù)相較于其他檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)就是成本低廉。首先，LAMP檢測(cè)技術(shù)相較于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)，不依賴昂貴的控溫設(shè)備，僅需恒溫水浴鍋或者保溫杯即可完成反應(yīng)，大大降低了檢測(cè)成本。其次，相較于其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，LAMP技術(shù)僅需1種Bst聚合酶，檢測(cè)體系中沒(méi)有昂貴的成分，引物中僅內(nèi)引物需要將2個(gè)DNA片段連接起來(lái)，不需要添加額外的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)來(lái)修飾引物，相比于其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，LAMP檢測(cè)技術(shù)單次檢測(cè)的成本更低。最后，檢測(cè)結(jié)果可以依靠加入的染色劑顏色變化判定，雖然不同的染色劑價(jià)格不同，但因?yàn)槊看稳旧珓┧昧亢苌伲詿o(wú)論使用何種染色劑，平均單次檢測(cè)所需的成本仍然十分低廉。

檢測(cè)技術(shù)正朝著操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、能夠更廣泛應(yīng)用的方向發(fā)展。隨著LAMP技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有很多可以進(jìn)一步使LAMP技術(shù)更廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品被開發(fā)出來(lái)。如最近報(bào)道了一種基于LAMP技術(shù)開發(fā)的可折疊微型檢測(cè)設(shè)備，用于檢測(cè)大米種子中的Magnaporthe oryzae和Sarocladium oryzae［23］。同時(shí)還有很多的便攜的LAMP檢測(cè)設(shè)備被發(fā)明出來(lái)，如 ESE-Quant tube scanner （Qiagen，Netherlands）和 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR system，可以用于進(jìn)行實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)［43］。更有一種超便攜的檢測(cè)設(shè)備（point-of-care kit for the entire test，POCKET），可以使用于LAMP檢測(cè)中，這種設(shè)備僅使用手機(jī)作為加熱源來(lái)維持LAMP反應(yīng)所需的溫度，同時(shí)手機(jī)可以作為信號(hào)采集設(shè)備和結(jié)果讀取設(shè)備［44］。以上這些設(shè)備的出現(xiàn)，大大提升了LAMP技術(shù)的田間應(yīng)用性，進(jìn)一步降低了LAMP技術(shù)的使用要求，為該技術(shù)的更廣泛的應(yīng)用提供了可行性。

總之，LAMP技術(shù)作為一種特異性高、靈敏性高、檢測(cè)效率高、檢測(cè)結(jié)果可視化的新型核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展為能夠與多種新技術(shù)聯(lián)用，配合各種便攜設(shè)備，進(jìn)行更簡(jiǎn)便、更快速、更準(zhǔn)確的田間快速檢測(cè)，LAMP技術(shù)的發(fā)展符合市場(chǎng)的需求，在農(nóng)業(yè)病害檢測(cè)領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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基金項(xiàng)目：遼寧省科技項(xiàng)目（編號(hào)：2021JH/10400034、2022JH2/101300164） 。

作者簡(jiǎn)介：王一波（1994—），男，遼寧沈陽(yáng)人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事花生栽培及病害防控研究研究。E-mail：465910393@qq.com。

通信作者：王海新，研究員，從事花生栽培研究和推廣工作。E-mail：wanghaixin99@163.com。