馬 先，于明玥，周博文，李澤峰，李傳慧，辛玲杰，賈新華

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心/山東省公共衛(wèi)生臨床中心中西醫(yī)結(jié)合科，山東 濟(jì)南 250013；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性進(jìn)行性間質(zhì)性肺疾病，病因不明，預(yù)后不良［1］。流行病學(xué)研究顯示［2］，IPF 在全球范圍內(nèi)的發(fā)生率和患病率介于每萬(wàn)人0.09～1.30 例，并且這一數(shù)字隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在治療IPF 患者時(shí)，尼達(dá)尼布和吡非尼酮這兩種藥物已經(jīng)獲得了批準(zhǔn)使用，它們具有減緩肺功能衰退和延緩病情惡化的效果，但同時(shí)也存在與副作用和耐藥性相關(guān)的問(wèn)題［3，4］。而中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，臨床治療特發(fā)性肺纖維化療效可觀，有待發(fā)掘［5-7］。

然中醫(yī)病名中未有IPF 的記載，大多數(shù)現(xiàn)代學(xué)者基于肺纖維化的臨床特征和病理進(jìn)程，將其歸類(lèi)為中醫(yī)學(xué)中的“肺痿”和“肺痹”范疇，病理特點(diǎn)包括“肺燥葉焦”“肺氣虧虛”“津枯液亡”“絡(luò)阻血瘀”［8］。在疾病的發(fā)展過(guò)程中，肺燥、氣虛和陰損相互作用，故中醫(yī)理論認(rèn)為本病治宜養(yǎng)陰益氣?！督饏T要略·肺痞肺癰咳嗽上氣病》篇中指出：“大 （火） 逆上氣，咽喉不利，止逆下氣者，麥門(mén)冬湯主之?！痹谂R床實(shí)踐中，使用麥門(mén)冬湯來(lái)治療 IPF 能有效地緩解患者的癥狀，并且效果較常規(guī)治療方法更佳［9］。但麥門(mén)冬湯的現(xiàn)代研究未集中在中藥復(fù)方上，藥物作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)疾病發(fā)病機(jī)制不明，且忽略了多信號(hào)通路的相互聯(lián)系和影響［10］。本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討麥門(mén)冬湯治療 IPF 的作用機(jī)制，以期為中醫(yī)中藥臨床治療肺纖維化提供新的治療靶點(diǎn)。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 麥門(mén)冬湯活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)［11］，設(shè)置口服生物利用度（OB）不小于30%和藥物相似性（DL）不小于0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)麥門(mén)冬湯中各個(gè)藥材進(jìn)行檢索，以識(shí)別出各藥物中的有效活性成分。對(duì)于在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中未能檢索到的藥物，可以借助ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）進(jìn)行查詢(xún)，并結(jié)合查閱已發(fā)表的文獻(xiàn)來(lái)收集藥物成分。接著，使用SwissADME 平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/）進(jìn)行成分的活性篩選，從而確定藥物的有效活性成分。隨后，通過(guò)SwissTargetPredict 網(wǎng)站（http：//www.swisstargetprediction.ch/）執(zhí)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工作。如果在SwissTargetPrediction 網(wǎng)站上無(wú)法確認(rèn)某個(gè)成分的靶點(diǎn)信息，可以采用TCMSP 網(wǎng)站提供的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。隨后，通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)［12］對(duì)這些靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以獲取規(guī)范化的成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2 IPF 相關(guān)靶點(diǎn)篩選

使用“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”作為關(guān)鍵字詞，在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)［13］和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)［14］中查詢(xún)，以獲得與 IPF 相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

1.3 麥門(mén)冬湯與特發(fā)性肺纖維化共同靶點(diǎn)Venn 圖構(gòu)建

利用Venn diagrams 的在線(xiàn)繪圖服務(wù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），對(duì)IPF 的相關(guān)靶點(diǎn)與麥門(mén)冬湯的靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析。通過(guò)繪制靶蛋白的Venn 圖，篩選出中藥與疾病共有的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)（PPI）相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

導(dǎo)入IPF 與麥門(mén)冬湯共同靶點(diǎn)至String 數(shù)據(jù)庫(kù)［15］以執(zhí)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析。隨后，將得到的PPI 結(jié)果輸入到Cytoscape 3.9.1 軟件中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，這包括計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度（Degree）、介度（Betweenness）以及緊密度（Closeness）。基于超過(guò)中位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選出核心靶點(diǎn)，如果核心靶點(diǎn)數(shù)量較多，將進(jìn)一步進(jìn)行篩選，從而構(gòu)建出核心靶點(diǎn)與成分之間的網(wǎng)絡(luò)圖，并識(shí)別出關(guān)鍵的活性成分。

1.5 共同靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)［16］中，以執(zhí)行GO 及KEGG 通路富集分析。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)別的健康雄性SD 大鼠，年齡為7周，體重在（180±20） g 范圍內(nèi)，購(gòu)于山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，室內(nèi)環(huán)境實(shí)行12 h 的光照周期和12 h 的黑暗周期進(jìn)行飼養(yǎng)，提供標(biāo)準(zhǔn)的食物和水源，同時(shí)保持室溫在大約（22±1）℃和大約40%的相對(duì)濕度。本研究通過(guò)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批件號(hào)：2020-45）。本研究所采用的所有實(shí)驗(yàn)方案均遵循中國(guó)倫理委員會(huì)制定的關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的指導(dǎo)準(zhǔn)則。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

麥門(mén)冬湯組成：麥冬，人參，半夏，大棗，甘草（比例7∶1.5∶1∶1∶1），購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，按照人與動(dòng)物體表面積折算公式［17］，大鼠（0.2 kg）等效劑量換算為人類(lèi)（70 kg）的6.3 倍，計(jì)算生藥給藥劑量為12.6 g 生藥/kg 體質(zhì)量，按照大鼠每100 g 體重給藥體積為1 mL，確定藥物濃度，將原藥材煎煮后濃縮為中藥液，按大鼠實(shí)際質(zhì)量灌胃。硫酸博來(lái)霉素購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BioTeK 儀器有限公司），熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-rad 科技公司）。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 動(dòng)物分組 在經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)之后，30 只大鼠被隨機(jī)分配到三個(gè)不同的組別：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和麥門(mén)冬湯治療組，每個(gè)組別包含10 只大鼠。

2.4.2 動(dòng)物造模 按照Szapiel 等的方法，通過(guò)硫酸博來(lái)霉素的氣管內(nèi)滴注來(lái)建立大鼠的肺纖維化模型。首先，大鼠通過(guò)腹腔注射1.5%的戊巴比妥鈉（劑量為30 mg/kg）進(jìn)行麻醉。麻醉后，大鼠被仰臥固定在傾斜35°的板上，使用75%的醫(yī)用酒精對(duì)頸部皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒。然后在頸部中線(xiàn)切開(kāi)2～3 cm 的皮膚，利用血管鉗進(jìn)行鈍性分離肌肉以露出氣管。接著，用4 號(hào)針頭穿過(guò)氣管軟骨環(huán)的間隙，向心臟方向刺入氣管，并通過(guò)空針筒注射約0.3 mL 含有硫酸博來(lái)霉素（劑量為7 mg/kg）的溶液。注射完畢后，迅速將鼠板垂直旋轉(zhuǎn)并豎直放置3 min，以便讓藥物在肺部均勻分布。之后縫合肌肉和皮膚，進(jìn)行再次消毒，并注射青霉素鈉以預(yù)防感染。對(duì)照組大鼠則只接受等量生理鹽水的氣管內(nèi)注射，其他操作與造模組相同。除空白對(duì)照組以外，其余各組均被制成肺纖維化模型。

2.4.3 動(dòng)物給藥 各組動(dòng)物分別于造模第2 天開(kāi)始灌胃，按照每10 mL/kg 給藥，同時(shí)抽取與之相等劑量的生理鹽水，給予模型對(duì)照組和空白對(duì)照組灌胃，每日一次，連續(xù)給藥28 d。

2.4.4 標(biāo)本采集 在給藥28 d 后，通過(guò)左心室取血的方法處死大鼠。無(wú)菌操作下打開(kāi)胸膛，取出肺組織，隨后將兩肺分離；將右肺置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，并進(jìn)行石蠟包埋以備后續(xù)的病理學(xué)切片分析；左肺則保存于-80℃的冷凍條件下，用于PCR 檢測(cè)。

2.4.5 肉眼標(biāo)本觀察 肉眼觀察各組大鼠雙肺外觀、肺葉輪廓、體積、顏色、彈性等。

2.4.6 肺組織形態(tài)觀察 取病理切片，行HE 染色，檢測(cè)肺組織病理變化。

2.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）分析 取大鼠肺組織，Trizol 法抽提總RNA，Nanodrop 和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度。將總RNA 溶液稀釋至 200 ng/μL，用MLV 反轉(zhuǎn)錄酶體系，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件： 95 ℃，10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。分別計(jì)算每個(gè)樣本內(nèi)參基因平均CT值，目的基因平均CT 值，根據(jù)公式“ΔCT=目的基因平均CT 值-內(nèi)參基因平均CT 值”計(jì)算各個(gè)樣本的ΔCT，進(jìn)而求出各組數(shù)據(jù)的平均ΔCT，根據(jù)公式“ΔΔCT=處理組ΔCT-空白組ΔCT”計(jì)算各組數(shù)據(jù)的ΔΔCT，比較2-ΔΔct的大小關(guān)系 計(jì)算各處理組相對(duì)的基因轉(zhuǎn)錄水平。包括TGF-β1、α-SMA、IL-4、IFN-γ、LC3-Ⅱ、beclin1的mRNA。 引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequences

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布并且方差齊的情況下，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；若不滿(mǎn)足方差齊，則應(yīng)用校正的t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 麥門(mén)冬湯有效活性成分篩選

麥門(mén)冬湯中5 味中藥的159 種活性成分，其中麥冬23 種，人參17 種，甘草88 種，半夏12 種，大棗19 種，有6 種成分為共有成分，見(jiàn)表2。

表2 麥門(mén)冬湯共同化合物成分信息Tab 2 Common compound composition of Maimendo decoction

3.2 中藥與疾病共同靶點(diǎn)Venn 圖的繪制

在進(jìn)行檢索和篩選后，共識(shí)別出4 190 個(gè)針對(duì)IPF 治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，識(shí)別出674 個(gè)與麥門(mén)冬湯相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)取交集，共確定了402 個(gè)在IPF 治療中與麥門(mén)冬湯相關(guān)的潛在靶蛋白。為了直觀展示這些靶蛋白之間的關(guān)系，使用了在線(xiàn)韋恩圖工具（Venndiagrams）來(lái)繪制了靶蛋白的韋恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 麥門(mén)冬湯治療特發(fā)性肺纖維化的交集靶點(diǎn)Venn 圖Fig 1 Venn plot of intersection targets of Maimendong decoction in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosi s

3.3 “中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過(guò)將麥門(mén)冬湯與IPF 的共有靶點(diǎn)信息輸入到Cytoscape 3.9.1 軟件中進(jìn)行圖形化展示。生成的網(wǎng)絡(luò)圖包含1 個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)、5 種中藥成分、以及159 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)?！爸兴?活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖2 中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredients-diseases-targets

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選

PPI 網(wǎng)絡(luò)基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，分析麥門(mén)冬湯和特發(fā)性肺纖維化的402 個(gè)共有靶點(diǎn)，設(shè)置默認(rèn)置信度并隱藏孤立靶點(diǎn)，所得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共含9 970 條連線(xiàn)。使用NetworkAnalyzer 篩選核心靶點(diǎn)，通過(guò)cytoscape3.9.1 插件設(shè)置連接度、介度和緊密度，所得麥門(mén)冬湯治療特發(fā)性肺纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)檗D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白蛋白（ALB）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體1（EGFR）、白細(xì)胞介素-1b（IL-1β）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、胱天蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK3）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）、白細(xì)胞介素-8（CXCL8）等50 個(gè)，見(jiàn)圖3。

圖3 麥門(mén)冬湯治療特發(fā)性肺纖維化的PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network and key target network diagram of Maimendong decoction in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis

3.5 麥門(mén)冬湯核心靶點(diǎn)GO 功能富集和KEGG 通路富集

GO 分析包括生物途徑（BiologicalProcess，BP）、細(xì)胞組分（CellularComponent，CC）、分子功能（MolecularFunction，MF）。PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)的GO、KEGG 富集結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)的BP 與細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)；CC 與膜筏、受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等相關(guān)；MF 與蛋白激酶活性、激酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等相關(guān)，見(jiàn)圖4。KEGG 除了癌癥、病毒相關(guān)通路外，與PI3K-Akt 信號(hào)通路、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路密切相關(guān)，見(jiàn)圖5。

圖4 麥門(mén)冬湯核心靶點(diǎn)GO 富集分析柱狀圖Fig 4 Bar chart of GO enrichment analysis for the core target of Maimendong decoction

圖5 麥門(mén)冬湯核心靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis for the core target of Maimendong decoction

3.6 肉眼標(biāo)本觀察

空白對(duì)照組大鼠肺外觀光滑潤(rùn)澤，呈淡紅色，肺葉輪廓清晰，體積大小適中，組織柔軟，富有彈性。模型對(duì)照組大鼠肺外觀見(jiàn)大量瘢痕，組織結(jié)構(gòu)破壞，呈蒼白色或紅黑色，肺葉輪廓不清晰，體積縮小，彈性變差，質(zhì)地較硬。麥門(mén)冬湯治療組大鼠肺外觀少量瘢痕組織，呈暗紅色，肺葉輪廓較清晰，體積大小適中，彈性一般。與模型對(duì)照組比較，麥門(mén)冬湯治療組大鼠雙肺外觀、顏色、肺葉輪廓、體積彈性有所改善。見(jiàn)圖6。

圖6 麥門(mén)冬湯對(duì)博來(lái)霉素肺纖維化大鼠肺纖維化程度的影響Fig 6 Effect of Maimendong decoction on the degree of pulmonary fibrosis in rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis

3.7 肺組織形態(tài)的觀察

在空白對(duì)照組的大鼠中，肺組織的結(jié)構(gòu)保持完好，未觀察到顯著的形態(tài)學(xué)改變。而在模型對(duì)照組的大鼠中，肺泡的結(jié)構(gòu)受損，表現(xiàn)為肺泡間隔增寬、肺泡結(jié)構(gòu)破損不完整，并伴隨著炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及纖維細(xì)胞和纖維組織的過(guò)度增生。在麥門(mén)冬湯治療組的大鼠中，肺泡結(jié)構(gòu)有輕微的紊亂，仍可見(jiàn)到一定程度的炎癥細(xì)胞滲透和纖維細(xì)胞及組織的增生，但這些病理變化相較于模型對(duì)照組有了明顯減輕，詳見(jiàn)圖7。

圖7 各組大鼠肺組織H＆E 染色結(jié)果（×100）Fig 7 H＆E staining results of lung tissue in each group of rats（×100）

3.8 麥門(mén)冬湯對(duì)大鼠TGF-β1、α-SMA、IL-4、IFN-γ、LC3-Ⅱ、beclin1 mRNA 的影響

定量PCR 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的TGF-β1、α-SMA、IL-4mRNA 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），LC3-Ⅱ、beclin1、IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，麥門(mén)冬湯治療組可顯著下調(diào)TGF-β1、α-SMA、IL-4的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05），顯著上調(diào)LC3-Ⅱ、beclin1、IFN-γmRNA 的相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖8、表3。

圖8 麥門(mén)冬湯對(duì)大鼠TGF-β1、α-SMA、IL-4、IFN-γ、LC3-Ⅱ、beclin1 mRNA 的影響Fig 8 Maimendong decoction on TGF-β1，α- SMA， IL-4， IFN- γ， LC3-Ⅱ and beclin1 mRNA in rats

表3 麥門(mén)冬湯對(duì)大鼠TGF-β1、α-SMA、IL-4、IFN-γ、LC3-Ⅱ、beclin1 mRNA 的影響（n＝3，±s）Tab 3 Maimendong decoction on TGF-β1，α- SMA， IL-4， IFN- γ，LC3-Ⅱ and beclin1 mRNA in rats（n＝3，±s）

表3 麥門(mén)冬湯對(duì)大鼠TGF-β1、α-SMA、IL-4、IFN-γ、LC3-Ⅱ、beclin1 mRNA 的影響（n＝3，±s）Tab 3 Maimendong decoction on TGF-β1，α- SMA， IL-4， IFN- γ，LC3-Ⅱ and beclin1 mRNA in rats（n＝3，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別TGF-β1α-SMA LC3-ⅡIFN-γIL-4beclin1空白組模型組麥門(mén)冬湯組1.000±0.095 2.300±0.325*1.360±0.440#1.040±0.275 2.900±1.055*0.570±0.345#1.000±0.010 0.830±0.375*2.860±0.705#1.000±0.085 1.190±0.365*3.730±1.630#1.050±0.330 6.650±0.200*1.470±0.060#1.000±0.030 3.720±0.985*0.920±0.430#30.84＜ 0.000 1 FP 21.09＜ 0.000 1 18.15＜ 0.000 1 29.44＜ 0.000 1 11.35 0.001 2 826.80＜ 0.000 1

4 討論

4.1 麥門(mén)冬湯成分分析

通過(guò)藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共篩選得到槲皮素、山奈酚、人參皂苷等159 種治療IPF 的潛在活性成分。槲皮素能夠通過(guò)抑制 TGF-β1 信號(hào)傳導(dǎo)緩解肺纖維化［18］，并與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路、SphK1/S1P 信號(hào)通路等有關(guān)［19］。山奈酚通過(guò)靶向TGF-β 下調(diào)Smad2 和Smad3 磷酸化，抑制成纖維細(xì)胞膠原合成、增殖和活化治療纖維增生性疾?。?0］。人參皂苷在降低膠原產(chǎn)生和增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化損傷的防御能力方面表現(xiàn)出顯著效果，具有抗肺纖維化的潛在能力，這種效果與TGF-β 的抑制作用有關(guān)［21，22］。以上研究提示：槲皮素、山奈酚、人參皂苷通過(guò)多通路作用于TGF-β 等靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮抗纖維化作用。

4.2 麥門(mén)冬湯主要靶點(diǎn)分析

GO 富集分析表明，麥門(mén)冬湯治療IPF 可能涉及對(duì)氮化合物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)途徑。通過(guò)對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，預(yù)測(cè)出TGF-β1、IL-4、AKT1、TNF、ALB、IL-6、VEGFA、EGFR、IL1-β、SRC、CASP3、MAPK3、EGF、MMP9、CXCL8 等50 個(gè)核心靶點(diǎn)。前人已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證麥門(mén)冬湯調(diào)節(jié)p-AKT、AKT及VEGF 表達(dá)［23］。其中，TGF-β1 具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活與增殖的作用，這會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)的堆積。TGF-β1 的表達(dá)水平上升與多種纖維化疾病的發(fā)生有關(guān)，并且其表達(dá)的多寡往往與疾病的嚴(yán)重性成正比。因此，針對(duì)TGF-β1 及其信號(hào)通路的抑制策略在治療肺纖維化以及其他纖維化疾病方面顯示出了巨大的療效潛力［24，25］。2 型免疫促進(jìn)損傷后組織再生和纖維化，其特征是產(chǎn)生IL-4，IL-5，IL-9和IL-13，表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多不同器官系統(tǒng)中病理性纖維化的發(fā)展［26］?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，可以推測(cè)TGF-β1 和IL-4 可能是治療IPF 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，它們有望成為針對(duì)IPF 防治的分子機(jī)制研究的重點(diǎn)。

4.3 麥門(mén)冬湯主要通路分析

KEGG 富集分析表示，PPI 的核心靶點(diǎn)主要通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等信號(hào)通路發(fā)揮作用。PI3K-AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)自噬影響多種疾病，多個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路能夠抑制支氣管上皮細(xì)胞自噬，促進(jìn)肺部炎癥和纖維化［27-29］，并與TGF-β1-PI3K-Akt 信號(hào)通路相關(guān)［30］。MAPK 家族，包含c-Jun N 末端激酶、p38 MAPK 以及細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶，這些激酶參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，并在平衡調(diào)節(jié)自噬與細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色［31］，并受TGF-β1 調(diào)節(jié)促進(jìn)IPF 的纖維化過(guò)程［32］。由以上研究可知，麥門(mén)冬湯可能通過(guò)抑制PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬，延緩肺纖維化進(jìn)程。

4.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析

自噬，是一種基本的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過(guò)程，可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外因素誘導(dǎo)，降解和回收細(xì)胞蛋白并去除受損的細(xì)胞器。LC3 蛋白質(zhì)家族作為自噬體形成的結(jié)構(gòu)成分起作用，是最好的表征形式，也是最廣泛的自噬標(biāo)志物。LC3 的胞質(zhì)形式（LC3-Ⅰ）轉(zhuǎn)化為脂化形式（LC3-Ⅱ）表明自噬體形成［33］。自噬體形成前，beclin 1 需與自噬前體結(jié)合參與啟動(dòng)自噬過(guò)程［34］。在IPF 中，自噬是一種通過(guò)調(diào)節(jié)膠原蛋白降解和自噬相關(guān)細(xì)胞死亡來(lái)控制肺部纖維化發(fā)展的保護(hù)機(jī)制［35］。IPF 患者的肺上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞，與用TGF-β1 激活的成纖維細(xì)胞，及博來(lái)霉素誘導(dǎo)的IPF 小鼠中自噬途徑均有所減少［36］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與空白組相比，模型組與麥門(mén)冬湯組LC3-Ⅱ mRNA 和beclin1mRNA 水平降低；與模型組相比，麥門(mén)冬湯組LC3-ⅡmRNA 和beclin1mRNA 水平增加，表明自噬能夠改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，麥門(mén)冬湯可通過(guò)增強(qiáng)自噬，抑制肺纖維化的發(fā)展。

此外，自噬還參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)［37］。巨噬細(xì)胞可分為M1 表型和M2 表型，M1 和M2 巨噬細(xì)胞表型分別與促炎和促纖維化特征相對(duì)應(yīng)。M1巨噬細(xì)胞活化通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)基質(zhì)降解金屬蛋白酶和促炎細(xì)胞因子清除病原微生物并促進(jìn)炎癥，M2巨噬細(xì)胞活化通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和/或直接調(diào)節(jié)肺纖維化疾病的發(fā)展和進(jìn)展，以及分化為表達(dá)膠原蛋白的纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的能力［38］。自噬抑制巨噬細(xì)胞M2 表型極化，M2 表達(dá)的標(biāo)志物包括IL-4、TGF-β1，增加了M1 表達(dá)的標(biāo)志物如IFN-γ。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與空白組相比，模型組與麥門(mén)冬湯組IL-4mRNA、TGF-β1mRNA、IFN-γmRNA 水平升高；與模型組相比，麥門(mén)冬湯組IL-4mRNA、TGF-β1mRNA 水平降低，IFN-γ mRNA 水平升高，表明巨噬細(xì)胞參與肺損傷和修復(fù)具有促進(jìn)和抑制纖維化的雙重作用，麥門(mén)冬湯可以通過(guò)增強(qiáng)自噬調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠的肺纖維化。IFN-γ/IL-4 比例失調(diào)也提示其可能與Th1/Th2 細(xì)胞失衡有關(guān)［39］，表明麥門(mén)冬湯糾正Th1/Th2 失衡來(lái)調(diào)控肺泡炎癥及肺纖維化發(fā)展進(jìn)程。

TGF-β1 長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是涉及多個(gè)器官（包括皮膚，肝臟，腎臟和肺）的組織纖維化的中樞介質(zhì)［40］。在IPF 的發(fā)展中，TGF-β1 同樣起著核心作用。TGF-β1 通過(guò)MAPK 和ERK 信號(hào)通路等信號(hào)通路促進(jìn)IPF 的纖維化過(guò)程［32］。因此，TGF-β1及其信號(hào)通路一直是開(kāi)發(fā)抗纖維化藥物的有吸引力的治療靶點(diǎn)［41］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與空白組相比，模型組與麥門(mén)冬湯組TGF-β1mRNA、α-SMAmRNA 水平升高；與模型組相比，麥門(mén)冬湯組TGF-β1mRNA、α-SMAmRNA 水平降低，表明TGF-β1能夠促進(jìn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，麥門(mén)冬湯可通過(guò)抑制TGF-β1 表達(dá)，抑制肺纖維化的發(fā)展。

并且，TGF-β1 介導(dǎo)自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)［42］。成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞分化（FMD）是肺纖維化的重要特征，其中促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1 起關(guān)鍵作用，而自噬作用在于維持正常的肺成纖維細(xì)胞的命運(yùn)。TGF-β1 通過(guò)減少自噬通量介導(dǎo)FMD，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程，增強(qiáng)自噬可改善TGF-β1 介導(dǎo)的肺纖維化［43］。數(shù)據(jù)表明，與空白組相比，模型組和麥門(mén)冬湯組LC3-ⅡmRNA 和beclin1mRNA 水平降低，TGF-β1mRNA 水平升高；與模型組相比，麥門(mén)冬湯組LC3-ⅡmRNA 和beclin1mRNA 水平升高，TGF-β1mRNA 水平降低，表明麥門(mén)冬湯可通過(guò)增強(qiáng)自噬減弱TGF-β1 驅(qū)動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的治療效果。

總結(jié)來(lái)看，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析表明，麥門(mén)冬湯治療IPF 的機(jī)制涉及其多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的特性，尤其在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞極化等生物學(xué)過(guò)程上發(fā)揮關(guān)鍵作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)麥門(mén)冬湯能夠降低IPF 模型大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、IL-4mRNA 水平，增加LC3-Ⅱ、beclin1、IFN-γ mRNA水平，緩解肺纖維化。然而，由于IPF 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，加之本實(shí)驗(yàn)的樣本量有限，并未對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行全面的驗(yàn)證，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果仍可以為未來(lái)深入的機(jī)制性研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

馬先、于明玥、周博文、李澤峰：執(zhí)筆撰寫(xiě)，李傳慧、辛玲杰、賈新華：審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。