楊 穎,張嘉之,姬慧杰,高衛(wèi)萍

0引言

最新定義認(rèn)為干眼是一種多因素的眼表疾病,其特征是淚膜失去穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致一系列眼表癥狀,淚膜不穩(wěn)定、高滲、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常都參與其中[1]?！秶H淚膜和眼表協(xié)會(huì)干眼工作組發(fā)布第二版系列共識(shí)》認(rèn)為干眼的核心機(jī)制是水分蒸發(fā)或損失引起眼表組織高滲損傷,導(dǎo)致上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的損失,從而進(jìn)一步影響淚膜穩(wěn)態(tài)加劇高滲狀態(tài),形成惡性循環(huán)[2]。干眼的分子機(jī)制十分復(fù)雜,涉及免疫、炎癥等多種通路,如何從整體的角度深入分析,避免盲目實(shí)驗(yàn),為靶向治療提供依據(jù),也是亟待解決的問題。系統(tǒng)生物學(xué)可以從整體和全局的高度闡明生物體復(fù)雜的生理病理狀態(tài),主要包括：基因組學(xué)、微生物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等。各類組學(xué)技術(shù)在干眼診療機(jī)制的研究受到廣泛應(yīng)用和關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者已總結(jié)了基因組學(xué)、微生物組學(xué)、代謝組學(xué)在干眼中的應(yīng)用[3-5]。蛋白質(zhì)組學(xué)從生物樣本中分離和鑒定蛋白質(zhì),可以客觀準(zhǔn)確地反映各樣本中的含量,為不同樣本蛋白質(zhì)水平的差異篩選提供了有效方法[6]。非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白變化,揭示新的生物標(biāo)志物和疾病治療靶點(diǎn)[7]。雖然已有學(xué)者從檢測(cè)技術(shù)的角度總結(jié)了干眼蛋白組學(xué)的應(yīng)用,但缺乏大樣本的研究支持[8]。本文將從干眼的發(fā)病機(jī)制入手,結(jié)合干眼的最新分類[9],綜述蛋白組學(xué)在干眼研究中的最新應(yīng)用進(jìn)展。

1檢測(cè)標(biāo)本和常用技術(shù)

蛋白質(zhì)濃度為8-10 mg/mL的淚液因?yàn)闊o創(chuàng)采集且較易獲得[10],已成為干眼蛋白組學(xué)研究的常用標(biāo)本。常用采集方法包括Schirmer試紙、玻璃毛細(xì)管、外科海綿等[11]。淚液蛋白根據(jù)含量不同可以分為三大類[7]：高含量組(mg/mL)蛋白由淚腺、瞼板腺、杯狀細(xì)胞和副淚腺分泌,包括溶菌酶(lysozyme, LYZ)、乳鐵蛋白(lactoferrin, LTF)、血清白蛋白(albumin, ALB)、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, sIgA)、載脂蛋白-1(lipocalin1, LCN1)、親脂性蛋白、催淚蛋白(lacritin)和富含脯氨酸的蛋白質(zhì)(proline-rich proteins, PRR);中含量組(mg/mL到ng/mL)蛋白主要由細(xì)胞信號(hào)分子分泌;低含量組蛋白主要是細(xì)胞因子和生長因子蛋白。有限的淚液體積和大范圍波動(dòng)的蛋白含量,對(duì)蛋白組學(xué)檢測(cè)的靈敏度提出了很高要求。值得注意的是,因?yàn)殡暮科秃偷鞍踪|(zhì)的不穩(wěn)定性,小分子的分泌蛋白如白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、趨化因子等較難通過質(zhì)譜等方式鑒定。因此,蛋白芯片技術(shù)[12]或酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法對(duì)這些免疫因子檢測(cè)更有效[13]。

目前蛋白質(zhì)組學(xué)的主流技術(shù)主要包括基于凝膠和色譜的分離技術(shù)和基于質(zhì)譜的分析技術(shù)[14]。干眼的蛋白組學(xué)技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離、變性裂解,基于凝膠或緩沖液進(jìn)一步處理成小片段,最后進(jìn)行質(zhì)譜分析。在處理過程中可以采用標(biāo)記和非標(biāo)記技術(shù)兩種。常用的標(biāo)記技術(shù)包括傳統(tǒng)使用的基于二維凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析[15],以及基于質(zhì)譜的同位素標(biāo)記蛋白組學(xué)分析,比如使用同位素標(biāo)記對(duì)肽段進(jìn)行相對(duì)和絕對(duì)定量修飾的iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技術(shù)[16]。標(biāo)記定量蛋白組學(xué)敏感、準(zhǔn)確性高,但對(duì)樣品及標(biāo)記的要求高、試劑昂貴,無法應(yīng)用于大規(guī)模蛋白分析。非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)是指比較的樣本無需標(biāo)記[17],通過對(duì)比特定的肽段或蛋白在兩個(gè)不同樣本間質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)弱,就可得到樣本間蛋白表達(dá)量的變化,可重復(fù)進(jìn)行樣本實(shí)驗(yàn),適用于大規(guī)模蛋白分析,但是準(zhǔn)確性不如標(biāo)記定量技術(shù)。在干眼的蛋白組學(xué)研究中,這兩種方法都有廣泛應(yīng)用[7]。

2參與干眼發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵蛋白和潛在蛋白標(biāo)記物

2.1熱休克蛋白家族相關(guān)通路在氧化應(yīng)激、高滲應(yīng)激和干燥條件下,熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)-B上調(diào)。它激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路,進(jìn)而激活應(yīng)激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路,并增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α。這些炎性細(xì)胞因子刺激先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)。

2.2谷胱甘肽通路氧化應(yīng)激、高滲應(yīng)激抑制谷胱甘肽代謝,而谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶pi1蛋白可以重新激活谷胱甘肽代謝。

2.3過氧化物酶體增殖物激活受體途徑一方面,過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)可激活與糖脂代謝、碳水化合物相關(guān)的對(duì)干眼產(chǎn)生保護(hù)作用的重要基因。但在氧化和干燥應(yīng)激下,NF-kB通路被激活,并阻斷PPAR信號(hào)傳導(dǎo),炎癥基因表達(dá)并產(chǎn)生IL-17。在PPAR途徑中參與的蛋白有載脂蛋白A1/A2和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白。

2.4免疫相關(guān)途徑S100A8和S100A9都屬于S100鈣結(jié)合蛋白家族,通過T樣受體激活免疫體統(tǒng),改變眼相關(guān)淋巴系統(tǒng)的免疫耐受,并可通過激活MARK通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18]。在S100A8和S100A9增加的情況下,APC轉(zhuǎn)化為成熟APC(mature APC, mAPC),激活Th1細(xì)胞釋放IL-17、IFN-γ、TNF-α。這些細(xì)胞因子刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng),缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)/2α和HIF-1β基因被轉(zhuǎn)錄為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A、VEGF-C和其他血管生成蛋白。

既往關(guān)于干眼的蛋白組學(xué)研究中,2項(xiàng)以上的研究證實(shí)31種蛋白在干眼淚液中存在差異表達(dá),這些蛋白和免疫、細(xì)胞修復(fù)、抗氧化、抗菌、眼表炎性等生物過程相關(guān),12種蛋白得到了獨(dú)立驗(yàn)證并有望成為潛在的生物標(biāo)記物[7]。12種獨(dú)立標(biāo)記物中表達(dá)上調(diào)的有鈣結(jié)合蛋白S100A6/S100A8/S100A9、膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)、α-1-酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1,ORM1)。鈣結(jié)合蛋白是由吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì),在屏障功能和先天性免疫中發(fā)揮重要作用。炎癥、氧化應(yīng)激、眨眼減少或其他環(huán)境因素可能是S100A8和S100A9表達(dá)增加的原因[18]。ANXA1是一種促炎介質(zhì),可調(diào)節(jié)滲透壓。ORM1是一種急性反應(yīng)期蛋白,在機(jī)體出現(xiàn)炎癥、感染時(shí)增加。下調(diào)的蛋白比如LYZ、LTF、ALB、sIgA、LCN1等則是正常淚液中的主要蛋白成分。換言之,淚液正常蛋白組分的下調(diào)可能提示干眼的發(fā)生。

3蛋白標(biāo)記物對(duì)干眼類型的鑒別作用

3.1脂質(zhì)異常型干眼國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9的表達(dá)與瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction, MGD)干眼的嚴(yán)重程度相關(guān)[19],并且這兩種蛋白的增加可能與MGD腺管上皮高度角化有關(guān)。然而Soria等[20]認(rèn)為S100A8和S100A9并不能用來鑒別MGD干眼,甚至在MGD干眼呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),可能與MGD蛋白分泌整體下降有關(guān),同時(shí)提出由硫氧還蛋白、免疫球蛋白、磷脂酶A2蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子和乳過氧化物酶蛋白組成的六個(gè)標(biāo)記物組可以鑒別MGD干眼。

3.2水液缺乏型干眼Boehm等[21]報(bào)告了6種候選生物標(biāo)志物蛋白,可用于鑒別水液缺乏型干眼,其中分泌蛋白疏脂蛋白A、C在水液缺乏和脂質(zhì)異常型干眼中呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì),但在水液缺乏和混合性干眼中都存在PRR下調(diào)和S100A8上調(diào)[21-22]。研究者認(rèn)為淚液體積的改變和淚膜成分的變化,是造成水液缺乏型干眼蛋白組學(xué)差異的主要原因,而在脂質(zhì)異常型干眼中,蛋白變化相對(duì)較小,僅僅是脂質(zhì)層的破壞,對(duì)于淚液蛋白表達(dá)的影響較小。

另有學(xué)者收集了淚腺導(dǎo)管開口處的淚液[23-24],發(fā)現(xiàn)其蛋白成分和眼表收集的淚液蛋白有明顯差異(1 448種vs1 165種),只有48%的蛋白成分是相同的[23]。在淚腺分泌不足和水液缺乏型干眼中,LYZ、LTF、LCN1均表達(dá)下調(diào)。而淚腺分泌不足時(shí)上調(diào)的差異蛋白多和細(xì)胞凋亡、免疫防御炎性過程相關(guān)。

3.3黏蛋白異常型干眼黏蛋白是一種高度糖基化的高分子親水蛋白家族[25]。淚膜的黏蛋白(mucins)主要包括分泌型黏蛋白(例如MUC5AC)和跨膜黏蛋白(例如MUC16)[26],參與維持淚膜穩(wěn)定。分泌型黏蛋白和淚膜的水液成分共同形成凝膠狀物質(zhì)覆蓋眼表,既可清除細(xì)胞碎片,又可發(fā)揮抗菌抗炎的屏障作用?？缒ゐさ鞍讋t在眼表形成細(xì)胞支架發(fā)揮抗黏附作用。在黏蛋白異常型干眼中,MUC家族蛋白表達(dá)顯著下降。國外學(xué)者等通過瓊脂糖凝膠電泳和化學(xué)發(fā)光檢測(cè),使用多種抗體在淚液中檢測(cè)到MUC1、MUC4、MUC16和MUC5AC,這些蛋白可作為黏蛋白異常型干眼的生物標(biāo)志物[27]。但是由于黏蛋白的糖基化水平很高和特異性抗體的形成受到限制,因此黏蛋白的定性和定量檢測(cè)仍有一定困難,也缺乏大樣本的研究[25]。

除了對(duì)類型進(jìn)行鑒別,有些蛋白還具有臨床癥狀相關(guān)性。一項(xiàng)研究利用抗體芯片篩選出幾種干眼差異表達(dá)蛋白S100A6、MMP9和端粒結(jié)合蛋白cystatin S(CST4),并且與干眼程度相關(guān),體現(xiàn)在OSDI干眼問卷評(píng)分、Schirmer試驗(yàn)、TBUT和熒光染色等方面[28]。CST4由淚腺和瞼板腺分泌,與干眼嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān),有望成為干眼嚴(yán)重程度分級(jí)的淚液穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物。

4蛋白組學(xué)的治療評(píng)價(jià)作用

在一項(xiàng)比較0.05%環(huán)孢素(cyclosporin A,CSA)和地夸磷醇四鈉(diquafosol tetrasodium, DQS)治療后的蛋白組學(xué)顯示,兩種治療方式都提高了先天免疫和獲得性免疫及細(xì)胞解毒反應(yīng)[29]。內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)代謝和傷口愈合的調(diào)節(jié)在CSA治療中增加,在DQS治療中減少,而參與應(yīng)激調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)反應(yīng)、組織穩(wěn)態(tài)和防御反應(yīng)則在CSA治療中下調(diào),在DQS治療中上調(diào)。和基線相比,DQS直接促進(jìn)蛋白質(zhì)的分泌。

針灸作為在絕經(jīng)后婦女干眼的補(bǔ)充治療有很好的療效[30]。聯(lián)合治療組的癥狀評(píng)分改善優(yōu)于單純?nèi)斯I液組,蛋白組學(xué)結(jié)果顯示聯(lián)合治療組分泌蛋白增加,細(xì)胞質(zhì)蛋白豐度降低,免疫相關(guān)蛋白質(zhì)上調(diào),增殖相關(guān)蛋白下調(diào)。

5蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合使用

國內(nèi)學(xué)者使用了一種非標(biāo)記的納米級(jí)液體色譜與四極飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜光譜法進(jìn)行干眼蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析[31]。作者發(fā)現(xiàn),淚液中表達(dá)變化的190種蛋白質(zhì)中有120多種與炎癥反應(yīng)相關(guān)。關(guān)鍵的炎癥相關(guān)蛋白包括鋅α2糖蛋白、LYZ、LTF和CST4。而34種失調(diào)代謝產(chǎn)物具有抗炎和保護(hù)作用。代謝結(jié)果的網(wǎng)絡(luò)分析提示增強(qiáng)了先天免疫、補(bǔ)體和凝血反應(yīng)的激活,以及糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、酪氨酸代謝和谷胱甘肽代謝。代謝變化與蛋白質(zhì)組學(xué)變化相呼應(yīng),表明代謝改變需要增加大量蛋白質(zhì)的合成。

6蛋白組學(xué)和微生物組學(xué)的聯(lián)合使用

在近期的一項(xiàng)研究中[32],國外學(xué)者使用全基因組鳥槍測(cè)序法檢測(cè)了40個(gè)干眼眼表樣本的微生物組學(xué),并用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了淚液蛋白組學(xué),探討了兩者之間的關(guān)聯(lián)。比如干眼患者中的黏蛋白-16和不動(dòng)桿菌的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),眼表的細(xì)菌成分可能會(huì)影響淚液中黏蛋白的釋放。同時(shí)作者篩選出和眼表細(xì)菌相關(guān)且表達(dá)豐度最高的3種淚液蛋白：伴侶蛋白、抗砷性蛋白和解旋酶細(xì)菌蛋白。伴侶蛋白是在應(yīng)激狀態(tài)下通過細(xì)菌感染表達(dá)的蛋白,抗砷性蛋白與細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),解旋酶細(xì)菌蛋白則與細(xì)菌的DNA復(fù)制有關(guān)。研究進(jìn)一步證明在干眼的炎癥反應(yīng)中,眼表微生物和淚液蛋白成分也存在相互作用和影響,也提示了眼表微環(huán)境對(duì)干眼發(fā)病的關(guān)鍵作用。

7結(jié)語

綜上,蛋白組學(xué)的先進(jìn)技術(shù)提供了對(duì)淚液小樣本進(jìn)行蛋白分析的可能,也為干眼的蛋白組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。干眼的蛋白組學(xué)差異主要反映炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫防御等機(jī)制,而其中高頻出現(xiàn)的蛋白比如鈣結(jié)合蛋白可以作為進(jìn)一步研究的靶向生物標(biāo)記物。不同類型的干眼體現(xiàn)出不同蛋白標(biāo)志物的變化,比如在水液缺乏型干眼中,正常淚液蛋白含量下降,與干眼發(fā)病機(jī)制有一定的吻合。研究中的差異結(jié)果可能與不同研究人種有關(guān),而且無論哪種干眼都可能引發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎癥相關(guān)蛋白增加,可能與干眼的不同發(fā)病階段也有關(guān)聯(lián)。目前,蛋白組學(xué)可應(yīng)用于干眼生物標(biāo)記物的鑒定、不同干眼類型的鑒別、干眼治療的療效評(píng)價(jià),為我們理解干眼的發(fā)病機(jī)制提供了更加實(shí)際深入的循證依據(jù)。在各種組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用和相互佐證下,干眼研究“如虎添翼”,蛋白組學(xué)有望在干眼的靶向治療中發(fā)揮更大的潛能。