王倩 楊軍 陳衛(wèi)英 文國琴 楊鵬 李正國 鄒建

摘 要：為了挖掘番茄（Solanum lycopersicum）株高發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因，本文以櫻桃番茄Micro Tom及其矮化突變體dwt為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序和表達水平分析篩選鑒定到15個與株高發(fā)育調(diào)控相關(guān)的候選基因。其中，TCH4-like1、TCH4-like2、ABAR7、ABAR10、PP2C7、PP2C13和PR1等基因的表達異常，從而影響B(tài)Rs、ABA和SA信號途徑，并抑制番茄的生長，進而導(dǎo)致dwt番茄矮化。同時，ABAR7、ABAR10、PP2C7、PP2C13、PR1等基因與WRKY33、MPK3基因共同影響MAPK信號途徑，從而調(diào)控dwt突變體矮化性狀的形成。另外，peroxidase-like1、peroxidase-like2和peroxidase-like3等基因的表達受到強烈抑制，從而影響dwt木質(zhì)素合成，并促成dwt的矮化特征形成。結(jié)果可為番茄株高發(fā)育調(diào)控中關(guān)鍵調(diào)控基因的鑒定奠定良好基礎(chǔ)，同時也為番茄矮化育種提供重要線索。

關(guān)鍵詞：番茄；矮化；轉(zhuǎn)錄組測序；激素

中圖分類號：Q37 文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1673-5072（2024）02-0134-08

番茄（Solanum lycopersicum）作為世界上種植最廣泛、消耗量最大的蔬菜作物，其果實是人類重要的食物和營養(yǎng)來源，在居民的膳食結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要地位。因此，提高產(chǎn)量和品質(zhì)、輕簡化栽培是番茄育種和農(nóng)藝研究的重要任務(wù)。以株高為代表的株型是影響作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，而理想株型的選育是實現(xiàn)栽培輕簡化的重要途徑［1-2］。作為作物矮化育種的重要種質(zhì)來源，矮稈作物種質(zhì)資源被廣泛用于作物理想株型的選育［2］。Bishop等［3］報道了具有極端矮小表型的番茄dwarf突變體，可以作為番茄矮化育種的重要種質(zhì)資源。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物生長抑制劑多效唑能有效促使番茄株高降低，莖桿增粗，還能加快果實形成，提高番茄的早果產(chǎn)量［4］。此外，崔東禹等［5］研究發(fā)現(xiàn)，矮化密植處理能明顯增加番茄產(chǎn)量，并有效保持果實品質(zhì)。

在植物生長發(fā)育過程中，細胞大小和細胞分裂速度對于株高起著至關(guān)重要的作用，并受到眾多基因和激素信號的調(diào)控。已有報道顯示，生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GAs）、油菜素內(nèi)酯（BRs）和水楊酸（SA）等植物激素均在植物的株高形態(tài)建成方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6-8］。在柑橘（Citrus sinensis）中，八氫番茄紅素去飽和酶基因沉默能夠抑制參與ABA生物合成的類胡蘿卜素化合物的形成，并改變植物激素的分布，從而導(dǎo)致植物內(nèi)ABA缺乏，使植株矮化。Clouse等［9］在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)了一個對BRs不敏感的矮化突變體bri1，該突變體形成的原因是BRs受體功能缺失導(dǎo)致BRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，且該突變體植株矮化，葉片變厚，顏色加深，即使噴灑外源BRs也不能恢復(fù)突變體的表型，證明BRs在植物株高控制中起著關(guān)鍵作用。此外，BRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵因子BIN2在植物株高調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要作用，BRs通過BSK1-1和CDG1蛋白激活BSU1，引起B(yǎng)IN2去磷酸化后降低其活性，從而促進植物生長［10］。反之，當(dāng)植物中BRs處于較低水平時，BIN2通過磷酸化作用被激活，抑制植物的徑向生長，導(dǎo)致植株矮化。在水稻中，BIN2基因過量表達也能夠引起植株矮化［10］。SA不僅參與植物的生物脅迫和非生物脅迫，而且在植物株高的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［7］。水稻矮化突變體yld1葉片中，SA高水平積累引起片早衰、植株矮化［11］。此外，在擬南芥中，SIZ1基因缺失能夠引起SA高水平積累，抑制細胞分裂和伸長，促使植株嚴重矮化［12］。

然而，在番茄株高發(fā)育中激素信號間的相互作用關(guān)系以及關(guān)鍵基因的作用機制仍不清楚。本文以番茄矮化突變體dwt為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)分析野生型和突變體的差異表達基因（DEGs），篩選鑒定番茄株高調(diào)控相關(guān)基因，以探究dwt突變體矮化性狀的形成原因。研究結(jié)果可以為解析番茄株高調(diào)控的分子機制提供線索，也可為選育矮化高產(chǎn)、適宜輕簡栽培的優(yōu)良番茄品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究以櫻桃番茄Micro Tom墅生型（WT）及其矮化突變體dwt為實驗材料，將其種植于人工氣候室內(nèi)（溫度25±2 ℃，濕度70%，光照強度8 000 lx，光照14 h/黑暗10 h）。

1.2 株高統(tǒng)計

將WT和矮化突變體dwt種子種植于人工氣候室，每10 d測量1次植株高度，60 d時對WT和dwt進行拍照，記錄株型特征，分析株型差異。

1.3 葉片發(fā)育分析

分別取20片WT和dwt葉片測量其葉片面積和質(zhì)量，計算比葉重。再分別取20片葉片稱重，剪碎，加入無水乙醇并置于4 ℃中浸泡，至葉片變成無色。以無水乙醇作為參比溶液，取無水乙醇提取液測量在663、646、470 nm處的光吸收值，分別計算葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

以WT和dwt的莖和葉片為實驗材料，采集后立即于液氮中速凍，并于-80 ℃保存。參照E.Z.N.APlant RNA Kit（OMEGA，美國）方法提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000c（Thermo，美國）檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù) PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser （Perfect Real Time）（Takara，大連）方法將所提取的1 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入ddH2O稀釋至10 ng·μL-1，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達基因分析

將提取的總RNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（上海，中國）進行Illumina轉(zhuǎn)錄組測序。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的TPM值，設(shè)置FDR<0.05，|log2FC|≥1，篩選與dwt突變體突變性狀形成相關(guān)的DEGs。隨后，通過在線網(wǎng)站kobas （http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）對DEGs進行KEGG富集分析，通過在線網(wǎng)站agriGO（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php）對DEGs進行GO富集分析，并利用R軟件中g(shù)gplot2對KEGG和GO富集分析結(jié)果進行可視化分析。

1.6 qRT-PCR檢測基因表達量

以SlUBI為內(nèi)參基因，dwt和WT的葉片及莖的cDNA為模板，參照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara，大連）進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR體系為20 μL，包括：TaqⅡ×2 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)后，65 ℃充分延伸60 s。設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 株型和發(fā)育進程對比

表型結(jié)果顯示（圖1A）：相比于WT，dwt突變體的整體株型呈現(xiàn)出明顯的矮化特征，株型緊湊，其葉片和果實均小于WT，葉片顏色較WT更綠。

從生長曲線可以看出（圖1B）：在整個生長發(fā)育過程中，dwt植株高度均顯著低于WT，植株發(fā)育明顯遲緩。WT植株的首花開放時間為萌發(fā)后50 d左右，而dwt植株為65 d左右，發(fā)育延緩近15 d。萌發(fā)后20～40 d兩種植株的生長速度均明顯加快；萌發(fā)后40 d之后WT植株高度繼續(xù)增加，而dwt植株生長緩慢，其高度趨于穩(wěn)定。種子萌發(fā)后70 d時，WT植株的高度才趨于穩(wěn)定，兩者的植株高度差達到最大值，約12 cm。以上結(jié)果表明，dwt植株生長緩慢和較早進入生長穩(wěn)定期是導(dǎo)致其植株矮化的重要原因。

葉片分析結(jié)果顯示：dwt的比葉重為0.015 7 g·cm-2，顯著高于WT的比葉重（0.013 0 g·cm-2）（圖1C，P<0.05）；WT和dwt的類胡蘿卜素含量無顯著差異（圖1D），但dwt的葉綠素a和葉綠素b含量均顯著高于WT（圖1E和F，P<0.05）；WT和dwt的葉綠素a和葉綠素b的比值無顯著差異（圖1G）。以上結(jié)果說明，高含量的葉綠素a和葉綠素b以及葉片厚度是dwt葉片顏色更綠的重要原因。

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析及差異表達基因篩選

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，本文隨機挑選了10個基因，通過qRT-PCR技術(shù)進行表達水平檢測，并利用SPSS軟件做線性回歸分析。結(jié)果顯示，這10個基因的qRT-PCR檢測結(jié)果和RNA-Seq數(shù)據(jù)中基因的結(jié)果高度一致，線性回歸方程的R2=0.838，F(xiàn)=196.519，P<0.05，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有較高的可靠性（圖2A）。

WT和dwt的葉及莖中分別轉(zhuǎn)錄組測序獲得48 211 116條（WT-L）、49 776 715條（dwt-L）、51 941 351條（WT-S）和52 636 873條（dwt-S）Reads，其中分別有94.47%、95.32%、94.74%和94.18%的Reads可在番茄基因組中被定位和注釋（圖2B），同時獲得41 226個轉(zhuǎn)錄本和40 229個可定位基因（圖2C）。在葉中鑒定到628個DEGs，莖中鑒定到1 044個DEGs，其中莖和葉中共有的DEGs的有207個，占所有DEGs的17.80%（圖2D）。在這些共有DEGs中，與TW相比，在dwt葉片中上調(diào)的DEGs有100個，占葉所有DEGs的48%，下調(diào)的DEGs有107個，占葉所有DEGs的52%（圖2E）。另外，在dwt莖中上調(diào)的DEGs有104個，下調(diào)的DEGs有103個，均約占莖所有DEGs的50%（圖2E）。以上說明，這207個共有DEGs在矮化表型形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

為了進一步分析這些共有DEGs的生物學(xué)功能，本文進行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs被分為3個GO類別：生物過程、細胞成分和分子功能，獲得13個生物過程富集條目、7個細胞組分條目和1個分子功能條目（圖3A）。其中，細胞代謝過程（cellular metabolic process，GO：0044237）、細胞大分子代謝過程（cellular macromolecule metabolic process，GO：0044260）、大分子代謝過程（macromolecule metabolic process，GO：0043170）、細胞過程（cellular process，GO：0009987）和催化活性（catalytic activity，GO：0003824）等5個通路中富集到較多基因（圖3A），說明番茄的株高調(diào)控可能與這些生物學(xué)途徑存在關(guān)聯(lián)。

為了進一步分析這些共有DEGs具體發(fā)揮功能的途徑，本文對207個共有DEGs進行KEGG通路富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3B）：這些基因主要富集到28個通路上。其中，4個富集通路P<0.05，為可信度較高的富集通路，包括MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（MAPK signaling pathway-plant，map04016）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction，map04075）、植物病原體相互作用（plant-pathogen interaction，map04026）和苯丙烷生物合成通路（phenylpropanoid biosynthhesis，map00940），分別富集到7、7、4和4個基因。在這4個通路中，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成與植物生長調(diào)控之間可能存在較大關(guān)聯(lián)。因此，富集在這些通路中的基因可能參與番茄株高的調(diào)控，并在dwt矮化性狀的形成中發(fā)揮作用。

2.3 差異表達基因的表達水平分析及功能預(yù)測

對富集在4大途徑中的DEGs進行功能注釋（表1），并進一步分析這些DEGs表達水平。結(jié)果顯示（圖4），富集在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的PP2C7和PP2C13基因在dwt植株的莖和葉片中表達水平均被上調(diào)，而PR1、SlRCAR7、SlRCAR10、WRKY33、MPK3基因均被下調(diào)。在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因PR1、ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因SlRCAR7和SlRCAR10、BRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因TCH4-like1和TCH4-like2在dwt的莖和葉片中表達水平均被顯著下調(diào)，而ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因PP2C7和PP2C13在dwt的莖和葉片中的表達水平被顯著上調(diào)。另外，在植物病原體相互作用通路中，CML-like1、CML-like2、PR1和WRKY33在dwt的莖和葉片中的表達均被強烈抑制。在苯丙烷合成通路中，木質(zhì)素合成相關(guān)基因CAD在dwt的莖和葉片中被上調(diào)，而peroxidase-like1、peroxidase-like2和peroxidase-like3基因在dwt中被強烈抑制。以上結(jié)果說明，涉及MAPK信號和激素信號等途徑相關(guān)基因的異常表達可能是導(dǎo)致dwt矮化性狀產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。

3 討 論

番茄作為世界上種植最廣泛、消耗量最大的蔬菜作物，其產(chǎn)量受到株高影響。矮稈種質(zhì)資源作為選育矮化品種的基礎(chǔ)，廣泛用于作物抗倒伏性狀的改良和理想株型的選育［13］。株高控制關(guān)鍵基因在優(yōu)質(zhì)矮化品種選育中常作為重要的輔助選擇分子標(biāo)記發(fā)揮重要作用［14-15］。因此，番茄株高控制相關(guān)基因的篩選鑒定對于番茄矮化品種的選育具有重要意義。本文的研究對象，番茄矮化突變株dwt整體株型矮小緊湊，是研究番茄株高調(diào)控以及篩選株高控制相關(guān)基因的理想材料。

被子植物的株高發(fā)育調(diào)控是一個極為復(fù)雜的進程，在該進程中GAs、BRs、ABA和SA等植物激素發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［16］。其中，BRs對植物生長具有促進作用，BRs合成缺陷將導(dǎo)致擬南芥呈現(xiàn)典型的矮化性狀［17］。在水稻中，BRs信號受體激酶基因OsBRI1功能缺失，導(dǎo)致水稻BRs敏感性降低，使水稻節(jié)間嚴重縮短，表明BRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻將嚴重影響水稻的株高［18］。在本文中，dwt突變體的BRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因TCH4-like1和TCH4-like2被強烈抑制，而他們的表達高度依賴于BRs的積累［19］。因此，推測dwt中較低的BRs水平可能抑制了TCH4-like1和TCH4-like2表達，導(dǎo)致dwt植株嚴重矮化。另外，ABA作為重要的植物激素，對植物株高發(fā)育具有強烈抑制作用。在梨樹中，IAA、GAs、BRs和茉莉酸（JA）等激素水平無明顯變化的情況下，僅高水平的ABA就能強烈抑制梨樹pbpat14突變體植株的生長，致使其嚴重矮化［20］。ABA受體和PP2C作為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核心元件，在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16］。Ren等［21］在擬南芥中過表達PP2C家族基因?qū)е缕渲仓昝黠@矮化，而Zhao等［22］的研究顯示PYL多基因功能缺失突變也能導(dǎo)致擬南芥植

株嚴重矮化。在本研究中，dwt突變體中PP2C蛋白編碼基因PP2C7和PP2C13異常高表達，同時ABA受體基因ABAR7和ABAR10的表達被強烈抑制，可能是導(dǎo)致番茄dwt突變體嚴重矮化的重要原因。此外，植物激素SA通常被認為與植物生物脅迫響應(yīng)和抗病性緊密關(guān)聯(lián)，而近年來的研究顯示該激素對植株株高發(fā)育具有抑制作用［23］。在擬南芥中，高水平的內(nèi)源SA對pi4kⅢβ1β2突變體的生長具有強烈抑制作用，并導(dǎo)致其矮化性狀形成［23］。由此推測，dwt中SA信號響應(yīng)基因PR1的異常表達，可能會影響SA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響番茄的生長和株高的發(fā)育。綜上結(jié)果說明，TCH4-like1、TCH4-like2、ABAR7、ABAR10、PP2C7、PP2C13和PR1等株高調(diào)控相關(guān)基因，可能通過介導(dǎo)BRs、ABA和SA等激素信號調(diào)控番茄的生長和株高形成，而它們異常表達將嚴重影響B(tài)Rs、ABA和SA等激素信號，從而抑制番茄的生長，導(dǎo)致dwt植物嚴重矮化。

另外，在高等植物中MAPK信號途徑參與細胞增殖和分化進程的調(diào)控，從而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和株高形態(tài)建成［24-26］。PR1、ABAR10、WRKY33、PP2C13、PP2C7、ABAR7和MPK3等7個MAPK信號相關(guān)基因的異常表達，可能通過影響MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響番茄細胞增殖和分化，從而在dwt矮化性狀形成中發(fā)揮作用。高等植物的木質(zhì)素合成對于維持植株的正常生長具有至關(guān)重要的作用。在擬南芥中，通過RNAi沉默木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因HCT的表達，能顯著降低植株中的木質(zhì)素合成，使得擬南芥的株高顯著降低，說明木質(zhì)素合成對植物生長具有重要作用［27］。本文的研究結(jié)果顯示，苯丙烷合成相關(guān)基因peroxidase-like1、peroxidase-like2和peroxidase-like3在dwt中被嚴重抑制，這可能會影響dwt番茄中木質(zhì)素的合成和積累，從而影響番茄的高度。以上結(jié)果說明，ABAR7、ABAR10、PP2C7、PP2C13、PR1等基因可能與WRKY33、MPK3基因共同作用影響MAPK信號，參與番茄株高的調(diào)控，并在dwt矮化性狀形成中發(fā)揮作用；peroxidase-like1、peroxidase-like2和peroxidase-like3被顯著抑制可能會影響dwt的木質(zhì)素合成，以促成dwt矮化特征的形成。

此外，在dwt突變體中PR1、MPK3、CML-like1和CML-like2等4個病原體相互作用及植物脅迫響應(yīng)相關(guān)基因也被顯著下調(diào)?，F(xiàn)有的報道顯示，CML成員基因在植物防衛(wèi)和干旱脅迫發(fā)揮重要的作用，其成員CML42基因在該進程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負調(diào)控作用［28］，說明PR1、MPK3、CML-like1和CML-like2可能還參與番茄的抗病和抗逆性調(diào)控。本文研究結(jié)果暗示，dwt番茄不僅具有明顯的矮化性狀，可能還具有一定的抗病和抗逆特性。因此，dwt番茄不僅可以作為矮化育種和理想株型的選育的良好材料，還可以作為高抗病和高抗逆品種選育的重要種質(zhì)資源。

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Transcriptome Analysis of Genes Associatedwith Dwarf Tomato Mutant dwt

Abstract：Taking Mrico Tom and dwt as materials in this study，15 genes associated with the regulation of plant height development are screened out by transcriptome sequencing and expression level analysis in order to explore the genes related to the regulation of plant height development of tomatoes （Solanum lycopersicum）.Among them，the abnormal expression of TCH4-like1，TCH4-like2，ABAR7，ABAR10，PP2C7，PP2C13，and PR1 could affect the BRs，ABA，and SA signaling pathway and inhibit the growth of tomatoes，leading to dwarfism in dwt.Meanwhile，ABAR7，ABAR10，PP2C7，PP2C13 and PR1，together with WRKY33 and MPK3，would affect the MAPK signaling pathway，regulating the formation of dwarfism mutant dwt.In addition，the expression level of peroxidase-like1，peroxidase-like2 and peroxidase-like3 is strongly inhibited，thus affecting lignin synthesis and promoting the dwarfism in dwt.These results will lay a good foundation for the identification of key regulatory genes in regulating the plant height development of tomatoes，and provide important clues for tomato dwarf breeding as well.

Keywords：tomatoes；dwarf；transcriptome sequencing；hormone