尹星星,楊永晶*,陸杰,王學(xué)紅,晁沐

1(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,青海 西寧,810016)2(青海樹莓農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化有限公司,青海 西寧,812100)

免疫系統(tǒng)能夠提高機(jī)體免疫力、抵御外界病原體攻擊,其功能主要是通過(guò)免疫細(xì)胞和免疫分子來(lái)發(fā)揮作用[1-2]。巨噬細(xì)胞是常見(jiàn)的免疫細(xì)胞,也是免疫系統(tǒng)中抵御病原體入侵的第一道防線,在先天免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要的作用[3]。此外,巨噬細(xì)胞具有抗原呈遞、募集與趨化等多種功能,不僅可以直接吞噬和殺死病原體,還能夠刺激NO、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、干擾素(interferon, IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫與炎癥反應(yīng)[4]。因此,常用巨噬細(xì)胞及其相關(guān)因子來(lái)進(jìn)行體外免疫活性的研究。

多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然大分子物質(zhì),具有減緩腫瘤和炎癥發(fā)生、抵抗病毒侵入、降血糖、緩解疲勞、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[5]。免疫調(diào)節(jié)作為多糖最顯著的生物活性之一,受到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注[6]。臨床上,香菇多糖能夠改善腫瘤微環(huán)境的免疫反應(yīng),用于抗腫瘤的輔助治療;靈芝多糖主要用于神經(jīng)官能癥、多發(fā)性肌炎、皮肌炎等因免疫功能紊亂所致的各種疾病的治療[7]。此外,還有很多處于非臨床研究的多糖或多糖組分也具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。例如,歐李多糖組分CHPP-2和阿魏側(cè)耳胞外多糖組分PFEPw-1均能夠刺激RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,增強(qiáng)免疫活性[8-9];再如,地黃硒多糖能夠提高小鼠脾臟和胸腺的功能、促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖和Th1型淋巴細(xì)胞中IL-2、IFN-γ的分泌,表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性[10]。且多糖具有無(wú)毒、易降解等優(yōu)勢(shì),其被認(rèn)為是理想的免疫調(diào)節(jié)劑候選物質(zhì)[11]。

樹莓(RubusidaeusL.)是一種常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)型漿果,因其果實(shí)中含有豐富的生理活性物質(zhì)而被譽(yù)為“黃金水果”[12]。研究表明在膳食中添加樹莓,能夠起到抗肥胖、防止肝及內(nèi)臟脂肪堆積和調(diào)節(jié)脂類代謝的作用[13]。多糖作為樹莓中重要的天然大分子,近年來(lái)得到了廣泛的研究。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)樹莓粗多糖能夠通過(guò)抑制脂多糖引起的RAW264.7細(xì)胞增殖以及降低炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用;此外,樹莓粗多糖還能夠通過(guò)促進(jìn)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)和分泌來(lái)激活巨噬細(xì)胞,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[15]。前期研究發(fā)現(xiàn),樹莓粗多糖能夠增加荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用[16]。隨著研究的深入,具有顯著生理活性的多糖組分不斷從樹莓中分離純化出來(lái)。如樹莓多糖RCP-II,能夠清除大量的DPPH自由基、羥自由基和氧自由基,顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性[17];紅樹莓多糖組分RCP-Ⅰ能夠降低大鼠血清中的甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量,升高高密度脂蛋白膽固醇的含量,進(jìn)而起到預(yù)防高血脂癥的作用[12]。前期研究表明,從樹莓果肉中分離純化獲得的酸性多糖RPP-2a能夠刺激RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌,促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá),表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性[18]。

本研究采用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200對(duì)樹莓粗多糖進(jìn)行分離純化獲得多糖組分RPP-5,并進(jìn)一步分析RPP-5的結(jié)構(gòu)特征及其在RAW264.7細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)作用,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供理論參考和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹莓冷凍果,青海樹莓農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化有限公司(青海湟源);RAW264.7細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);RAW264.7細(xì)胞專用培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素混合液(P/S)、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),武漢普諾賽生命科技有限公司;PBS,青海萊茵爾生物科技有限責(zé)任公司;TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;CCK-8試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑,天根生化科技有限公司;引物,金唯智生物科技有限公司;三氟乙酸,NaCl,北京伊諾凱科技有限公司;硼氫化鈉、高氯酸,上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;乙酸乙酯,北京沃凱生物科技有限公司;醋酐、NaOH、乙酸酐,上海滬試實(shí)驗(yàn)器材股份有限公司;乙酸,中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;甲醇,德國(guó)默克公司;二甲基亞砜、NaH、碘甲烷,中國(guó)阿達(dá)瑪斯試劑公司;甲基化試劑盒,揚(yáng)州博睿糖生物技術(shù)有限公司;NO測(cè)定試劑盒,武漢生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀、D-37520離心機(jī),上海賽默飛世爾科技公司;BSZ-100自動(dòng)收集器、BRT105-104-102串聯(lián)凝膠、多糖凝膠純化系統(tǒng),揚(yáng)州博睿糖生物技術(shù)有限公司;UGC-24M氮吹儀,力辰科技有限公司;MS7-H550-Pro磁力攪拌器,無(wú)錫德凡儀器有限公司;GCMS-QP2010氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀、RID-10A FRC-10A高效液相色譜儀,日本島津公司;Sephadex G-200葡聚糖凝膠,美國(guó)通用電氣公司;RI-502SHODEX示差折光檢測(cè)器,日本昭和電工集團(tuán);HF100三氣培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓粗多糖的提取

采用超聲波輔助法提取樹莓粗多糖。于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中(溫度55 ℃)除去樹莓冷凍果水分后用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎(22 000 r/min,1～2 s)并過(guò)80目篩,獲得樹莓果粉。按照1∶4(g∶mL)的料液比向果粉中加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇脫脂。之后60 ℃加熱回流除去樹莓果粉中的色素、單糖和寡糖,之后以1∶5(g∶mL)的料液比加入雙蒸水于60 ℃下超聲波提取1 h,離心棄上清液,浸提后收集提取液。采用Sevag法除蛋白,重復(fù)操作4～5次充分除去蛋白。將除去蛋白的提取液在60 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至原來(lái)體積的1/4后加入4倍體積95%乙醇,低溫醇沉過(guò)夜后離心取沉淀物,冷凍干燥至粉末狀即得樹莓粗多糖。

1.3.2 RPP-5的分離純化

配制100 mg/mL的樹莓粗多糖溶液,采用DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱(7.5 cm×60 cm)對(duì)其進(jìn)行極性分離,分別使用0、0.2、0.4、0.8、1.5 mol/L的NaCl溶液洗脫,流速為5 mL/min,收集洗脫液。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,合并餾分,經(jīng)濃縮、透析和冷凍干燥后獲得多糖樣品。將經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱純化后的多糖配制成100 mg/mL的多糖溶液,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后采用多糖凝膠純化系統(tǒng)按照分子質(zhì)量差異進(jìn)一步純化,洗脫劑為蒸餾水,流速為0.5 mL/min。采用Sephadex G-200葡聚糖凝膠層析柱(2.6 cm×60 cm)進(jìn)行多糖純化,通過(guò)博睿糖生物技術(shù)有限公司特制的多糖凝膠純化系統(tǒng)結(jié)合示差檢測(cè)器(RI-502 SHODEX)對(duì)多糖進(jìn)行在線監(jiān)測(cè),并收集對(duì)稱峰溶液,最后經(jīng)冷凍干燥后的樣品即為樹莓多糖組分RPP-5。

1.3.3 RPP-5的含量及其分子質(zhì)量測(cè)定

配制1 mg/mL的RPP-5溶液,取0.2 mL RPP-5溶液加入1 mL乙醇,于4 ℃靜置1 h后,8 000 r/min離心5 min,棄上清液后加入80%乙醇,離心留沉淀。之后加入2 mL蒸餾水,沸水浴加熱使沉淀溶解后,將該溶液作為多糖檢測(cè)液,取該溶液100 μL,依次加入50 μL試劑一、250 μL濃硫酸,沸水浴20 min后,488 nm處測(cè)定吸光度,按照多糖含量試劑盒說(shuō)明書計(jì)算多糖含量。采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定樹莓多糖組分的分子質(zhì)量。配制多糖溶液,將過(guò)濾后的多糖溶液加入到進(jìn)樣小瓶中。使用裝有BRT105-104-102系列色譜柱(8 mm×300 mm)和RI-502示差折光檢測(cè)器的LC-10A高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定RPP-5的分子質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成分析

通過(guò)GC-MS分析RPP-5的單糖組成。分別取2 mg RPP-5和單糖標(biāo)準(zhǔn)品,于120 ℃條件下加入三氟乙酸水解,冷卻至室溫后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干除去剩余的三氟乙酸,在殘基中加入雙蒸水、硼氫化鈉和冰醋酸將其還原中和,經(jīng)旋蒸、烘干后加入乙酸酐,100 ℃反應(yīng)1 h,冷卻后加入甲苯,減壓濃縮蒸干。重復(fù)以上步驟4～5次,除去多余的醋酐,獲得乙?；苌a(chǎn)物。使用配備有CarboPacTMPA-20分析柱(3 mm×150 mm)和脈沖電流檢測(cè)器Dionex ICS-5000系統(tǒng)測(cè)定乙酰化衍生產(chǎn)物。首先用等度NaOH(250 mmol/L)洗脫10 min,之后用含有50 mmol/L NaOH的醋酸鈉(500 mmol/L)繼續(xù)洗脫30 min。將洗脫溫度、進(jìn)樣量和流速分別設(shè)置為30 ℃、5 μL和0.3 mL/min。最后,對(duì)比RPP-5與各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積,分析并計(jì)算RPP-5的單糖組成和物質(zhì)的量比。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

精確稱取RPP-5 2 mg和KBr 200 mg,制成粉末后,采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行分析。

1.3.6 甲基化分析

稱量RPP-5樣品(2～3 mg)置于玻璃反應(yīng)瓶中,加入無(wú)水DMSO、甲基化試劑A液,經(jīng)超聲波溶解后再加入甲基化試劑B液,并對(duì)其進(jìn)行水浴后加入超純水加入終止甲基化反應(yīng),獲得甲基化產(chǎn)物。取甲基化后的多糖同1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行乙酰化處理,使用配備有RXI-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)的GC-MS儀器檢測(cè)乙?；苌a(chǎn)物,經(jīng)GC-MS測(cè)定后與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。條件如下:初始柱溫120 ℃,升溫速度3 ℃/min,H2流速1 mL/min,檢測(cè)器溫度到達(dá)250 ℃,5 min后進(jìn)行分析。

1.3.7 樹莓多糖組分免疫調(diào)節(jié)活性研究

1.3.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用RAW264.7細(xì)胞專用培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)15% FBS)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,三氣培養(yǎng)箱溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。當(dāng)細(xì)胞密度為80%以上時(shí),將RAW264.7細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)接種到96孔板中。

1.3.7.2 細(xì)胞活力測(cè)定

接種至96孔板中的細(xì)胞于三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h后,加入不同質(zhì)量濃度的RPP-5溶液(0、20、40、80、160 μg/mL)及陽(yáng)性對(duì)照脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液(5 μg/mL),以加入0 μg/mL多糖溶液的RAW264.7細(xì)胞作為空白對(duì)照組,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)于37 ℃、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8,于三氣培養(yǎng)箱中孵育1 h,450 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.7.3 NO的含量測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及處理同1.3.7.2節(jié),收集RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液,按照NO測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定RAW264.7細(xì)胞中NO的含量。

1.3.7.4 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及處理同1.3.7.2節(jié),收集RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液,按照ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作,分別測(cè)定RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.3.7.5 IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)量的測(cè)定

將RAW264.7細(xì)胞(2×106個(gè)/孔)接種至6孔板中,于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,將培養(yǎng)基更換為5 μg/mL的LPS和不同濃度的RPP-5溶液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用總RNA提取試劑盒提取RAW264.7細(xì)胞中的總RNA,之后使用cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA作為第一鏈為合成模板,進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增,根據(jù)2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示,采用ANOVA單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P<0.05表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異;P<0.01表示數(shù)據(jù)之間存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPP-5的分離純化

如圖1-a所示,在DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱上分別以0、0.2、0.4、0.8、1.5 mol/L的NaCl作為洗脫液進(jìn)行洗脫,出現(xiàn)了5個(gè)洗脫峰,說(shuō)明樹莓粗多糖中含有5個(gè)不同極性的組分,分別命名為組分1(0 mol/L NaCl)、組分2(0.2 mol/L NaCl)、組分3(0.4 mol/L NaCl)、組分4(0.8 mol/L NaCl)和組分5(1.5 mol/L NaCl)。其中除了組分1為中性多糖外,其余組分均為酸性多糖。將1.5 mol/L NaCl洗脫下來(lái)的組分5在Sephadex G-200凝膠層析柱進(jìn)一步純化,在洗脫時(shí)間為149～169 min時(shí)獲得一個(gè)單一對(duì)稱峰,說(shuō)明該多糖組分具有較好的分子質(zhì)量均一性,將其命名為RPP-5(圖1-b)。

a-樹莓粗多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow色譜洗脫曲線;b-RPP-5的Sephadex G-200柱洗脫曲線

2.2 RPP-5的含量及分子質(zhì)量分析

經(jīng)測(cè)定,RPP-5的糖含量為99.8%。由圖2可知,在洗脫時(shí)間為42～44 min時(shí)獲得一個(gè)單一對(duì)稱峰(洗脫時(shí)間46～49 min時(shí)為溶劑峰)進(jìn)一步證實(shí)了RPP-5為分子質(zhì)量均一的多糖組分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得RPP-5的重均分子質(zhì)量、數(shù)均分子質(zhì)量和峰位分子質(zhì)量分別為7 598、6 183、7 492 Da。

圖2 RPP-5分子質(zhì)量測(cè)定Fig.2 Molecular weight determination of RPP-5

2.3 單糖組成分析

如圖3所示,根據(jù)保留時(shí)間和峰面積得知,RPP-5中存在6種單糖,分別為阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖,物質(zhì)的量比為44.5∶21.7∶15.9∶8.8∶5.0∶4.1。其中,阿拉伯糖的含量最高,其次是葡萄糖和半乳糖。

a-混合單糖標(biāo)準(zhǔn)物的GC-MS圖譜;b-RPP-5的GC-MS圖譜

2.4 傅里葉紅外光譜分析

結(jié)果如圖4所示,吸收帶在3 600～3 200 cm-1是—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰,這個(gè)區(qū)域的吸收峰是糖類的特征峰[19]。具體如下:3 409 cm-1是O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰,是糖類的特征峰[20]。1 631 cm-1處存在結(jié)合水的特征吸收峰[21]。1 415 cm-1和1 137 cm-1處的吸收峰均是由C—O伸縮振動(dòng)所致[22-23]。在873 cm-1處有一個(gè)吸收峰,可能為端基差向異構(gòu)C—H以外的C—H變角振動(dòng)[24]。

圖4 RPP-5的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of RPP-5

2.5 甲基化分析

如圖5所示,RPP-5的GC-MS圖譜中出現(xiàn)12個(gè)峰,與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后可知,存在1→3、1→4、1→5、1→4,6和1→3,4,6等糖苷鍵連接類型。其中葡萄糖和半乳糖都表現(xiàn)出3種乙?；苌a(chǎn)物,分別為2,3,6-Me3-Glcp、2,3-Me2-Glcp、2-Me1-Glcp和2,3,4,6-Me4-Galp、2,3,6-Me3-Galp、2,3,4-Me3-Galp,其連接方式分別為→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→和Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→;阿拉伯糖表現(xiàn)出4種乙?；苌a(chǎn)物,即2,3,5-Me3-Araf、2,3-Me2-Araf、2,3,4-Me3-Arap和2,4-Me2-Arap,其連接方式分別為Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→和→3)-Arap-(1→;而木糖和甘露糖各自表現(xiàn)出一種乙酰化衍生產(chǎn)物,即2,3-Me2-Xylp和2,3,4,6-Me4-Manp,其連接方式分別為→4)-Xylp-(1→和Manp-(1→。根據(jù)峰面積計(jì)算連接方式含量可知,→4)-Galp-(1→的含量為26.27%,含量最高,其次是→4)-Xylp-(1→、Araf-(1→和→4,6)-Glcp-(1→,含量分別為16.50%、11.38%和10.41%,其他連接方式的含量均小于10%(表2)。以上結(jié)果說(shuō)明,RPP-5是一種具有多支鏈結(jié)構(gòu)的雜多糖,推測(cè)其主鏈主要由→4)-Galp-(1→和→4)-Xylp-(1→組成,其支鏈中可能含有Araf-(1→、Galp-(1→、Arap-(1→、Manp-(1→、→3)-Arap-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→等殘基。

圖5 RPP-5的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS pattern of RPP-5

表2 RPP-5的GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of RPP-5

2.6 RPP-5免疫活性研究

2.6.1 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如圖6所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理之后,RAW264.7細(xì)胞活力極顯著升高(P<0.01)。

圖6 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of RPP-5 on the viability of RAW264.7 cells

2.6.2 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO含量的影響

如圖7所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,NO的含量極顯著升高(P<0.01),且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。

圖7 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO的影響Fig.7 Effects of RPP-5 on NO in RAW264.7 cells

2.6.3 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響

如圖8-a所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,IL-6的含量極顯著上升且呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.01)。圖8-b顯示,與空白對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞相比,經(jīng)40～160 μg/mL的RPP-5處理后,IL-1β的含量明顯升高(P<0.01,P<0.05);圖8-c結(jié)果表明,與空白對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞相比,經(jīng)20～160 μg/mL的RPP-5處理后,TNF-α的含量極顯著升高(P<0.01)。

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α

2.6.4 RPP-5對(duì)RAW264.7細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

如圖9-a與9-b所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,RAW264.7細(xì)胞中IL-6和IL-1β mRNA的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01);圖9-c顯示,經(jīng)40～160 μg/mL的RPP-5處理時(shí),能夠極顯著升高RAW264.7細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)量(P<0.01)。當(dāng)RPP-5質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí),IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)量均為最高。

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α

3 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助提取樹莓粗多糖,然后采用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱和Sephadex G-200凝膠層析柱對(duì)樹莓粗多糖分別根據(jù)極性和分子質(zhì)量進(jìn)行分離,最終獲得酸性多糖組分RPP-5。研究發(fā)現(xiàn)RPP-5的峰位分子質(zhì)量、重均分子質(zhì)量和數(shù)均分子質(zhì)量分別為7 492、7 598、6 183 Da,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖組成,物質(zhì)的量比為44.5∶21.7∶5.9∶8.8∶5∶4.1,存在→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→、Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→、→3)-Arap-(1→、→4)-Xylp-(1→、Manp-(1→等12種單糖連接方式,根據(jù)多糖的連接類型和占比,推測(cè)其主鏈主要由→4)-Galp-(1→和→4)-Xylp-(1→組成,其支鏈中可能含有Araf-(1→、Galp-(1→、Arap-(1→、Manp-(1→、→3)-Arap-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→等殘基。與之前報(bào)道的樹莓多糖組分的結(jié)構(gòu)相比,RPP-5在單糖組成、物質(zhì)的量比、分子質(zhì)量和連接方式上均有不同。例如,通過(guò)水提取并使用DEAE-A52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱從樹莓根中分離出分子質(zhì)量為7 900 Da的酸性雜多糖RAPS-1,由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸組成,相對(duì)物質(zhì)的量比為6.2∶1.0∶1.2,骨架由→4)-Glcp-(1→殘基構(gòu)成,分支主要包括Galp-(1→和GlcAp-(1→殘基[25]。YU等[17]采用復(fù)合酶法從樹莓果實(shí)中提取粗多糖,利用大孔樹脂D4020和Sephadex G-100進(jìn)行連續(xù)純化,得到一種水溶性樹莓多糖組分RCP-II。RCP-II由物質(zhì)的量比為1∶0.55∶1.19∶0.52∶0.44∶1.90的半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成,平均分子質(zhì)量約為4 013 Da。還有研究人員從樹莓中提取獲得多糖組分RP,其分子質(zhì)量為837 820 Da,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖組成,其中半乳糖醛酸和阿拉伯糖含量最高,其主鏈上有大量的1→2糖苷鍵[26]。此外,WU等[27]采用酶提取的果膠多糖RPE50%3主要含有50%的→4)-GalpA-(1→,16%的→5)-Araf-(1和→3)-Araf-(1→,18%的→4)-Galp-(1→和→6)-GalpA-(1→;而酸提取的樹莓果膠多糖RPE50%-3比RPA50%-3含有更多的阿拉伯聚糖側(cè)鏈,表現(xiàn)出更好的免疫增強(qiáng)作用。造成RPP-5與其他樹莓多糖結(jié)構(gòu)不同的原因可能有樹莓的品種差別、樹莓生長(zhǎng)環(huán)境差異、提取部位以及提取方法的不同、分離方法差異等。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,能夠維持機(jī)體的免疫、監(jiān)視和炎癥反應(yīng)[28]。巨噬細(xì)胞的活力是評(píng)估其免疫調(diào)節(jié)能力的重要參數(shù)之一。愈來(lái)愈多的科學(xué)研究表明,各種天然多糖能夠刺激巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6和IL-1β的產(chǎn)生,從而刺激免疫反應(yīng)[29]。NO是參與巨噬細(xì)胞免疫刺激的重要物質(zhì)之一,有著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性的作用[30]。IL-6是促進(jìn)免疫細(xì)胞的分化來(lái)誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-1β也被認(rèn)為是關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)之一,多糖能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β的分泌來(lái)增強(qiáng)免疫活性[31]。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子,能夠進(jìn)一步促進(jìn)該細(xì)胞的活性[32]。本研究中,RPP-5能夠增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的活力,升高細(xì)胞中NO的含量,促進(jìn)細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌及其mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果表明,RPP-5具有顯著的免疫增強(qiáng)活性,可用作天然免疫增強(qiáng)劑用于功能性食品、保健品及藥品等的開(kāi)發(fā)中。

多糖的分子質(zhì)量、單糖組成以及糖苷鍵的類型與其生物活性密切相關(guān)。低分子質(zhì)量多糖具有較為簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu),在通過(guò)細(xì)胞屏障時(shí)因其阻礙較小,進(jìn)而在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性時(shí)具備一定的優(yōu)勢(shì)[33]。分子質(zhì)量較高的多糖盡管結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,但其與受體和蛋白的連接位點(diǎn)較多,也具有較強(qiáng)的免疫活性[34]。RPP-5的重均分子質(zhì)量為7 598 Da,有利于其免疫增強(qiáng)活性的發(fā)揮。除分子質(zhì)量外,單糖組成也是影響多糖免疫活性的重要因素之一。研究表明,半乳糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖的含量與巨噬細(xì)胞免疫活性的增強(qiáng)呈正相關(guān)[35]。金櫻子果實(shí)多糖,因其半乳糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖占單糖總量的86.7%,能夠激活巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞分泌免疫細(xì)胞因子進(jìn)而表現(xiàn)出極強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性[36]。龍葵多糖經(jīng)水提取和堿提取分別獲得SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1和SNLAP-2四種多糖亞組分,SNLWP-1中半乳糖和阿拉伯糖作為主要糖成分;SNLAP-1和SNLAP-2均富含木糖、半乳糖和阿拉伯糖;SNLWP-2富含葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn),富含半乳糖、阿拉伯糖和木糖的多糖亞組分能夠升高H22型小鼠血清中IL-2和IFN-γ的水平,通過(guò)增加免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[37]。此外,多糖的免疫活性還與其連接方式對(duì)關(guān)。例如,羅望子多糖TKP-2-1中1,4,6-Glcp的含量為37%、1,4-Galp的含量為10.9%,具有較強(qiáng)的免疫刺激活性[33]。黃芪總多糖中存在APS-I和APS-Ⅱ兩種分子質(zhì)量不同的多糖組分,APS-Ⅱ中單糖的主要連接方式為1→2,4-Glcp和1→4,6-Glcp,與黃芪多糖APS-I相比具有更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性[38]?？梢?jiàn),1,4,6-Glcp、1,4-Galp、1→2,4-Glcp這些單糖連接方式的含量可能與免疫增強(qiáng)作用呈正相關(guān)。本研究中,RPP-5由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖組成,其中阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和木糖占總糖含量的82.15%,存在12種單糖連接方式,其中→4)-Galp-(1→的含量最高,為26.27%,→4,6)-Glcp-(1→的含量為10.41%。由此可見(jiàn)RPP-5具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性,這也與免疫調(diào)節(jié)活性結(jié)果相互印證。

綜上,RPP-5分子質(zhì)量為7 598 Da,由物質(zhì)的量比為44.5∶21.7∶5.9∶8.8∶5∶4.1的阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖6種單糖組成,存在→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→、Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→、→3)-Arap-(1→、→4)-Xylp-(1→、Manp-(1→等12種單糖連接方式。RPP-5能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的存活率,升高RAW264.7細(xì)胞中的NO含量,促進(jìn)細(xì)胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌及其mRNA的表達(dá),顯示出較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為免疫調(diào)節(jié)劑的潛力。但RPP-5調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制還有待進(jìn)行進(jìn)一步地深入研究。