烏雅漢 莫日根 呼和 額爾敦呼 烏日汗 白明君 包書(shū)茵▲ 包桂花▲

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎右旗阿拉坦額莫勒鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，內(nèi)蒙古阿拉坦額莫勒鎮(zhèn) 021300；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院國(guó)家蒙藥制劑中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

沙蓬是蒙醫(yī)常用傳統(tǒng)藥材，為藜科沙蓬A(yù)griophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分。蒙文名為楚力格日或楚勒格日，別名為吉刺兒[1-2]。該藥始載于《四部醫(yī)典》，其中曰：“楚力格日別名吉刺兒，用于疫熱、毒熱以及腎熱癥”[3]，繼后《認(rèn)藥學(xué)》[4]《認(rèn)藥白晶鑒》[5]《無(wú)誤蒙藥鑒》[6]《遼寧植物》[7]《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》[8]等著作中也見(jiàn)有關(guān)于沙蓬的記載。沙蓬味苦、澀，性平，效糙；具有抑疫，清熱，鎮(zhèn)赫依，解毒，利尿等功效，主要治療疫熱增盛引起的神志不清、身目黃染，希日引起的胃刺痛、口糜、齒齦潰爛、尿道灼痛、腎熱等癥。沙蓬中主要含有黃酮類(lèi)等成分[9]，具有降糖、保護(hù)腎臟等藥理作用[10-11]。

本文以沙蓬莖、葉、花為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）同時(shí)測(cè)定沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的含量，分析比較不同部位中的分布情況，為沙蓬的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料2022年9月采集于通遼市奈曼旗，由包桂花教授鑒定為藜科沙蓬[Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.]的莖、葉、花。槲皮素（C15H10O7）對(duì)照品（批號(hào)：100081-201610）、異鼠李素（C11H12O7）對(duì)照品（批號(hào)：110860-202012）純度＞98%，由中檢院提供，水為高純水，甲醇為色譜純，其他所用乙醇、磷酸、鹽酸試劑等均是分析純。

1.2 儀器

SHIMADZU SPD-20A LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），色譜柱[Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5μm）]，AUW220D電子天平（Max 220 g d=0.01 mg，中國(guó)北京），微量進(jìn)樣器（中國(guó)上海），KQ-100超聲波清洗器（中國(guó)昆山）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[12-13]

色譜柱為Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），選擇甲醇-0.1%磷酸（58∶42）為流動(dòng)相，370 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，30℃為柱溫，1.0 ml/min為流速，10 μl為進(jìn)樣量。在此條件下槲皮素、異鼠李素的分離度大于1.5，對(duì)照品與供試品的色譜圖（圖1）。

圖1 混合對(duì)照品（A）、沙蓬葉（B）、沙蓬花（C）、沙蓬莖（D）HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素11.1 mg和異鼠李素10.1 mg，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇制成1 ml中含槲皮素0.042 69 mg和異鼠李素0.168 33 mg的混合溶液[14-15]。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取沙蓬花樣品約0.1 g，置100 ml的具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 ml，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量。再精密加入3.5 ml鹽酸溶液，稱定重量，75℃水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，濾過(guò)，精密量取2.0 ml續(xù)濾液，即得。詳細(xì)換算公式為CX=CR/AR×AX，其中CR為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、AR為標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積、CX為樣品的濃度、AX為樣品的峰面積。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以槲皮素和異鼠李素的濃度為橫坐標(biāo)（x），以槲皮素和異鼠李素的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。依次y1=4×106x1+3039，r1=0.999 9，y2=1×106x2+6637，r2=0.999 7。結(jié)果表明，槲皮素和異鼠李素分別在0.0107～0.5336 μg、0.0421～2.1038 μg范圍內(nèi)與峰面積具有很好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，制備供試品溶液，在本次試驗(yàn)的色譜條件下進(jìn)樣（n=6），測(cè)定色譜峰峰面積值。結(jié)果槲皮素和異鼠李素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.51%和1.35%，表明儀器精密、測(cè)量值誤差小。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，制備供試品溶液，在本次試驗(yàn)的色譜條件下每隔2 h進(jìn)樣1次（n=6），共觀察10 h，結(jié)果樣品中槲皮素和異鼠李素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.95%和1.05%。表明建立方法中的沙蓬花樣品溶液的穩(wěn)定性在10 h內(nèi)良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，共6份，精密稱定，在本次試驗(yàn)的色譜條件下進(jìn)樣（n=6），測(cè)定峰面積值。槲皮素和異鼠李素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.88%和1.98%，結(jié)果含量測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批次沙蓬花樣品6份，每份約0.05 g，分別加入適量的2種對(duì)照品，按2.3方法制備供試品溶液后進(jìn)樣測(cè)定峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果沙蓬花樣品溶液中2種成分的回收率分別為100.06%和102.59%，RSD分別為1.52%和1.67%。見(jiàn)表1～2。

表1 槲皮素回收率結(jié)果（n=6）

表2 異鼠李素回收率結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測(cè)定

分別稱取沙蓬莖、葉、花約0.1 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下法制備供試品溶液，在本次試驗(yàn)的色譜條件下進(jìn)樣（n=6），記錄樣品溶液中2種成分的色譜峰峰面積值，計(jì)算其含量。見(jiàn)表3～5。

表3 沙蓬莖含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

表4 沙蓬葉含量測(cè)定（n=6）

表5 沙蓬花含量測(cè)定（n=6）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將槲皮素和異鼠李素對(duì)照品溶液在200～400 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在370 nm時(shí)均有最大吸收并無(wú)干擾，所以選擇確定370 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法的選擇

制備供試品溶液時(shí)對(duì)比了超聲處理提取和加熱回流提取，加熱回流提取時(shí)槲皮素和異鼠李素的含量均高于超聲處理提取，故本研究中選擇加熱回流提取。

3.3 考察加熱回流時(shí)間

考察樣品加熱回流0.5、1、1.5 h，1.5 h時(shí)樣品中槲皮素和異鼠李素的含量高于0.5 h和1 h，故本試驗(yàn)采用加熱回流處理1.5 h。

3.4 柱溫的選擇

考察柱溫分別為25℃、30℃、35℃條件對(duì)槲皮素和異鼠李素分離效果的影響，結(jié)果柱溫為30℃時(shí)分離效果好于其他條件，故選擇柱溫為30℃。

本研究以沙蓬不同部位莖、葉、花為研究對(duì)象，建立一種同時(shí)測(cè)定槲皮素和異鼠李素含量的方法，分析比較槲皮素和異鼠李素在沙蓬莖、葉、花中的分布情況。結(jié)果表明，沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的總量依次為沙蓬葉＞沙蓬花＞沙蓬莖，并且沙蓬葉中槲皮素和異鼠李素的含量最高，沙蓬莖中槲皮素和異鼠李素的含量最低；在《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)·2021年版》中規(guī)定，沙蓬干燥地上部分中槲皮素和異鼠李素的總量不得少于0.24%，那么，沙蓬葉和沙蓬花中2種成分的含量均高于0.24%，具有較好的研發(fā)前景，為沙蓬不同部位的研究開(kāi)發(fā)提供理論參考。

在本實(shí)驗(yàn)所確定的色譜條件下，沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算均不低于2500，槲皮素和異鼠李素均基線分離，分離度（R＞ 1.5），拖尾因子T值分別為1.04和1.02。在方法學(xué)考察試驗(yàn)中槲皮素和異鼠李素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于2.0%，槲皮素和異鼠李素的回收率分別為100.06%、102.59%，RSD值分別為1.52%、1.67%，表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，所建立的方法可用于蒙藥沙蓬莖、葉、花中該2種成分的含量測(cè)定。