吳韌,劉爽,馬寬,黃凱,邱順麗,羅黃洋,賀靈芝,唐華麗*

1(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,重慶,404100)2(渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程中心,重慶,404100)

果膠是自然界中資源豐富的天然大分子物質(zhì),廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中,是生物界中最復(fù)雜的大分子之一[1]。同時果膠作為一類復(fù)雜的大分子多糖,其結(jié)構(gòu)一般由三部分組成,一是半乳糖醛酸(galacturonic acid, Gal A)以α-1,4糖苷鍵連接的直鏈多糖聚半乳糖醛酸區(qū)(homogalacturonan region, HG區(qū));二是半乳糖醛酸與L-鼠李糖交替連接構(gòu)成主鏈,再與由D-半乳糖、L-阿拉伯糖構(gòu)成的支鏈共同組成鼠李糖半乳糖醛酸Ⅰ區(qū)(rhamnogalacturonan Ⅰregion, RGⅠ區(qū));三是半乳糖醛酸以α-1,4 糖苷鍵連接的主鏈,和多種中性糖為支鏈組成鼠李糖半乳糖醛 Ⅱ 區(qū)(rhamnogalacturonan Ⅱregion, RGⅡ區(qū))[2]。果膠可以在多種植物中提取,我國豐富的農(nóng)作物也提供了豐富的果膠資源,現(xiàn)今我國的商業(yè)果膠主要來源于蘋果皮渣、柑橘皮渣和甜菜漿[3]。隨著食品加工種類多樣化的發(fā)展,其他種類的副產(chǎn)品也可用于提取果膠,如菠蘿皮渣果膠[4]、西瓜皮果膠[5]、芒果皮果膠[6]、馬鈴薯渣[7]和百香果皮[8]等。然而這些主要集中在實驗室研究階段,并沒有投入工業(yè)生產(chǎn),同時國內(nèi)外豆腐柴果膠的研究較少,并且對其果膠多糖性質(zhì)的研究沒有深入。

豆腐柴,又稱豆腐葉、臭黃荊、觀音柴、腐婢等[9],是馬鞭草科豆腐柴屬的藥食兩用植物,屬于多年生的落葉灌木。廣泛分布于中國東部、中部和南部的山區(qū),野生資源豐富,但對于其開發(fā)有限,經(jīng)濟(jì)價值未得到良好利用[10]。豆腐柴的嫩葉和枝條可以制作凝膠凍,又稱“神仙豆腐”,說明豆腐柴中果膠含量豐富,并具備良好的果膠特性。

乳化技術(shù)是食品生產(chǎn)加工的關(guān)鍵技術(shù)之一,其原理是利用乳化劑降低界面張力來讓兩種互不相溶的液體(食品生產(chǎn)中大部分都為水和油)均一混合[11],形成水包油型或油包水型乳液,食品中典型的乳液體系有蛋黃醬、冰淇淋、人造奶油及軟飲料等[12]。在食品工業(yè)生產(chǎn)中,乳化劑一般分為兩種,一種是小分子表面活化劑,如蔗糖酯、卵磷脂、甘油酯和聚山梨醇酯等,另一種是大分子物質(zhì),常用的如蛋白質(zhì)和一些多糖[13]。

而乳化劑因為其種類的不同,乳化能力與乳液性質(zhì)都不盡相同,其中蛋白質(zhì)和卵磷脂具備良好的乳化能力,制備的乳液粒徑較小,但是受到酸堿和溫度變化的影響較大,缺乏穩(wěn)定性[14-15]。而果膠作為一種酸性陰離子多糖,不僅具有良好的乳化能力,還能形成比較穩(wěn)定的乳液[16-17],目前用于乳化劑商用的果膠主要為柑橘果膠和蘋果果膠,而一些研究又表明柑橘果膠的乳化特性優(yōu)于蘋果果膠[18],因此本研究選取柑橘果膠與豆腐柴果膠進(jìn)行理化性質(zhì)和乳化特性對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐柴葉為重慶雄森實業(yè)有限公司提供。商品柑橘果膠,河南萬邦實業(yè)有限公司;玉米油,金龍魚非轉(zhuǎn)基因玉米胚芽油;其他試劑無特殊說明均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300B超聲清洗儀,昆山超聲儀器有限公司;UV-2450紫外-可見光分光光度計,日本島津公司;ALPH1-2/LD-Plus冷凍干燥機(jī),德國CHRIST公司;Imark酶標(biāo)儀,BIO-RAD公司;熒光倒置顯微鏡,日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆腐柴果膠的提取

本文選取豆腐柴葉于60 ℃下烘干至恒重,粉碎機(jī)粉碎后過60目篩備用,稱取豆腐柴粉末10 g,按料液比(1∶24,g∶mL)投入到pH=6檸檬酸緩沖溶液中,攪拌均勻后進(jìn)行超聲(強(qiáng)度300 Hz,時間70 min,溫度90 ℃[19]),將超聲完的混合物過濾,放入離心機(jī)以5 000 r/min離心15 min,取上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,濃縮后加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃下靜置過夜,取其沉淀,用無水乙醇洗滌2次,冷凍干燥后得到粗果膠。

1.3.2 豆腐柴果膠多糖的純化

將豆腐柴粗果膠溶于蒸餾水,采用Sevag法除去豆腐柴粗果膠中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),然后再用無水乙醇沉淀豆腐柴果膠并冷凍干燥。將去除蛋白質(zhì)后的果膠配制成溶液后采用截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析袋進(jìn)行除鹽,取其袋內(nèi)物質(zhì)配制一定濃度溶液進(jìn)行紫外全光譜掃描,檢驗蛋白質(zhì)和小分子雜質(zhì)去除效率,冷凍干燥收集得到果膠樣品,配制成10 mg/mL的溶液,過0.45 μm的濾膜后,用DEAE-52纖維素柱陰離子交換對豆腐柴果膠進(jìn)行純化,采用去離子水進(jìn)行洗脫,流速為1 mL/min,每10 min收集1管。利用苯酚硫酸法在490 nm處測定洗脫液的多糖含量,合并高峰部分,濃縮、冷凍干燥得豆腐柴果膠多糖純品[20]。

1.3.3 果膠多糖乳液制備

稱量不同質(zhì)量的豆腐柴果膠多糖和柑橘果膠,加入0.2 mg/mL疊氮鈉去離子水,配制一定質(zhì)量濃度(4、8、12、16、20 g/L)的果膠溶液,調(diào)節(jié)溶液pH值為3、5、7備用。然后將果膠溶液與玉米油按照油相不同體積分?jǐn)?shù)(10%、20%、30%、40%、50%)混合。使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行均質(zhì)(超聲強(qiáng)度15 kHz,超聲時間4 min,持續(xù)時間4 s,間隔時間4 s,強(qiáng)度30%,保護(hù)溫度50 ℃)得到新鮮乳液[21],研究果膠質(zhì)量濃度、pH值和油相體積分?jǐn)?shù)對果膠乳化特性的影響。

1.3.4 果膠理化性質(zhì)分析

1.3.4.1 果膠干燥減量測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》,取潔凈玻璃稱量瓶,干燥恒重后將果膠樣品2～10 g置于稱量瓶中,精密稱量后置于101～105 ℃干燥箱中,干燥2～4 h后取出,干燥器中冷卻0.5 h,精密稱量后再重復(fù)干燥1 h直至兩次稱量后質(zhì)量差<2 mg,即為達(dá)到恒重。按公式(1)計算干燥減量。

(1)

式中:m1為稱量瓶和樣品質(zhì)量,g;m2為干燥后稱量瓶和樣品質(zhì)量,g;m3為稱量瓶的質(zhì)量,g。

1.3.4.2 果膠酸不溶灰分測定

參照GB 25533—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 果膠》,稱取果膠樣品1～4 g,用小火緩慢加熱至完全炭化,置于高溫爐,于550～650 ℃下灼燒至恒重。將灼燒渣移入燒杯后加入20 mL HCl溶液,煮沸5 min,用恒重的砂芯漏斗過濾,再用熱水洗滌至濾出物不含Cl-后在干燥箱中干燥至恒重。酸不溶灰分的含量按公式(2)計算。

(2)

式中:X1為酸不溶灰分,%,m1為試樣的質(zhì)量,g;m2為漏斗的質(zhì)量,g;m3為漏斗加酸不溶灰分的質(zhì)量,g。

1.3.4.3 果膠半乳糖醛酸含量測定

參照GB 25533—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 果膠》,精確稱取果膠樣品5 g,加入100 mL HCl-乙醇溶液,攪拌10 min。用干燥至恒重(m0)的砂芯漏斗過濾,真空抽吸濾干后用HCl-乙醇溶液洗滌6次,再用乙醇沖洗至濾出物不含Cl-,最后用無水乙醇沖洗濾干,在105 ℃下干燥2 h,冷卻后稱重(m1)。

準(zhǔn)確稱取1/10干燥后樣品,移入錐形瓶加入2 mL無水乙醇潤濕,加入100 mL新煮沸并冷卻的水,使試樣完全溶解,加入5滴酚酞指示劑,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,滴定至粉紅色30 s不褪色為終點,記錄滴定消耗體積V1,加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,用力振搖后靜置15 min,加入20.0 mL 0.5 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液,振搖至粉紅色消失,然后用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定,用力振搖至弱粉紅色30 s不褪色為終點,記錄下所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V2(皂化滴定度)。半乳糖醛酸含量按公式(3)計算。

(3)

式中:X2為半乳糖醛酸含量,%,m為試樣干燥并去灰分后的總質(zhì)量的1/10,即(m1-m0)/10,mg。

1.3.4.4 果膠酯化度(degree of esterification,DE)的測定

取0.01 g樣品,加入0.1 g NaCl,10 mL水,室溫下攪拌1 h,加入兩滴酚酞試劑,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液顏色變成粉紅色且30 s不變色,即達(dá)終點,記錄下使用的NaOH體積V1。隨后向溶液中加入15 mL 0.25 mol/L NaOH,室溫下攪拌30 min,加入15 mL 0.25 mol/L HCl溶液,充分混勻,再次用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至終點,記錄下使用的NaOH體積V2。通過公式(4)計算得到酯化度。

(4)

1.3.5 果膠乳液乳化性質(zhì)分析

1.3.5.1 果膠質(zhì)量濃度對果膠乳液乳化性質(zhì)的影響

取1.3.3節(jié)中配制的不同濃度果膠溶液在油相20%和pH 5.0條件下制備乳液。果膠的乳化活性(emulsifying activity,EA)與乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ES)參照LIANG等[22]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將新制備的乳化液在3 000 r/min下離心5 min,EA為乳化層高度(HE1)與總液體高度(HW1)的比值,用公式(5)計算。

(5)

測定ES時,先將新制備的乳液在80 ℃下水浴加熱30 min,然后在水中冷卻15 min,再以3 000 r/min 離心5 min,ES為乳化層高度(HE2)與總液體高度(HW2)的比值,用公式(6)計算。

(6)

乳化液的乳析指數(shù)(creaming index,CI)測定參照AHSAN等[23]的方法改進(jìn)后,取固定體積法新鮮制備的乳化液置于帶刻度的試管中,蓋上塞子后,在室溫下貯藏。一段時間后乳化液出現(xiàn)分層現(xiàn)象,上層不透明的為乳脂層,下層透明為乳清層。乳化液總高度(Hw3),下層乳清層高度(HE3)。CI用公式(7)計算。

(7)

1.3.5.2 pH對果膠乳液乳化性質(zhì)的影響

乳液制備條件為果膠質(zhì)量濃度12 g/L,油相體積分?jǐn)?shù)20%,并在加入玉米油之前調(diào)節(jié)pH值為3.0、5.0、7.0。乳化性質(zhì)測定參照1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.3 油相體積分?jǐn)?shù)對果膠乳液乳化性質(zhì)的影響

乳液制備條件為果膠質(zhì)量濃度12 g/L,pH 5.0,油相體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%和50%。乳化性質(zhì)測定參照1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.4 乳化液顯微觀察

乳液顯微結(jié)構(gòu)用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察測定,檢測樣品采用壓片法制片,吸取10 μL新鮮乳液于干凈載玻片上,蓋玻片置于其上,放大倍數(shù)200×,用儀器配備的DP2-BSW采集樣品圖像。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除特殊說明外,所有實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行3組平行試驗,測定2次以上。用Origin 2019b作圖,Excel 2019計算數(shù)據(jù),SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠理化性質(zhì)

從表1中可以看出豆腐柴果膠多糖的色澤與組織狀態(tài)均符合國標(biāo)要求,酸不溶灰分明顯低于商用柑橘果膠,實驗所得豆腐柴果膠多糖純度較好。其半乳糖醛酸含量為71.35%,高于65%,達(dá)到了商用果膠的要求。

表1 豆腐柴果膠多糖理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of pectin polysaccharide from Premna microphylla Turcz

果膠酯化度是評價果膠性能的一項重要指標(biāo),也是影響果膠的凝膠速度和凝膠時間是重要因素。豆腐柴果膠多糖和商品柑橘果膠酯化度分別為64.67%和64.81%,兩者較為接近,均屬于高酯果膠。高酯果膠具有比低酯果膠更好的凝膠性能[24-25],為豆腐柴果膠多糖凝膠性能的研究提供基礎(chǔ)。

2.2 果膠質(zhì)量濃度對乳液特性的影響

由圖1可知,油相體積在20%時EA較低,豆腐柴果膠多糖質(zhì)量濃度為4～16 g/L時,EA由18.16%提高到45.43%,組間差異極顯著,在16～20 g/L時,差異顯著,乳化上升變慢可能是因為油相體積分?jǐn)?shù)不足,難以有更多的油滴與果膠多糖分子結(jié)合,因此上升速度下降。商品柑橘果膠乳液則由10.17%提高到40.67%,組間差異極顯著。豆腐柴果膠多糖濃度較低時,增加濃度可以更顯著提高乳化液的EA,這可能是隨著果膠濃度升高,降低界面張力并促進(jìn)形成乳化顆粒與油滴分子結(jié)合,從而提高EA[26]。對比兩種果膠可以看出,在質(zhì)量濃度為4～20 g/L時,豆腐柴果膠多糖的乳化活性均優(yōu)于柑橘果膠。

圖1 果膠質(zhì)量濃度對乳液乳化活性的影響Fig.1 Influence of pectin concentration on emulsion emulsification activity

乳液的ES與果膠質(zhì)量濃度的關(guān)系如圖2所示,豆腐柴果膠多糖配制的乳液在果膠多糖質(zhì)量濃度為40 g/L時乳液體系直接被破壞,這可能是因為乳化顆粒的表面覆蓋率低,油滴發(fā)生聚集破壞乳液乳化效果[27],在果膠濃度提高時,兩種乳液ES均表現(xiàn)為極顯著的上升。質(zhì)量濃度大于8 g/L后,豆腐柴果膠多糖ES高于同水平下的柑橘果膠。

圖2 果膠質(zhì)量濃度對乳液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influence of pectin concentration on emulsion stability

CI值可以表征乳化液中的乳滴聚集情況,CI值越大,乳析速度越快,乳化液越不穩(wěn)定,也可以表明乳化液粒徑越大。由圖3可知,豆腐柴果膠多糖和商品柑橘果膠乳化液放置1 d后的CI分別為74.37%～70.13%和77.50%～73.77%,油相體積為20%時,乳化液穩(wěn)定性較差,隨著質(zhì)量濃度的提高,CI不斷降低,這可能是因為濃度的增加加大了液滴間的排斥力以及乳化液的黏度,從而降低乳滴聚集速度[28]。豆腐柴果膠多糖質(zhì)量濃度對于乳化液的CI并無顯著性影響,貯存1 d后與7 d后CI發(fā)生顯著性變化。同等條件下,豆腐柴果膠多糖乳液的乳析穩(wěn)定性高于柑橘果膠乳液。

圖3 果膠質(zhì)量濃度對乳液乳析指數(shù)的影響Fig.3 Effect of pectin mass concentration on emulsion chromatography index

不同質(zhì)量濃度乳液的顯微觀察圖如圖4所示,圖4-a～圖4-c和圖4-f～圖4-h中存在較大乳滴,大小不一,說明乳液穩(wěn)定性較差,圖4-d、圖4-e和圖4-i、圖4-j中大乳滴的數(shù)量明顯下降,且分布更均勻[29],而乳化液的CI也表明質(zhì)量濃度更高的乳液穩(wěn)定性更好。相比于柑橘果膠乳液,豆腐柴果膠多糖的乳滴粒徑更小,均一性更強(qiáng),表明豆腐柴果膠多糖乳化特性優(yōu)于柑橘果膠。

a～e-豆腐柴果膠多糖乳液;f～j-柑橘果膠乳液

2.3 pH值對乳液特性的影響

不同pH下對乳化液EA的影響見圖5,pH值由3增加到5時,豆腐柴果膠多糖乳液和商品柑橘果膠乳液的的EA均為先增高后降低,在pH 5時具有最高EA,分別為36.50%和24.56%,且豆腐柴果膠多糖乳化液的EA在pH 改變時差異不顯著。兩種不同果膠乳化液之間的EA差異顯著,豆腐柴果膠多糖乳化液EA高于柑橘果膠。

圖5 pH對乳液乳化活性的影響Fig.5 Effect of pH on emulsion activity

不同pH下對乳化液ES的影響見圖6,pH值由3增加到5時,豆腐柴果膠多糖乳液和商品柑橘果膠乳液的ES均為先增高后降低,在pH 5時具有最高ES,分別為33.49%和22.76%,pH 7時ES最低,為26.02%和19.46%。豆腐柴果膠多糖ES在pH改變時有顯著性差異變化,這可能是因為豆腐柴果膠果糖分子中的羧基會在酸性條件下釋放H+,使果膠分子帶上負(fù)電荷,使得其吸附油滴的能力改變,且在pH 5時,吸附效果最好。

圖6 pH對乳液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Influence of pH on emulsion stability

圖7是不同pH值乳化液的CI,貯存1 d后的乳液出現(xiàn)明顯的乳析現(xiàn)象,pH 5時CI最小,豆腐柴果膠多糖和柑橘果膠乳液分別為71.69%和74.56%,pH 7時CI最大,為73.13%和76.35%。貯存7 d后與貯存1 d時的CI差異顯著,不同果膠的乳化液CI差異顯著,豆腐柴果膠多糖乳液的乳析穩(wěn)定性強(qiáng)于柑橘果膠乳化液。

圖7 pH對乳液乳析指數(shù)的影響Fig.7 Influence of pH on emulsion chromatography index

不同pH下的乳液顯微觀察圖見圖8,pH對乳液粒徑和均一性影響較小,豆腐柴果膠多糖乳液的均一性優(yōu)于柑橘果膠乳液,pH 5時乳液乳化性更好,豆腐柴果膠多糖乳化特性優(yōu)于柑橘果膠。

a～c-豆腐柴果膠多糖乳液;d～f-柑橘果膠乳液

2.4 油相體積分?jǐn)?shù)對乳液特性的影響

圖9為不同油相體積分?jǐn)?shù)乳化液的EA結(jié)果,在10%油相體積分?jǐn)?shù)時,豆腐柴果膠多糖和柑橘果膠乳液的EA僅為11.1%和13.4%,而油相體積分?jǐn)?shù)為50%時,EA上升到57.7%和48.6%。這說明改變油相體積分?jǐn)?shù)會極顯著影響乳液的EA。

圖9 油相體積分?jǐn)?shù)對乳液乳化活性的影響Fig.9 Influence of oil phase volume fraction on emulsion emulsification activity

圖10為不同油相體積乳化液的ES結(jié)果,在油相體積為10%時,兩種乳液的ES均為最低,分別為9.07%和13.64%,在50%油相體積分?jǐn)?shù)時,乳化液的ES也為最高,油相體積分?jǐn)?shù)會極顯著的影響乳化穩(wěn)定性。

圖10 油相體積分?jǐn)?shù)對乳液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.10 Influence of oil phase volume fraction on emulsion stability

圖11為不同油相體積分?jǐn)?shù)下的乳化液CI變化,可以看出在油相體積分?jǐn)?shù)上升時乳液CI顯著下降,10%油相體積分?jǐn)?shù)時兩種果膠的CI相近,超過30%時未出現(xiàn)乳析現(xiàn)象,這可能是由于高體積分?jǐn)?shù)的油相會加大乳液體系的黏度,阻礙分子間的自由運(yùn)動,減緩乳滴的聚集情況,從而提高乳析穩(wěn)定性[30],表明油相體積分?jǐn)?shù)對乳析指數(shù)具有顯著影響。同時7 d后的CI也明顯下降,說明較高油相體積分?jǐn)?shù)的乳液體系具備更好的乳析穩(wěn)定性,且豆腐柴果膠多糖的乳液體系的乳析穩(wěn)定性高于柑橘果膠乳液體系。

圖11 油相體積分?jǐn)?shù)對乳液乳析指數(shù)的影響Fig.11 Effect of oil phase volume fraction on emulsion chromatography index

圖12為不同油相體積分?jǐn)?shù)下的兩種乳液體系的顯微結(jié)構(gòu)圖,油相體積分?jǐn)?shù)增大時,乳液的粒徑也增大,這是因為較高的油相體積分?jǐn)?shù)會產(chǎn)生更多的油滴,增加果膠分子與油滴結(jié)合形成乳滴,提高乳液EA,同時更高的油相體積分?jǐn)?shù)也會加大乳液的黏性從而提高ES和乳析穩(wěn)定性[31]。

a～e-豆腐柴果膠多糖乳液;f～j-柑橘果膠乳液

3 結(jié)論

本研究從豆腐柴葉中提取得到的豆腐柴果膠多糖的純度較好,且各項指標(biāo)均符合GB 25533—2010要求。將其制備的乳液體系與商品柑橘果膠乳液體系做對比,發(fā)現(xiàn)果膠質(zhì)量濃度和油相體積分?jǐn)?shù)對兩種果膠的乳化活性和穩(wěn)定性影響顯著,pH對豆腐柴果膠多糖乳化穩(wěn)定性影響顯著,對乳化活性影響不顯著,兩種果膠的乳析指數(shù)主要受到油相體積分?jǐn)?shù)的影響,同等水平下,兩種果膠的乳化特性差異顯著,豆腐柴果膠多糖的乳化特性更好。綜合來看,豆腐柴果膠多糖整體比柑橘果膠具有更好的乳化活性、乳化穩(wěn)定性和乳析穩(wěn)定性。豆腐柴果膠多糖可開發(fā)作為一種新型的食品乳化劑,在未來具有廣闊的開發(fā)前景。