張立榮，江 滟

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院微免教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省黔東南州從江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 從江 557400；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心微免科，貴州 貴陽 550004）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， SA）所致的下呼吸道感染、化膿性感染在革蘭陽性球菌感染病原菌中占比非常高，近幾年由它引起的感染死亡率逐年增高［1］，在青霉素尚未研究發(fā)現(xiàn)之前，由金黃色葡萄球菌感染造成的死亡率達(dá)80%以上，然而在青霉素引入治療未達(dá)兩年，耐藥菌株陸續(xù)在各個國家及地區(qū)發(fā)現(xiàn)，且數(shù)量急劇增加，現(xiàn)如今大部分醫(yī)院調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)已對青霉素耐藥率達(dá)90%以上［2］。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus， MRSA）的高耐藥率更是給臨床帶來了極大的治療困難，研究顯示mecA耐藥基因產(chǎn)生后而賦予菌體耐藥性，致使大部分β-內(nèi)酰胺類藥物對其治療無效［3］。同時MRSA菌株之間還存在著耐藥基因與毒力基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或綴合，導(dǎo)致菌株對多種類抗菌藥物產(chǎn)生極高的耐藥性，從而形成強(qiáng)大侵襲致病力［4］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在美國由革蘭陽性球菌造成的多耐藥菌致死率最高的菌仍是MRSA［5，6］?？咕幬锎罅渴褂门c細(xì)菌耐藥性存在必然的聯(lián)系，探討二者的相關(guān)關(guān)系旨在對臨床指導(dǎo)使用抗菌藥物有一定作用。多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing， MLST）是是一種重要的分子生物學(xué)分析方法，對新出現(xiàn)的不同抗生素耐藥菌株，及毒力、與抗原相關(guān)的特殊基因型，起重要研究作用［7］。

本研究擬對貴州省從江縣人民醫(yī)院（以下簡稱該院）重癥醫(yī)學(xué)科下呼吸道分離的SA 的耐藥變遷情況進(jìn)行回顧性分析，并對其中40 株MRSA 的耐藥基因進(jìn)行檢測及同源性分析以期為臨床用藥和醫(yī)院感染控制提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者一般資料

共收集到2018～2021 年重癥監(jiān)護(hù)室下呼吸道感染SA 患者病例共計(jì)457 例，其中以男性患者為主，共計(jì)293 例，女性患者164 例。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)病患年齡從14～94 歲不等，其中主要以45～84 歲年齡段感染病例人數(shù)最多，為感染高發(fā)年齡段人群，且均顯示為男性病患數(shù)量顯著多于女性患者，14～44 歲年齡段男性與女性病患率無顯著差異，見表1。

表1 年齡、性別與感染人數(shù)的關(guān)系Tab 1 The relationship between age， gender， and number of infected individuals

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

收集該院重癥醫(yī)學(xué)科2018 年1 月～2021 年12月下呼吸道感染患者痰液、血液標(biāo)本分離出的40 株MRSA。本研究經(jīng)貴州省從江縣人民醫(yī)院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) VITEK2-compact 微生物分析儀對菌株進(jìn)行鑒定及藥敏，儀器法得到的藥敏試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合手工藥敏法分析所有藥敏結(jié)果，得到的藥敏結(jié)果以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會最新標(biāo)準(zhǔn)作結(jié)果判斷［9］。

1.3.2 MRSA 的判定 將30 μg 頭孢西丁藥敏紙片貼于已接種好SA 的MH 平板上，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)16～18 h 后觀察，抑菌圈直徑≤21 mm 即可判定為MRSA。

1.3.3 耐藥基因檢測 按天根生化試劑公司提供的細(xì)菌DNA 試劑盒操作方法而提取到SA 的DNA，引物的設(shè)計(jì)借鑒文獻(xiàn)［10］，從而合成SA 的3 種耐藥基因（mecA、SCCmec、femB） 及耐消毒劑基因（qacA/B），引物信息見表2。

表2 基因引物擴(kuò)增序列Tab 2 Primer sequences

1.3.4 同源性分析 從pubMLST 網(wǎng)站上（https：//pubmlst.org/bigsdb？ db=pubmlst-abaumannii_seqdef）查詢并獲得SA 的管家基因，PCR 法擴(kuò)增上述管家基因部分基因片段，得到的PCR 產(chǎn)物送至第三方測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果按順序依次輸入MLST 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中。從而得到每株菌相對應(yīng)的序列型。

管家基因引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［11］，引物信息分別見于見表3。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火 1.5 min，共進(jìn)行30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸1.5 min。

表3 金黃色葡萄球菌管家基因引物擴(kuò)增序序列Tab 3 Primer amplified sequence of housekeeper gene of Staphylococcus aureus

1.4 同一克隆菌株判定標(biāo)準(zhǔn)

運(yùn)用凝膠圖像分析系統(tǒng)，作電泳條帶識別分析，將數(shù)據(jù)整理后，運(yùn)用eBURST 軟件、MEGA7.0軟件進(jìn)行遺傳相關(guān)信息分析，判斷7 個管家基因型中的6 個基因型相同即為同一流行克隆群，包含3個及以上ST 型的克隆群為1 個克隆復(fù)合體（Clonal complex， CC）［12］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS29.0 軟件中的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法皮爾遜相關(guān)性分析（Peason Correlation）分析細(xì)菌耐藥率與各類抗菌藥物用藥頻率的關(guān)系，P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，存在相關(guān)關(guān)系，＞0 表示為正相關(guān)，負(fù)數(shù)表示為負(fù)相關(guān)。r＞0.8 表示耐藥率與DDDs 明顯相關(guān)，0.4～0.6 為中等程度相關(guān)關(guān)系，r＜0.4 為不存在相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本分布情況

2018～2021 年ICU 下呼吸道感染共分離出637株SA，其中以痰液標(biāo)本占比最高，共分離出226 株（35.48%），全血112 株（17.58%），胸水中共分離出107 株（16.8%），肺泡灌洗液共分離出86 株（13.5%），肺膿腫穿刺液共分離出59 株（9.26%），其他標(biāo)本共分離出47 株（7.38%），見表4。

表4 2018 年-2021 年金黃色葡萄球菌標(biāo)本分布情況Tab 4 Distribution of Staphylococcus aureus specimens from 2018 to 2021

2.2 耐藥變遷情況

SA 耐藥變化情況顯示連續(xù)4 年青霉素耐藥率均高于92%以上，居高不下。四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明4 年平均耐藥率分別為40.19%、34.22%、33.90%。苯唑西林平均耐藥率為20.04%，奎奴普丁/達(dá)福普丁平均耐藥率僅有3.61%。耐藥趨勢顯示四環(huán)素、克林霉素、復(fù)方新諾明耐藥率在2019 年有所下降后卻又再次持續(xù)升高。紅霉素、苯唑西林、左氧氟沙星、奎奴普丁/達(dá)福普丁的耐藥率呈現(xiàn)逐年增長趨勢。耐藥情況見表5。

表5 2018-2021 年金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥情況［n（%）］Tab 5 Resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics in 2018～2021［n（%）］

2.3 各抗菌藥物的DDDs

2018～2021 年左氧氟沙星的DDDs 位于榜首，其次為頭孢類抗菌藥物（頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林），青霉素、慶大霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、苯唑西林呈下降趨勢，萬古霉素、替加環(huán)素、頭孢曲松呈上升趨勢。見表6。

表6 2018-2021 年常用抗菌藥物的DDDsTab 6 DDDs of common antibacterial drugs in 2018-2021

2.4 耐藥率與各抗菌藥物的DDDs 的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，SA 對苯唑西林耐藥率與苯唑西林DDDs 存在明顯正相關(guān)，SA 對左氧氟沙星耐藥率與左氧氟沙星DDDs 存在明顯正相關(guān)，SA 對克林霉素耐藥率與復(fù)方新諾明DDDs 存在明顯負(fù)相關(guān)，其他抗菌藥物耐藥率與各藥物DDDs 相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表7。

表7 金黃色葡萄球菌耐藥率與常用抗菌藥物DDDs 的相關(guān)性Tab 7 Correlation between drug resistance rate of Staphylococcus aureus and DDDs

2.5 耐藥基因檢測結(jié)果

40 株MRSA 的mecA基因檢出39 株占比97.5%（39/40），SCCmec基因、femB基因檢測結(jié)果為陰性。6 株菌檢出耐消毒劑qacA/B基因，占比15%（6/40），mecA、qacA/B基因共同檢出5 株，占比12.5%（5/40）具體情況見表8，部分電泳結(jié)果見圖1、2。

圖1 mecA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Electrophoresis of mecA gene amplification products

圖2 qacA/B 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Electrophoresis of qacA/B gene amplification products

表8 40 株MRSA 耐藥基因檢測結(jié)果Tab 8 Detection results of drug resistance genes of 40 MRSA strains

2.6 MLST 分型結(jié)果

40 株MRSA 各管家基因測序結(jié)果經(jīng)與Pubmlist 數(shù)據(jù)庫比對，得到的數(shù)據(jù)顯示共得到7 個序列型，占比最高的型別為ST59 型，其后占比從高到低依次為ST45 型，ST239 型、ST28 型、ST188 型、ST1型和ST630 型。8 株ST59 型菌株來源于不同時間不同病人，5 株源于同一時間不同病人同屬ST59型。4 株ST59、5 株ST45 型源于不同時間段的不同病人，表明該院存在科內(nèi)克隆菌株，在不同病人間的傳播和流行。分型結(jié)果見表9。

表9 MRSA 多位點(diǎn)序列分型結(jié)果Tab 9 Results of MRSA multiple-point sequence typing

2.7 基于eBURST 算法的進(jìn)化分析

遺傳學(xué)上將序列有所差異但存在相關(guān)性的集合稱之為克隆復(fù)合體，其中CC 中的核心ST 型是相對流行的型別，可由其衍生出許多與它相關(guān)的親緣性型別，eBURST 軟件將3 個及3 個以上ST 分型推算為一個CC，其中包含一個最原始的ST 型，其余2個或以上ST 型為其親緣型別。運(yùn)用e BURST 軟件對40 株MRSA 實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示7 個ST 型共形成一個克隆型，即（ST239-ST630），及5 個獨(dú)特型（ST1、ST28、ST45、ST188、ST59）。所有試驗(yàn)菌株未能形成1 個CC，僅有ST239 和ST630 存在一個點(diǎn)位變異，未發(fā)現(xiàn)第三個存在兩點(diǎn)變異的ST 型，所以未能形成一個CC。將40 株MRSA 實(shí)驗(yàn)菌株與國際MRSA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，ST1、ST239、ST188、ST630 同屬與CC5家族，ST45 歸屬于CC45 家族，本研究中的40 株MRSA 中的ST45 為該家族的祖先，ST59 歸屬于CC59 家族，本研究中的40 株MRSA 中的ST45 為該家族的祖先。

2.8 分離株遺傳進(jìn)化分析

遺傳學(xué)上常將遺傳的多樣性通過遺傳距離來作為基準(zhǔn)，從而表達(dá)群體演化過程及群體遺傳的差異性，如遺傳距離較小，種群的分化時間則較短，遺傳距離越遠(yuǎn)，則分化時間更長。運(yùn)用MEGA7.0 軟件對菌株的等位基因譜作進(jìn)化分析，據(jù)核酸序列上的STs 的進(jìn)化距離從而繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹圖（如圖3 所示），從進(jìn)化樹圖中可以看出，對于有互相有單位點(diǎn)變異的ST239 與ST630、ST1 與ST188，其親緣關(guān)系相近。表明菌株在進(jìn)化時，大多數(shù)時候保持遺傳的相對穩(wěn)定性（即進(jìn)化得出的ST 型一致），但也可能出現(xiàn)多位點(diǎn)的變異，致使細(xì)菌基因呈現(xiàn)多態(tài)性。

圖3 MEGA 分析構(gòu)建40 株MRSA 的進(jìn)化樹Fig 3 Evolution tree of 40 MRSA strains analyzed and constructed by MEGA

3 討論

SA 是呼吸道和皮膚的定植菌，是引起化膿性感染的主要病原菌，可導(dǎo)致局部感染如癤或癰甚至全身性感染［13］。MRSA 為世界衛(wèi)生組織重點(diǎn)關(guān)注的多重耐藥菌株對象之一，因其高耐藥性及高傳播能力，易集中爆發(fā)于重癥監(jiān)護(hù)室下呼吸道感染患者，臨床抗感染治療困難，患者病死率高［14］。

本研究中SA 對呋喃妥因耐藥率僅為0.9%（6/637），對利奈唑胺、替加環(huán)素、萬古霉素完全敏感。這一點(diǎn)和省內(nèi)某醫(yī)院、南方福建，北方遼寧某醫(yī)院一致，均未發(fā)現(xiàn)三者的耐藥菌株，本研究出現(xiàn)23 株奎奴普丁耐藥株，耐藥率為3.61%［15-18］，同比成都地區(qū)4 年內(nèi)耐藥率有所不同，該地區(qū)奎奴普丁耐藥率為0［19］。利福平、利奈唑胺敏感性較好。呋喃妥因常應(yīng)用于尿路感染，不建議治療下呼吸道感染［20］，因此替加環(huán)素、萬古霉素以及利奈唑胺推薦使用。MRSA 所致的感染性疾病以四環(huán)素類、糖肽類/脂肽類抗生素、喹努普汀/達(dá)福普、復(fù)方新諾明推薦使用，呋喃妥因不推薦。本研究結(jié)果提示除傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)藥物外，其對利福平以及慶大霉素敏感性亦較高。

該院主要以頭孢類抗生素及青霉素類使用率最高，其中頭孢類抗生素以頭孢曲松作為代表作抗生素，其使用率最高，兩類抗生素用藥頻率呈現(xiàn)逐年增長趨勢，臨床對這兩類抗生素的偏向性選擇明顯，可能主要原因是青霉素類抗生素屬廣譜抗生素且為初級抗生素，是臨床中抗感染的首選藥物，頭孢類抗生素因其抗菌活性較青霉素類更強(qiáng)，且過敏反應(yīng)少等原因，逐漸成為青霉素抗感染失敗后的首選藥物，因此二者使用率一直居高不下，提示現(xiàn)階段臨床抗感染藥物選擇主要為青霉素類及頭孢類。

細(xì)菌耐藥變遷可能有多方面原因，SA 耐藥率與各抗菌藥物用藥頻率的相關(guān)性分析顯示，大部分藥物耐藥率與自身藥物DDDs 無相關(guān)性，部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯正相關(guān)，部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯負(fù)相關(guān)，這與有關(guān)報道是一致的［21］。SA 對苯唑西林的產(chǎn)生抗藥的機(jī)理是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶及產(chǎn)生了除PBP2a的另外一種低親和力PBPs 導(dǎo)致耐藥，左氧氟沙星抗菌作用主要是以抑制細(xì)菌DNA 活性，從而致使細(xì)菌DNA 無法復(fù)制及合成而死亡，SA 對苯唑西林、左氧氟沙星耐藥率與各自用藥頻率存在明顯正相關(guān)，藥物使用頻率越高，越容易導(dǎo)致SA 對這兩種藥物產(chǎn)生耐藥性。克林霉素的耐藥率與復(fù)方新諾明用藥頻率存在明顯負(fù)相關(guān)，復(fù)方新諾明用藥頻率高可能會使克林霉素的耐藥率低，表明藥物的應(yīng)用與細(xì)菌耐藥性關(guān)系比較復(fù)雜，存在相互交叉作用。本研究中有部分藥物使用頻率DDDs 與SA 耐藥性無相關(guān)關(guān)系，可能與本研究未涉及到的一些耐藥變遷因素有關(guān)，有待更進(jìn)一步研究。

據(jù)報道青霉素結(jié)合蛋白PBP2a 對β-酰胺酶類抗生素的親和力極低，是導(dǎo)致MRSA 多耐藥的主要原因，而mecA是編碼PBP2a 蛋白最重要的基因結(jié)構(gòu)，因此mecA基因的攜帶率導(dǎo)致了MRSA 多耐性的產(chǎn)生［22］。多數(shù)研究提示mecA基因檢測法測定MRSA的準(zhǔn)確為96.83%，這種基因檢測方法比起傳統(tǒng)的苯唑西林紙片法更簡單、更快速、更準(zhǔn)確。因此，此檢測方法在我院更值得提倡及推廣，使MRSA 檢測更快速高效，更好的為臨床提供藥敏指導(dǎo)［23］。研究所收集的40 株MRSA 中mecA基因占比97.5%，和多數(shù)文獻(xiàn)報道一致［24，25］。MRSA 中若檢出mecA基因則提示均對青霉素、頭孢菌素以及單環(huán)酰胺類高度耐藥，本研究與上述學(xué)者研究結(jié)果基本吻合。40 株MRSA 中未發(fā)現(xiàn)攜帶SCCmec、fem耐藥基因菌株，這可能與本次收集的數(shù)量不足有關(guān)。

國外學(xué)者指出［26］SA 攜帶耐消毒劑基因后即對普通消毒劑產(chǎn)生耐性，而致使其無法被殺滅，其中耐消毒劑基因qacA/B對季胺類、胍類及腙類消毒劑抗性表現(xiàn)最為明顯，是導(dǎo)致近幾年來MRSA 對這幾類消毒劑抗性增加的主要原因［27］。東北地區(qū)燒傷患者的qacA/B基因的攜帶率為86.32%［28］，高于馬來西亞某醫(yī)院對報道的qacA/B攜帶率為53.13%，丁新玲等［29］報道的MRSA 菌株qacA/B基因攜帶率為56%，而MSSA 的qacA/B基因攜帶率稍低，攜帶率為41%，伊朗某省對MRSA 及MSSA菌株qacA/B基因攜帶率亦是不同，分別為68%、58.2%［30］，表明多地區(qū)關(guān)于qacA/B基因存在顯著性地區(qū)差異，及標(biāo)本類型之間的差異，MRSA 攜帶率高于MSSA。40 株MRSA 中發(fā)現(xiàn)6 株攜帶有qacA/B基因，攜帶率為15%，攜帶率雖低于部分地區(qū)報道，標(biāo)本主要收集于ICU 下呼吸道感染標(biāo)本，可能與收集標(biāo)本類型不夠全面有關(guān)，但依然存在對抗性增加的風(fēng)險。ICU 內(nèi)的消毒劑使用高于普通科室，尤其多使用氯類、季胺類和醛類消毒劑，而qacA/B基因主要使細(xì)菌增加上述消毒劑的抗性。普通常規(guī)方法無法檢測出菌株是否攜帶qacA/B基因，需采用PCR 法才能檢測出菌株是否攜帶耐消毒劑基因qacA/B基因，因此定期收集耐藥或敏感菌掌握qacA/B基因攜帶情況。有利于了解本地區(qū)攜帶耐消毒劑MRSA 菌株的分子流行病學(xué)情況，從而合理規(guī)范消毒劑的使用。

本研究仍存在一些不足之處，如數(shù)據(jù)資料收集到得標(biāo)本數(shù)偏小，可能研究結(jié)果會造成偏倚，還需要加大菌株數(shù)量的收集及增加更長年限來更好的驗(yàn)證本結(jié)論；此外，研究僅對耐消毒劑qcaA/B 基因進(jìn)行了檢測，尚不能表明MRSA 未攜帶有耐消毒劑的其它基因。

MRSA 菌株的克隆群存在地區(qū)性差異，美國常見型別主要是ST1 和ST8，歐洲多以ST80 為常見型別，而亞洲國家則多以ST30、ST59 型為主［31］。本次研究的40 株MRSA 經(jīng)MLST 分型結(jié)果顯示，ST59 型菌株是我院重癥醫(yī)學(xué)科主要的流行菌株，占比為42.5%（17/40），與亞洲部分報道一致。2000年以前我國的主要流行型別為ST239-t030-SCCmecIII，2000 以后主要以ST239-t037-SCCmecIII 為主，目前國內(nèi)主要流行的型別主要以ST239 和ST59 為主［32］，本實(shí)驗(yàn)研究與其基本一致。本研究中檢出的ST188、ST45 這一型別在韓國及國內(nèi)的廣州相關(guān)研究中也有發(fā)現(xiàn)，其他型別檢出量較少［33，34］。表明ST59、ST45 兩種型別可能同為重癥監(jiān)護(hù)室克隆株的總趨勢，并且會造成科內(nèi)傳播的風(fēng)險。臨床醫(yī)師及醫(yī)院感控部門應(yīng)引起高度重視，及時隔離MRSA 感染病人，采取相應(yīng)措施減少科內(nèi)流行克隆株的傳播。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張立榮：查詢并整理相關(guān)課題文獻(xiàn)，建立課題研究方案，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，撰寫論文；江滟：研究選題推薦，為試驗(yàn)提供技術(shù)或材料支持，全篇論文的指導(dǎo)性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。