楊新，盧紅梅，白成松，楊華連，陳莉＊

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025）

食醋是一種中國傳統(tǒng)的調(diào)味品，且深受大眾喜愛［1］。食醋是以糧谷為原料經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而制成的含醋酸的液態(tài)酸味調(diào)味品［2］。隨著國家富強、人民生活富裕，人們對食品的需求已經(jīng)不僅限于營養(yǎng)和感官品質(zhì)，而且希望在攝入營養(yǎng)的同時能夠促進人體健康，達到防病強身、延年益壽的目的［3－5］。按照釀造食醋的工藝分類，主要可以分為固態(tài)發(fā)酵工藝和液態(tài)發(fā)酵工藝［6］。采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法釀制的食醋，不僅色、香、味、體都非常典型，而且還具有濃郁的醇香味，體態(tài)澄清［7］。液態(tài)發(fā)酵釀醋工藝主要是采用純培養(yǎng)微生物進行發(fā)酵，這種工藝產(chǎn)品澄清透明，酸味清爽，產(chǎn)品質(zhì)量比較穩(wěn)定，原料利用率高，勞動強度相對較低，生產(chǎn)周期短，可以實現(xiàn)連續(xù)性、機械化生產(chǎn)［8］。

20世紀中后期，國內(nèi)外應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分析方法中的純培養(yǎng)技術(shù)研究食醋釀造過程中的功能微生物［9］。目前，傳統(tǒng)釀醋行業(yè)越來越得到人們的重視，對于食醋的研究從成品醋中風味物質(zhì)的研究上升到了對食醋釀造機理和食醋中功能微生物的深入研究［10，11］。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產(chǎn)的一種具有典型地方特色的優(yōu)質(zhì)食醋產(chǎn)品，它的原料選擇有講究，釀造過程精良，對質(zhì)量標準要求高，而且具有不可復(fù)制的獨特性。由于傳統(tǒng)的赤水曬醋釀造工藝周期長，產(chǎn)量低，難以滿足市場需求，因此部分企業(yè)對傳統(tǒng)工藝進行了改進，以縮短工藝周期，提高產(chǎn)量，但是部分新工藝產(chǎn)品出現(xiàn)了產(chǎn)氣、增粘等問題，不僅影響了產(chǎn)品質(zhì)量安全，也給企業(yè)信譽和形象造成了損害。因此，進行食醋中污染雜菌的相關(guān)研究成為食醋行業(yè)較為迫切的問題。

本研究以不同溫度和時間對赤水曬醋中污染雜菌的殺菌效果，多種防腐劑對赤水曬醋中污染雜菌的抑菌效果以及不同溫度和不同時間對變質(zhì)食醋的殺菌效果為研究對象，從而為雜菌的防治提供理論基礎(chǔ)及參考，這對于保障赤水曬醋產(chǎn)品質(zhì)量安全、減少企業(yè)經(jīng)濟損失都將具有切實的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

前期從變質(zhì)赤水曬醋中分離出來的保存于冰箱中的5株菌株，即菌株N3，N5，N7，N9，N11；某曬醋公司提供的樣品：出現(xiàn)產(chǎn)氣、粘稠現(xiàn)象的曬醋（以下簡稱問題食醋）；苯甲酸鈉（食品級）、山梨酸鉀（食品級）：上海博微生物科技有限公司；尼泊金乙酯（食品級）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；丙酸鈣（食品級）：成都臨江化工廠；尼泊金丙酯（食品級）：重慶北碚精細化工廠；LB液體培養(yǎng)基：按相關(guān)文獻進行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD－290W冰箱 青島海爾股份有限公司；HYG－A全溫搖瓶柜 金壇市盛藍儀器制造有限公司；SPX－250B智能型生化培養(yǎng)箱、pHS－3CpH 計、SN－CJ－IF潔凈工作臺 上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；DHG－9140B（101－2B）智能電熱恒溫鼓風干燥箱、YXQ－LS－5DS11立式壓力蒸汽殺菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ESJ220－4B電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；CH2043微電腦電磁爐 中山市格蘭仕生活電器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 殺菌溫度和時間對污染雜菌的影響

活化菌種：將前期從變質(zhì)赤水曬醋中分離的保存于冰箱中的菌株接種在裝有100mL LB液體培養(yǎng)基（最適pH，最適鹽度）的三角瓶中，在篩選溫度下培養(yǎng)至菌液濃度達到106～107cfu/mL。

接種活化的菌種按10%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基（最適pH，最適鹽度），靜置培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，按表1的處理方式進行殺菌處理，每個處理3個平行，以殺菌處理前后作為對照，殺菌處理完成之后，吸取合適稀釋度的0.20mL稀釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，然后培養(yǎng)2～3天，最后采用菌落計數(shù)法計算得出菌落總數(shù)［12］。

表1 殺菌溫度、時間對微生物生長的影響Table 1The effect of sterilization temperature and time on the growth of microorganisms

續(xù) 表

菌落總數(shù)計算公式：

式中：KZ為總菌落數(shù)，cfu/mL；k為稀釋倍數(shù)；x為同一稀釋度3個平皿上的菌落平均值；V為取樣體積。

殺菌率計算公式：

式中：R1為抑菌率；K0為殺菌處理前菌落數(shù)；K1為殺菌處理后菌落數(shù)。

1.3.2 不同防腐劑對菌株生長的影響

該實驗選用苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣、尼泊金丙酯5種防腐劑來研究防腐劑對5種微生物生長的影響［13］。根據(jù) GB 2760－2014《食品添加劑使用標準》在食醋中的規(guī)定：苯甲酸鈉和山梨酸鉀在食醋中的最大使用量均是1.00g/kg，尼泊金乙酯在食醋中的最大使用量是0.25g/kg，尼泊金丙酯在食醋中的最大使用量是0.10g/kg，丙酸鈣在食醋中的最大使用量是2.50g/kg，實驗均在規(guī)定的最大添加量內(nèi)進行［14－16］。實驗中的防腐劑濃度水平見表2。

表2 防腐劑濃度水平Table 2The levels of preservatives concentration g/L

本實驗僅做防腐劑的單因素實驗，按表2的濃度水平添加到實驗用培養(yǎng)基中。

在無菌條件下，用無菌蒸餾水分別配制苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣、尼泊金丙酯母液，母液濃度分別為50.00，50.00，12.50，125.00，5.00g/L，再按表3的添加量，用移液槍分別添加到裝有5mL已分別接有菌種的LB液體培養(yǎng)基的試管中，每支試管做3個平行，放置在45℃下?lián)u床培養(yǎng)24h。同時，以加等量生理鹽水作為對照。

表3 防腐劑添加量Table 3The additive amount of preservatives

結(jié)果測定：培養(yǎng)結(jié)束后，采用平板計數(shù)法對這5株菌進行3次平行重復(fù)測定，取其平均值，吸取合適稀釋度的0.20mL稀釋液涂布于平板上，通過菌落計算公式計算得出菌落總數(shù)，同時根據(jù)抑菌率公式計算其抑菌率。抑菌率越大，防腐劑的防腐效果就越好。

抑菌率計算公式：

式中：R2為抑菌率；K2為添加生理鹽水對照組的菌落數(shù)；K3為添加防腐劑的菌落數(shù)。

1.3.3 殺菌溫度和時間對變質(zhì)赤水曬醋中微生物的影響

取10.00mL問題食醋加到100mL錐形瓶中，按表4的處理方式進行殺菌處理，每個處理3個平行；以不處理的作為對照。殺菌處理完后，對其殺菌醋液做感官評價，并吸取合適稀釋度的醋液0.20mL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)2～3天。培養(yǎng)結(jié)束后，進行菌落計數(shù)并計算殺菌率。

表4 殺菌溫度、時間對食醋的影響Table 4The effect of sterilization temperature and time on vinegar

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌溫度和時間對赤水曬醋中污染雜菌的影響

2.1.1 殺菌溫度和時間對菌株N3的影響

在實驗條件下，對菌株 N3分別進行10，20，30min殺菌處理，以殺菌溫度為橫坐標、殺菌率為縱坐標，繪制菌株N3在殺菌過程中殺菌率的變化曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 殺菌時間和溫度對菌株N3的影響Fig.1The effect of sterilization time and temperature on strain N3

由圖1可知，在殺菌過程中殺菌率隨殺菌溫度的增加而增加，殺菌溫度和殺菌時間對菌株N3的影響較大。在殺菌溫度為75～115℃，殺菌10min時，殺菌率在30.98%～54.98%之間，殺菌率較低；殺菌20min時，殺菌率在44.95%～93.12%之間，殺菌率較高；殺菌30min時，殺菌率在44.95%～97.25%之間，殺菌率較高。在不同殺菌時間下，殺菌20min比殺菌10min的殺菌率有明顯的提高，殺菌30min比殺菌20min的殺菌率有所提高。殺菌溫度越高，殺菌時間越長，殺菌效果越好。

2.1.2 殺菌溫度和時間對菌株N5的影響

在實驗條件下，對菌株 N5分別進行10，20，30min殺菌處理，以殺菌溫度為橫坐標、殺菌率為縱坐標，繪制菌株N5在殺菌過程中殺菌率的變化曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 殺菌時間和溫度對菌株N5的影響Fig.2The effect of sterilization time and temperature on strain N5

由圖2可知，在殺菌過程中殺菌率隨殺菌溫度的增加而增加，殺菌溫度和殺菌時間對菌株N5的影響較大。在殺菌溫度為75～115℃，殺菌10min時，殺菌率在49.85%～79.95%之間，殺菌率較低；殺菌20min時，殺菌率在60.05%～99.75%之間，殺菌率較高；殺菌30min時，殺菌率在65.08%～99.75%之間，殺菌率較高。殺菌20min比殺菌10min的殺菌率有明顯的提高，殺菌30min與殺菌20min的殺菌率相當。殺菌溫度越高，殺菌時間越長，殺菌率越高。

2.1.3 殺菌溫度和時間對菌株N7的影響

在實驗條件下，對菌株 N7分別進行10，20，30min殺菌處理，以殺菌溫度為橫坐標、殺菌率為縱坐標，繪制菌株N7在殺菌過程中殺菌率的變化曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 殺菌時間和溫度對菌株N7的影響Fig.3The effect of sterilization time and temperature on strain N7

由圖3可知，在殺菌過程中殺菌率隨殺菌溫度的增加而增加，殺菌溫度和殺菌時間對菌株N7的影響較大。在殺菌溫度為75～115℃，殺菌10min時，殺菌率在30.95%～54.95%之間，殺菌率較低；殺菌20min時，殺菌率在44.90%～93.05%之間，殺菌率較高；殺菌30min時，殺菌率在44.95%～97.25%之間，殺菌率較高。殺菌20min比殺菌10min的殺菌率有明顯的提高，殺菌30min比殺菌20min的殺菌率有一定的提高，但沒有前面明顯。殺菌溫度越高，殺菌時間越長，殺菌率越高。

2.1.4 殺菌溫度和時間對菌株N9的影響

在實驗條件下，對菌株 N9分別進行10，20，30min殺菌處理，以殺菌溫度為橫坐標、殺菌率為縱坐標，繪制菌株N9在殺菌過程中殺菌率的變化曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 殺菌時間和溫度對菌株N9的影響Fig.4The effect of sterilization time and temperature on strain N9

由圖4可知，在殺菌過程中殺菌率隨殺菌溫度的增加而增加，殺菌溫度和殺菌時間對菌株N9的影響較大。在殺菌溫度為75～115℃，殺菌10min時，殺菌率在25.02%～40.25%之間，殺菌率較低；殺菌20min時，殺菌率在44.05%～93.85%之間，殺菌率較高；殺菌30min時，殺菌率在54.05%～93.85%之間，殺菌率較高。殺菌20min比殺菌10min的殺菌率有明顯的提高，殺菌30min比殺菌20min的殺菌率有一定的提高，但沒有前面明顯。殺菌溫度越高，殺菌時間越長，殺菌率越高。

2.1.5 殺菌溫度和時間對菌株N11的影響

在實驗條件下，對菌株N11分別進行10，20，30min殺菌處理，以殺菌溫度為橫坐標、殺菌率為縱坐標，繪制菌株N11在殺菌過程中殺菌率的變化曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 殺菌時間和溫度對菌株N11的影響Fig.5The effect of sterilization time and temperature on strain N11

由圖5可知，在殺菌過程中殺菌率隨殺菌溫度的增加而增加，殺菌溫度和殺菌時間對菌株N11的影響較大。在殺菌溫度為75～115℃，殺菌10min時，殺菌率在34.54%～57.05%之間，殺菌率較低；殺菌20min時，殺菌率在45.82%～96.12%之間，殺菌率較高；殺菌30min時，殺菌率在49.97%～96.12%之間，殺菌率較高。殺菌20min比殺菌10min的殺菌率有明顯的提高，殺菌30min比殺菌20min的殺菌率有一定的提高，但沒有前面明顯。殺菌溫度越高，殺菌時間越長，殺菌率越高。

2.2 防腐劑對污染雜菌的影響

在實驗條件下，通過菌落計算公式計算得到不同條件下的菌落總數(shù)，然后用殺菌率公式計算得到不同條件下的殺菌率，從而繪制直方圖。

2.2.1 各種防腐劑對菌株N3的影響

圖6 不同濃度水平的各種防腐劑對菌株N3的抑菌率Fig.6The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N3

由圖6可知，5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）對菌株N3的抑菌率均在96.90%以上，當5種防腐劑均按國標GB/T 2760－2011規(guī)定的最大量添加時，丙酸鈣的抑菌率＞山梨酸鉀的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞苯甲酸鈉的抑菌率。山梨酸鉀和尼泊金乙酯的濃度變化對菌株N3的抑菌率有較大的影響，山梨酸鉀的濃度從1.00g/L調(diào)為0.20g/L時，對菌株N3的抑菌率從98.98%下降到97.53%，下降了1.45%；尼泊金乙酯的濃度從0.25g/L調(diào)為0.05g/L時，對菌株N3的抑菌率從98.66%下降到96.90%，下降了1.76%。苯甲酸鈉、丙酸鈣和尼泊金丙酯的濃度變化對菌株N3的抑菌率影響不大，抑菌率變化均不大于0.61%。

2.2.2 各種防腐劑對菌株N5的影響

圖7 不同濃度水平的各種防腐劑對菌株N5的抑菌率Fig.7The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N5

由圖7可知，5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）對菌株N5的抑菌率均在96.60%以上，當5種防腐劑均按國標GB/T 2760－2011規(guī)定的最大量添加時，苯甲酸鈉的抑菌率＞丙酸鈣的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞山梨酸鉀的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率。山梨酸鉀和尼泊金乙酯的濃度變化對菌株N5的抑菌率有較大的影響，山梨酸鉀的濃度從1.00g/L調(diào)為0.20g/L時，對菌株N5的抑菌率從98.48%下降到97.03%，下降了1.45%；尼泊金乙酯的濃度從0.25g/L調(diào)為0.05g/L時，對菌株N5的抑菌率從98.36%下降到96.60%，下降了1.76%。苯甲酸鈉、丙酸鈣和尼泊金丙酯的濃度變化對菌株N5的抑菌率影響不大，抑菌率變化均不大于0.68%。

2.2.3 防腐劑對菌株N7的影響

圖8 各防腐劑不同濃度水平對菌株N7的抑菌率Fig.8The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N7

由圖8可知，5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）中，除了丙酸鈣的抑菌率在88.66%～91.23%之間外，其他4種防腐劑對菌株N7的抑菌率均在96.30%以上，當5種防腐劑均按國標GB/T 2760－2011規(guī)定的最大量添加時，山梨酸鉀的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞苯甲酸鈉的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞丙酸鈣的抑菌率。丙酸鈣和尼泊金乙酯的濃度變化對菌株N7的抑菌率有較大的影響，丙酸鈣的濃度從2.50g/L調(diào)為0.50g/L時，對菌株N7的抑菌率從91.23%下降到88.66%，下降了2.57%；尼泊金乙酯的濃度從0.25g/L調(diào)為0.05g/L時，對菌株N7的抑菌率從98.44%下降到96.30%，下降了1.14%。苯甲酸鈉、山梨酸鉀和尼泊金丙酯的濃度變化對菌株N7的抑菌率影響不大，抑菌率變化均不大于0.88%。

2.2.4 防腐劑對菌株N9的影響

圖9 各防腐劑不同濃度水平對菌株N9的抑菌率Fig.9The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N9

由圖9可知，5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）對菌株N9的抑菌率均在97.02%以上，當5種防腐劑均按國標GB/T 2760－2011規(guī)定的最大量添加時，苯甲酸鈉的抑菌率＞丙酸鈣的抑菌率＞山梨酸鉀的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率。山梨酸鉀和尼泊金乙酯的濃度變化對菌株N9的抑菌率有較大的影響，山梨酸鉀的濃度從1.00g/L調(diào)為0.20g/L時，對菌株 N9的抑菌率從98.98%下降到97.56%，下降了1.42%；尼泊金乙酯的濃度從0.25g/L調(diào)為0.05g/L時，對菌株 N9的抑菌率從98.71%下降到97.02%，下降了1.69%。苯甲酸鈉、丙酸鈣和尼泊金丙酯的濃度變化對菌株N9的抑菌率影響不大，抑菌率變化均不大于0.65%。

2.2.5 防腐劑對菌株N11的影響

圖10 各防腐劑不同濃度水平對菌株N11的抑菌率Fig.10The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N11

由圖10可知，5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）中，只有苯甲酸鈉和丙酸鈣對菌株N11的抑菌率在97.85%以上，山梨酸鉀、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯對菌株N11的抑菌率均在92.00%～94.71%。當5種防腐劑均按國標GB/T 2760－2011規(guī)定的最大量添加時，苯甲酸鈉的抑菌率＞丙酸鈣的抑菌率＞山梨酸鉀的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率。山梨酸鉀和丙酸鈣的濃度變化對菌株N11的抑菌率有較大的影響，山梨酸鉀的濃度從1.00g/L調(diào)為0.20g/L時，對菌株N11的抑菌率從94.71%下降到93.64%，下降了1.07%；丙酸鈣的濃度從2.50g/L調(diào)為0.50g/L時，對菌株N11的抑菌率從98.71%下降到97.02%，下降了1.69%。苯甲酸鈉、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯的濃度變化對菌株N11的抑菌率影響不大，抑菌率變化均不大于0.86%。

2.3 殺菌溫度和時間對變質(zhì)赤水曬醋中微生物的影響

在實驗條件下，通過實驗及計算得到不同處理方式下的菌落數(shù)和抑菌率，并通過感官評價得到食醋的感官評語，結(jié)果見表5。

表5 殺菌溫度和時間對變質(zhì)赤水曬醋中微生物的影響Table 5The effect of sterilization temperature and time on microorganisms in the metamorphic Chishui sun vinegar

由表5可知，隨著殺菌溫度的升高和殺菌時間的延長，殺菌率逐漸提高。采用單次殺菌（即：一次殺菌結(jié)束后就用來檢測微生物含量），殺菌率≤96.57%；采用兩次殺菌（即：一次殺菌結(jié)束后，隔夜，再進行第二次殺菌），殺菌率有了顯著的提高，殺菌率達到98.13%以上。顯然兩次殺菌的效果比單次殺菌的效果要好，在85℃殺菌30min，殺菌率提高了28.97%；在95℃殺菌30min，殺菌率提高了1.56%?？赡艿脑蚴?，問題食醋中的微生物主要是芽孢桿菌，第一次殺菌時，消滅了問題食醋中的非芽孢狀態(tài)的微生物，問題食醋中的芽孢沒有被消滅。待隔夜之后，問題食醋的芽孢萌發(fā)，成為活躍的微生物。進行第二次殺菌時，由芽孢萌發(fā)的微生物被消滅。因此，經(jīng)過兩次殺菌，使得殺菌率得到很大的提高。雖然延長殺菌時間和進行兩次殺菌能夠很大地提高殺菌率，但是，殺菌的時間和進行兩次殺菌對食醋的風味影響很大。所以，在采取對食醋進行殺菌的方式上應(yīng)該慎重考慮。

3 結(jié)論

赤水曬醋受雜菌污染后，通過實驗得出殺菌溫度和時間對5株污染雜菌的影響不一樣，但殺菌率都隨溫度和時間的增加而增加，溫度越高、時間越長，殺菌效果越好，對食醋中微生物的殺菌效果也越好，兩次殺菌比單次殺菌效果好，但是，殺菌溫度過高（超過95℃）、時間過長和兩次殺菌，會導(dǎo)致食醋的風味發(fā)生改變，如食醋變得焦糊香或糊味、酸味很低等。綜合考慮殺菌溫度、殺菌時間、殺菌次數(shù)以及殺菌后食醋的風味變化得出：95℃殺菌30min是比較好的方案，殺菌率達到了96.57%。

不同防腐劑對這5株菌的影響均不一樣。5種防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯、丙酸鈣和尼泊金丙酯）對菌株N3，N5和N9的抑菌率均在96.30%以上，而對菌株N7，N11的抑菌率均在88.66%以上，其中，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯對菌株N7的抑菌率均在96.30%以上，苯甲酸鈉和丙酸鈣對菌株N11的抑菌率均在97.85%以上。綜合考慮5種防腐劑對5株菌的影響，苯甲酸鈉對這5株菌的抑菌率是最高的，這對赤水曬醋的產(chǎn)氣及增粘方面的防治具有借鑒意義。