劉宇馨 李松 崔妍

摘 ?要：納米氧化物因具有優(yōu)異的殺菌潛力廣受矚目，然而不同納米氧化物的殺菌性能鮮有橫向比較。該研究對(duì)納米TiO2、納米Al2O3、納米MgO、納米ZnO和納米SiO2 5種常見納米粒子的抗菌能力進(jìn)行綜合評(píng)估，測(cè)試菌株包括大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌。結(jié)果顯示，納米MgO表現(xiàn)出極強(qiáng)的殺菌效果，在1 mM濃度下，能有效殺死50%以上的細(xì)菌；而在5 mM濃度下，殺菌率高達(dá)90%以上。其次是納米ZnO，對(duì)細(xì)菌也具有較強(qiáng)的殺菌作用。尤其對(duì)革蘭氏陰性菌，納米MgO和納米ZnO的殺菌效果更為顯著。納米TiO2和納米Al2O3雖然顯示一定的殺菌潛力，但效果較弱。另外，SiO2納米粒子未表現(xiàn)出任何殺菌能力。該研究對(duì)不同納米氧化物的殺菌性能進(jìn)行全面的比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為開發(fā)新型高效殺菌劑和抑菌材料提供有益的參考。

關(guān)鍵詞：納米氧化物；殺菌；納米氧化鎂；納米氧化鋅；納米氧化鋁

中圖分類號(hào)：TB383.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-2945（2024）14-0018-05

Abstract： Nano-oxides have garnered significant attention due to their potential for antibacterial properties; however， there is a lack of comprehensive cross-comparison regarding the antibacterial performance of different nanoparticles. This study conducted a comprehensive evaluation of the antibacterial capabilities of five commonly used nanoparticles： nano-TiO2， nano-Al2O3， nano-MgO， nano-ZnO， and nano-SiO2. The test strains included Escherichia coli， Salmonella， Listeria monocytogenes， and Staphylococcus aureus. The results revealed that nano-MgO exhibited remarkably strong bactericidal effects. At a concentration of 1 mM， it effectively killed over 50% of the bacteria， and at a concentration of 5 mM， the bactericidal rate exceeded 90%. Nano-ZnO demonstrated the second most potent antibacterial action. Particularly against Gram-negative bacteria， nano-MgO and nano-ZnO showed more pronounced bactericidal effects. While nano-TiO2 and nano-Al2O3 exhibited some antibacterial potential， their effectiveness was relatively weak. Additionally， nano-SiO2 particles did not exhibit any antibacterial capability. These findings offer valuable references for the development of novel and efficient antibacterial agents and antimicrobial materials.

Keywords： nano-oxide; sterilization; nano-MgO; nano-ZnO; nano-Al2O3

細(xì)菌污染一直是食品、化妝品、飼料和醫(yī)療等領(lǐng)域所面臨的重要問題[1-3]，因此，對(duì)抑菌方法和抑菌材料的研究從古至今都沒有停止。在日常生活中，常見的食品殺菌方法為熱殺菌，而古代人們則早早發(fā)現(xiàn)了利用糖、鹽等腌制食品來防腐的方法。然而，隨著現(xiàn)代臨床主要依賴抗生素治療細(xì)菌感染，抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的問題逐漸嚴(yán)峻[4-5]。因此，人們迫切地尋找新的抗生素，或?qū)ΜF(xiàn)有抗生素進(jìn)行改造，以突破細(xì)菌對(duì)原有藥物的抗性。同時(shí)，人們還在不斷探索新型的殺菌或抑菌物質(zhì)，尤其在工業(yè)應(yīng)用中，追求成本低廉且性能優(yōu)越的新型殺菌材料顯得尤為重要[6]。

近幾十年來，隨著納米技術(shù)的廣泛而快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)一些納米材料具有卓越的殺菌效果，特別是納米氧化物，如納米氧化鎂（MgO）[7]、納米氧化鋅（ZnO）[8]、納米二氧化鈦（TiO2）[9]等。這些納米氧化物展現(xiàn)出杰出的殺菌能力。納米氧化物是一類在納米尺度上的無機(jī)殺菌劑，一般認(rèn)為，它們?cè)谌芤褐行纬蛇^氧化物，通過氧化反應(yīng)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[10-12]。目前不同納米粒子抑菌效果的差異及相互之間的性能比較還有待深入研究。因此，本研究旨在對(duì)4種細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比納米二氧化硅（SiO2）、納米氧化鋁（Al2O3）、納米TiO2、納米MgO和納米ZnO這5種納米氧化物在殺菌效果上的表現(xiàn)，期望從中優(yōu)選出用量較少、殺菌能力較強(qiáng)的納米材料，以為今后的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試劑

溶菌肉湯培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基）、腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI培養(yǎng)基），上海索萊寶生物科技有限公司；納米TiO2（粒徑小于50 nm）、納米MgO（粒徑小于50 nm）、納米Al2O3（粒徑小于50 nm）和納米ZnO（粒徑小于50 nm），美國(guó)Sigma公司；納米二氧化硅為本實(shí)驗(yàn)室前期合成，粒徑約為50 nm；曲拉通X-100（Triton X-100）、環(huán)己烷、正己醇、正硅酸四乙酯（TEOS）和氨水，購自國(guó)藥集團(tuán)（上海）有限公司；所有水均為滅菌蒸餾水。

1.2 ?菌株

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C600；沙門氏菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17025；金黃色葡萄球菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923；單核細(xì)胞增生李斯特菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDe。

1.3 ?儀器

生物安全柜，EN12469，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；恒溫培養(yǎng)箱，Heratherm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；超低溫冰箱，-80 ℃，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；高壓滅菌鍋，3781型，日本松下公司；離心機(jī)，5415R型，德國(guó)艾本德公司；微量移液器，德國(guó)艾本德公司。

1.4 ?菌株培養(yǎng)

用接種針分別接種活化后的單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中（BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞增生李斯特菌；TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌；LB培養(yǎng)基培養(yǎng)沙門氏菌與大腸桿菌），36 ℃下200 r/min搖瓶培養(yǎng)過夜。分別取1 mL菌液，12 000 r/mim高速離心5 min，棄去上清，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.2）復(fù)溶，然后10倍梯度稀釋，最終稀釋濃度約為106 CFU/mL。

1.５ ?牛津杯抑菌

相應(yīng)的培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌15 min后分裝于平皿中，培養(yǎng)基約15～18 mL，保證底面呈水平狀態(tài)。待晾涼之后用添加0.1 mL 106 CFU/mL的菌液，用涂抹棒均勻涂抹，放置于生物安全柜中等待晾干，然后加入牛津杯，保證牛津杯與培養(yǎng)皿緊密貼合。然后加入100 μL氧化物納米溶液。放入培養(yǎng)箱，36 ℃培養(yǎng)24 h。最終觀察并測(cè)量抑菌圈的大小。

1.６ ?納米粒子殺菌效果

取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，12 000 r/min離心5 min，然后用PBS（pH 7.2）復(fù)溶，接著用PBS（pH7.2）10倍梯度稀釋，最終稀釋為約105 CFU/mL的濃度。添加一定量的納米氧化物（終濃度為1 mM、5 mM、10 mM），36 ℃混合1 h，然后將混合物梯度稀釋，每個(gè)梯度取10 μL滴在平板上，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2 ?結(jié)果與討論

2.１ ?牛津杯法不適用于一些納米粒子的抑菌實(shí)驗(yàn)

牛津杯法是一種簡(jiǎn)單而易于操作的抑菌效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，不論是一層法還是兩層法其原理都是在平板上涂抹或者傾注菌液，牛津杯放置于平板之上（在兩層法中為嵌入第二層中），當(dāng)牛津杯中加入抑菌物質(zhì)之后，抑菌物進(jìn)行擴(kuò)散，如果有抑菌作用，則在牛津杯外圈形成抑菌圈，抑菌效果越強(qiáng)則抑菌圈越大。在本研究中，將納米氧化物進(jìn)行牛津杯實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在牛津杯外并沒有出現(xiàn)外溢的抑菌圈，去除牛津杯之后發(fā)現(xiàn)在牛津杯內(nèi)形成白色物質(zhì)的凝集物。

雖然也有一些研究報(bào)道用牛津杯法進(jìn)行納米粒子殺菌效果實(shí)驗(yàn)[5]，但是，從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，一些納米粒子并不適合用牛津杯法進(jìn)行殺菌能力探究。因?yàn)橐恍┘{米粒子在水中并非真正的溶液狀態(tài)，而是懸浮分散而已（圖１），即經(jīng)過搖晃之后呈現(xiàn)一定的均勻分布，經(jīng)過靜置一段時(shí)間之后均會(huì)沉降于底部。牛津杯實(shí)驗(yàn)主要是在牛津杯中添加抑菌溶液，通過溶液的擴(kuò)散作用將抑菌物擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基中，從而讓溶液與菌體接觸。對(duì)于具有一定顆粒大小，而且會(huì)產(chǎn)生沉降的納米粒子而言，其無法在固體培養(yǎng)基中滲透，進(jìn)入固體培養(yǎng)基的僅僅是水，而納米粒子被截留在牛津杯中。所以，用牛津杯法可能無法判斷一些納米粒子真正的抑菌效果。故在之后的實(shí)驗(yàn)中，均是將納米粒子與菌體混合孵育，然后10倍梯度稀釋，用平板計(jì)數(shù)的結(jié)果來判定納米粒子的殺菌效果。

2.２ ?5種納米粒子對(duì)大腸桿菌的殺菌效果比較

將5種納米粒子分別與105 CFU/mL的大腸桿菌混合反應(yīng)1 h，然后用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算經(jīng)過處理之后依然存活的菌落數(shù)，殺菌率可以通過初始菌落數(shù)與存活菌落數(shù)的差值除以初始菌落數(shù)計(jì)算得到。如圖2所示，分別對(duì)5種納米粒子做了3個(gè)濃度的殺菌性能驗(yàn)證（10 mM、5 mM、1 mM）?？梢园l(fā)現(xiàn)，MgO納米粒子對(duì)大腸桿菌具有非常優(yōu)異的殺菌性能，當(dāng)1 mM濃度時(shí)可以達(dá)到50.5%的殺菌率，5 mM與10 mM濃度時(shí)可以98.1%與100%殺死大腸桿菌。殺菌性能較好的另一個(gè)樣品為ZnO納米粒子，在1 mM濃度時(shí)殺菌效果與MgO納米粒子類似（52.4%），不過，在5 mM與10 mM的濃度下只能達(dá)到68%與75.7%。此外，TiO2納米粒子與Al2O3納米粒子也表現(xiàn)出一定的殺菌效果，不過性能不是很顯著，10 mM時(shí)殺菌率分別為27.2%與36.9%。雖然從數(shù)據(jù)上看似乎納米SiO2也有微弱的殺菌作用，實(shí)際上經(jīng)過混合孵育處理后菌落數(shù)與原始菌落數(shù)進(jìn)行顯著性分析，并沒有差異（p>0.1），這說明SiO2的殺菌率僅僅是實(shí)驗(yàn)誤差而已，SiO2納米粒子本身并沒有殺菌作用?？偟膩碚f用大腸桿菌驗(yàn)證，這5種納米粒子殺菌能力的強(qiáng)弱順序依次為：MgO>ZnO>Al2O3>TiO2>SiO2（其中SiO2無殺菌作用）。

2.３ ?5種納米粒子對(duì)沙門氏菌的殺菌效果比較

大腸桿菌是一種非常常見的革蘭氏陰性菌，主要來自于人和動(dòng)物的糞便，往往通過檢測(cè)它確定食品的衛(wèi)生程度。因此，在本研究中被選作殺菌對(duì)象。此外，沙門氏菌也是一種常見的食源性致病菌，在本研究中也作為革蘭氏陰性菌的代表，進(jìn)行5種納米粒子的殺菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，MgO納米粒子與ZnO納米粒子對(duì)沙門氏菌具有更強(qiáng)的殺菌能力，1 mM濃度下就可以分別殺死94.9%與65.8%的沙門氏菌。Al2O3納米粒子對(duì)于沙門氏菌的殺菌能力也略有上升，不過納米TiO2對(duì)沙門氏菌的殺菌能力有所下降，只有10 mM濃度時(shí)才與不處理的對(duì)照組有顯著差異，殺菌能力也只有18.8%。SiO2納米粒子依然沒有殺菌能力，3個(gè)濃度與對(duì)照組無差異（p>0.1）?？偟膩碚f用沙門氏菌驗(yàn)證，這5種納米粒子殺菌能力的強(qiáng)弱順序依次為：MgO>ZnO>Al2O3>TiO2>SiO2（其中SiO2無殺菌作用），總體殺菌能力的強(qiáng)弱與大腸桿菌相同。

2.4 5種納米粒子對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺菌效果比較

細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌2大類，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁表面只有少量的肽聚糖層，表面較為疏松，而革蘭氏陽性菌表面具有較厚的肽聚糖層，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為致密。在用大腸桿菌與沙門氏菌作為陰性菌代表探究5種納米粒子的殺菌效果之后，本研究用單核細(xì)胞增生李斯特菌與金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的代表，進(jìn)一步來探究這5種納米粒子的殺菌效果。圖4是5種納米粒子與單核細(xì)胞增生李斯特菌混合孵育1 h之后的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。從結(jié)果可以看出，和沙門氏菌相比，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的殺菌效果確實(shí)均有所下降，納米MgO依然具有很強(qiáng)的殺菌性能，納米ZnO殺菌能力下降較為明顯。納米Al2O3殺菌能力也有所降低。SiO2納米粒子依然沒有殺菌能力，3個(gè)濃度與對(duì)照組無差異（p>0.1）。此外，納米TiO2 在5 mM與1 mM濃度下雖然沒有殺菌能力（與對(duì)照組無差異，p>0.1），但是10 mM濃度下有所增加。TiO2具有光催化的能力，在光照下可以催化促進(jìn)殺菌能力，在本研究中并沒有嚴(yán)格的控制光照條件，這也有可能是它殺菌能力的趨勢(shì)略有變化的原因。總的來說用單核細(xì)胞增生李斯特菌驗(yàn)證，這5種納米粒子殺菌能力的強(qiáng)弱順序依次為：MgO>ZnO>TiO2>Al2O3>SiO2（其中SiO2無殺菌作用）。

2.5 ?5種納米粒子對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果比較

圖5是5種納米粒子與金黃色葡萄球菌混合孵育1 h之后的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。從結(jié)果可以看出，與單核細(xì)胞增生李斯特菌相比，納米MgO與納米ZnO對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌能力明顯下降。眾所周知，金黃色葡萄球菌具有較厚的細(xì)胞壁，所以往往難以破壞，出現(xiàn)這樣的結(jié)果也在預(yù)期當(dāng)中。但是納米TiO2與納米Al2O3竟然出現(xiàn)殺菌能力增強(qiáng)的趨勢(shì)，這種現(xiàn)象尚且無法解釋，一些殺菌機(jī)理有待進(jìn)一步了解。不過納米TiO2與納米Al2O3總體殺菌效率還是比較低。SiO2納米粒子依然沒有殺菌能力，3個(gè)濃度與對(duì)照組無差異（p>0.1）?？偟膩碚f用金黃色葡萄球菌驗(yàn)證，這5種納米粒子殺菌能力的強(qiáng)弱順序依次為：MgO>ZnO>TiO2>Al2O3>SiO2（其中SiO2無殺菌作用）。

總體而言，通過5種納米粒子的殺菌效果比較，發(fā)現(xiàn)納米MgO與納米ZnO具有較強(qiáng)的殺菌效果?；颈憩F(xiàn)為對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌能力強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，但是針對(duì)具體的菌種略有差異。尤其是納米MgO，在1 mM濃度下就可以殺死50%以上的4種菌，在5 mM濃度下就可以殺死90%以上的4種菌。

3 ?結(jié)論

納米氧化物被廣泛報(bào)道具有殺菌能力，但是殺菌能力到底如何，之間的橫向比較研究還較為缺乏。在本研究中，比較了納米TiO2、納米Al2O3、納米MgO、納米ZnO和納米SiO2 5種納米粒子對(duì)4種常見細(xì)菌大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的殺菌能力。結(jié)果顯示，納米MgO表現(xiàn)出極強(qiáng)的殺菌能力，在1 mM濃度下可以殺死50%以上細(xì)菌，5 mM濃度下可以殺死90%以上的細(xì)菌。殺菌能力其次為納米ZnO。不論是納米MgO還是納米ZnO都對(duì)革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的殺菌能力。納米TiO2與納米Al2O3雖然廣有報(bào)道具有殺菌能力，但就結(jié)果看來，兩者殺菌能力均不強(qiáng)。SiO2納米粒子均未發(fā)現(xiàn)有任何殺菌能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] CRISTINA S C， POSSAS A， ANNA J，et al. Enhanced high hydrostatic pressure lethality in acidulated raw pet food formulations was pathogen species and strain dependent[J].Food Microbiology，2022（104）：104002-.

[2] PELYUNTHA W， VONGKAMJAN K. Combined effects of Salmonella phage cocktail and organic acid for controlling Salmonella Enteritidis in chicken meat[J].Food Control，2022， （133）：108653.

[3] JANEKRONGTHAM C， DEJBURUM P， SUJINPRAM S ，et al.Outbreak of seafood-related food poisoning from undetectable Vibrio parahaemolyticus-like pathogen， Chiang Mai Province， Thailand， December 2020[J].Tropical Medicine And International Health，2022，27（1）：92-98.

[4] CONG X， MU Y， QIN D， et al.Copper deposited diatom-biosilica with enhanced photothermal and photodynamic performance for infected wound therapy[J].New Journal of Chemistry，2022：46.

[5] WANG Y， FANG Y， GU Y ，et al.Enhanced adsorption of fluoroquinolone antibiotics on Cu-modified porous boron nitride nanofibers in aqueous solution[J].Journal of Molecular Structure， 2022（1255）：132475.

[6] 饒發(fā)明，林希，黃維哲，等.聚酰胺胺超支化聚合物的細(xì)胞毒性及抗菌性能[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（8）：34-38.

[7] ABINAYA S， MORE B A S ，et al.Magnesium Oxide nanop

articles： effective antilarvicidal and antibacterial agents[J].American Chemical Society，2023（6）：5225-5233.

[8] FENG J N ， GUO X P ， CHEN Y R ，et al.Time-dependent effects of ZnO nanoparticles on bacteria in an estuarine aquatic environment[J].Science of The Total Environment， 2019（698）：134298.

[9] 葛桐，林仕偉，曹陽.納米二氧化鈦對(duì)熱帶海洋廣譜抑菌作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（17）：9419-9421.

[10] DOGRA V， KAUR G， JINDAL S，et al.Bactericidal effects of metallosurfactants based cobalt oxide/hydroxide nanoparticles against Staphylococcus aureus - ScienceDirect[J].Science of The Total Environment，2019（681）：350-364.

[11] HAILE T， NAKHLA G， ALLOUCHE E，et al.Evaluation of the bactericidal characteristics of nano-copper oxide or functionalized zeolite coating for bio-corrosion control in concrete sewer pipes[J].Corrosion Science，2010，52（1）：45-53.

[12] YANNING Z ， HONGHUI T ， LIMIN C ，et al.Studies on the bactericidal performance of indium doped nano-zinc oxide[J].Journal of Huazhong Normal University（Natural Sciences）， 2008， 42（3）：400-403.