張嬌 張婉君 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué),南京,210037)

松材線(xiàn)蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)是常見(jiàn)的松樹(shù)寄生性線(xiàn)蟲(chóng),能引發(fā)松材線(xiàn)蟲(chóng)病。松材線(xiàn)蟲(chóng)病是松樹(shù)的一種破壞性流行病害,自1982年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),迅速蔓延,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在過(guò)去幾十年中,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究開(kāi)發(fā)了多種防治措施阻遏松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生擴(kuò)散,例如,通過(guò)移除受感染的樹(shù)木來(lái)物理根除,空中施用殺蟲(chóng)劑以殺死線(xiàn)蟲(chóng)的媒介(墨天牛屬),使用防治松材線(xiàn)蟲(chóng)樹(shù)干注射劑以控制線(xiàn)蟲(chóng)本身[2],但很多方法成本較高、防治效果差,大面積推廣應(yīng)用存在較大的難度。

近年來(lái),打孔注藥技術(shù)防治松材線(xiàn)蟲(chóng)病取得了不錯(cuò)的防控進(jìn)展,由于樹(shù)干注藥能夠?qū)?shù)體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)有著直接毒殺作用,而且對(duì)環(huán)境友好,因此這種措施在我國(guó)被廣泛采用[3]。目前,市面上應(yīng)用最廣泛的注干劑是甲維鹽,因其防治效果好,施用效率高,得到了一致的認(rèn)可[4-5]。除此以外,阿維菌素使用的頻率也很高,林茂松等[6]引入了日本的一種阿維菌素注干劑,在國(guó)內(nèi)松林中進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,該藥劑注干后,2～3個(gè)月對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防效達(dá)到100%,防治效果取得了良好的成績(jī)。但是,長(zhǎng)期重復(fù)、單一的使用這兩種藥劑,容易使松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性。不同藥劑的合理復(fù)配不僅能提高對(duì)靶標(biāo)生物的防治效果,并且對(duì)其耐藥性的產(chǎn)生具有一定的延緩作用[7]。

氟吡菌酰胺是拜耳公司研發(fā)的1種新一代優(yōu)秀殺菌劑,近年發(fā)現(xiàn)其還兼具殺線(xiàn)功能[8]。氟吡菌酰胺是作用于線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞鏈上的復(fù)合體Ⅱ(即琥珀酸脫氫酶,SDH)或琥珀酸輔酶Q還原酶(SQR),主要起到抑制呼吸系統(tǒng)的作用[9]。甲維鹽是微生物源殺蟲(chóng)劑,其作用機(jī)理是阻斷害蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能,起到抑制神經(jīng)功能的作用[10]。已有學(xué)者通過(guò)試驗(yàn)研究表明,將具有不同作用機(jī)理的兩種藥劑進(jìn)行合理的復(fù)配,可達(dá)到更好的致死效果[11]。因而,為了明確這兩種藥劑在不同配比時(shí)的聯(lián)合毒力效果,本研究在測(cè)定氟吡菌酰胺和甲維鹽兩種藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)室內(nèi)毒力的基礎(chǔ)上,設(shè)置不同的配比,并以Sun et al.[12]的共毒系數(shù)法篩選出具有增效的配方組合,進(jìn)一步探究增效效果較好的藥劑配比對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵孵化的影響,旨在為松材線(xiàn)蟲(chóng)復(fù)配藥劑的合理選用提供參考。

1 材料與方法

供試蟲(chóng)源:松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株AMA3,保存于南京林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

供試藥劑:質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%的氟吡菌酰胺原藥(杭州益森鍵生物科技有限公司),質(zhì)量分?jǐn)?shù)72.27%的甲維鹽原藥(江蘇功成生物科技有限公司)。

線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)與獲得:將在冰箱中4 ℃保存的松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3蟲(chóng)株接種到長(zhǎng)滿(mǎn)灰葡萄孢菌絲的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,隨后放置在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)5～7 d,待線(xiàn)蟲(chóng)將菌絲取食干凈,利用貝爾曼漏斗法收集松材線(xiàn)蟲(chóng),將收集到的松材線(xiàn)蟲(chóng)液體以3 500 r·min-1離心3 min,反復(fù)沖洗3次,并將其配制成所需要的線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液。

蟲(chóng)卵的培養(yǎng)與獲得:吸取足量的線(xiàn)蟲(chóng)于培養(yǎng)皿內(nèi),讓性成熟的雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)自由交配并產(chǎn)卵,放置在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)2～3 h,待卵產(chǎn)出后,將線(xiàn)蟲(chóng)倒掉,保留皿底的蟲(chóng)卵,利用高溫滅菌過(guò)的毛刷,將皿底的蟲(chóng)卵收集起來(lái),將其配制成所需的蟲(chóng)卵懸浮液。

不同藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)毒力的測(cè)定:采用浸蟲(chóng)法探究?jī)煞N原藥室內(nèi)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒力。將供試藥劑用N-N二甲基甲酰胺配制成母液,再用吐溫-80水溶液將母液等比稀釋成5個(gè)供試質(zhì)量濃度。每個(gè)質(zhì)量濃度為一個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)5次,以無(wú)菌水為對(duì)照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐溫-80配制成的水溶液為對(duì)照2。將藥液和蟲(chóng)液按照體積比1∶1混合加入1.5 mL離心管中,將所有離心管置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng),24 h后,在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)線(xiàn)蟲(chóng)的存活數(shù)和死亡數(shù)。由于松材線(xiàn)蟲(chóng)存在假死現(xiàn)象,在判斷其生命時(shí),蟲(chóng)體擺動(dòng)呈“S”形、螺旋形、卷曲形判為活蟲(chóng);蟲(chóng)體僵直不動(dòng)呈“J”形、“C”形,體表無(wú)光澤并且用昆蟲(chóng)針?lè)磸?fù)刺激,若仍僵直不動(dòng),則可判為死蟲(chóng)[13]。

校正死亡率=[(處理組死亡率-對(duì)照2組死亡率)/(1-對(duì)照2組死亡率)]×100%。

復(fù)配藥劑室內(nèi)聯(lián)合毒力測(cè)定:采用交互測(cè)定法[14],將兩種藥劑按照不同的比例進(jìn)行混合,得到混配藥劑,將其等比設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度,按照上段方法進(jìn)行毒力測(cè)定,求出致死中質(zhì)量濃度(LC50),測(cè)定出其對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的聯(lián)合毒力,評(píng)判方法依據(jù)Sun et al.[12]的共毒系數(shù)(CTC)法,篩選出共毒系數(shù)大于120的增效配比。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:共毒系數(shù)>120為增效作用;共毒系數(shù)<80為拮抗作用;80≤共毒系數(shù)≤120為相加作用。

單劑毒力指數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)藥劑LC50/供試單劑的LC50)×100。

混劑(A+B)理論毒力指數(shù)=A劑的毒力指數(shù)×A劑在混劑中的質(zhì)量占比+B劑的毒力指數(shù)×B劑在混劑中的質(zhì)量占比。

混劑(A+B)實(shí)測(cè)毒力指數(shù)=[標(biāo)準(zhǔn)藥劑的LC50/混劑(A+B)的LC50]×100。

共毒系數(shù)=[混劑(A+B)實(shí)測(cè)毒力指數(shù)/混劑(A+B)理論毒力指數(shù)]×100。

不同藥液配比時(shí)松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵量測(cè)定:利用貝爾曼漏斗法收集松材線(xiàn)蟲(chóng),將其配制成每20 μL含50雌雄成蟲(chóng)的線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液。將線(xiàn)蟲(chóng)液和藥液按照體積比1∶1混勻,加入1.5 mL離心管中,每個(gè)配比重復(fù)5次,以無(wú)菌水作為對(duì)照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐溫-80水溶液為對(duì)照2。將蟲(chóng)液浸泡12、18、30 h,在不同時(shí)間段觀察各配比線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)出卵的數(shù)量。

不同藥液配比時(shí)松材線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化率測(cè)定:將不同配比的藥液分別和蟲(chóng)卵懸浮液(50～60個(gè)/10 μL水溶液)按體積比1∶1混勻,放置在1.5 mL離心管中,每個(gè)配比重復(fù)5次,以無(wú)菌水作為對(duì)照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐溫-80水溶液為對(duì)照2。浸泡12、18、30 h,在不同時(shí)間段觀察各配比孵化出幼蟲(chóng)及卵的數(shù)量。

蟲(chóng)卵孵化率=[幼蟲(chóng)數(shù)/(卵數(shù)+幼蟲(chóng)數(shù))]×100%。

數(shù)據(jù)處理:試驗(yàn)數(shù)據(jù)選用WPS 2019軟件整理;利用DPS軟件和機(jī)率值分析法對(duì)藥劑進(jìn)行毒力回歸分析,計(jì)算致死中濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒力效果

兩種不同藥劑在24 h后,對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒力分析結(jié)果如表1所示,氟吡菌酰胺的LC50為4.071 5 μg/mL,毒力作用明顯高于甲維鹽(2 159.885 4 μg/mL)。

表1 不同藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)毒力分析結(jié)果

2.2 復(fù)配藥劑聯(lián)合毒力效果

由表2可知,在7個(gè)復(fù)配組合中,共毒系數(shù)大于120的有5對(duì)配比,其中,氟吡菌酰胺和甲維鹽以質(zhì)量比3∶5混合時(shí),共毒系數(shù)(CTC)為334.673 1,在7組不同配比中達(dá)到最高,增效作用最為明顯。質(zhì)量比在5∶3、2∶6時(shí),共毒系數(shù)(CTC)值分別為159.768 2、215.704 1,2個(gè)比例也表現(xiàn)出較高的增效作用。質(zhì)量比在4∶4、1∶7時(shí),共毒系數(shù)(CTC)值分別為126.850 2、122.429 5,表現(xiàn)出增效作用。在質(zhì)量比為6∶2、7∶1時(shí),均表現(xiàn)為相加作用,共毒系數(shù)(CTC)值分別為104.113 6、99.308 1。

表2 復(fù)配藥劑聯(lián)合毒力分析結(jié)果

2.3 藥液在不同配比時(shí)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵的影響

由表3可知,對(duì)照1為純水處理組,對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的產(chǎn)卵能力沒(méi)有影響,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)卵逐漸增多。對(duì)照2與對(duì)照1結(jié)果無(wú)顯著差異,表明N-N二甲基甲酰胺和吐溫-80水溶液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵基本無(wú)影響。經(jīng)過(guò)氟吡菌酰胺和甲維鹽單劑處理過(guò)的松材線(xiàn)蟲(chóng),在處理18 h時(shí)的產(chǎn)卵量分別107.33、56.67粒,在處理30 h時(shí)的產(chǎn)卵量分別為78.67、46.00粒,顯著低于對(duì)照1、對(duì)照2。配比組合5∶3在處理12、18、30 h時(shí)的產(chǎn)卵量分別為35.67、35.00、33.67粒,質(zhì)量比為3∶5的組合在處理12、18、30 h時(shí)的產(chǎn)卵量分別為27.67、22.33、21.00粒,質(zhì)量比為2∶6時(shí),在處理12、18、30 h時(shí)的產(chǎn)卵量分別為28.00、26.67、24.33粒,均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)不同藥劑處理后的松材線(xiàn)蟲(chóng),在不同處理時(shí)間的產(chǎn)卵量表現(xiàn)為,對(duì)照1、對(duì)照2高于氟吡菌酰胺單劑、甲維鹽單劑,2種單劑高于復(fù)配藥劑,復(fù)配藥劑抑制松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵能力達(dá)到最高,差異顯著(P<0.05),且在3個(gè)時(shí)間段內(nèi),質(zhì)量比為3∶5的處理產(chǎn)卵量均達(dá)到最低。

表3 不同處理在不同處理時(shí)間松材線(xiàn)蟲(chóng)的產(chǎn)卵量

2.4 藥液在不同配比時(shí)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化率的影響

由表4可知,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),卵孵化率呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì),對(duì)照1和對(duì)照2在3個(gè)處理時(shí)間之間均無(wú)顯著差異。氟吡菌酰胺和甲維鹽2種單劑處理對(duì)卵孵化具有一定的抑制效果,其中,甲維鹽單劑處理對(duì)卵孵化抑制效果更好,在處理12、18、30 h時(shí)的孵化率分別為50.50%、54.40%、60.10%。復(fù)配處理的卵孵化率顯著低于2種單劑處理,質(zhì)量比為5∶3、3∶5、2∶6處理的松材線(xiàn)蟲(chóng),在處理12 h時(shí),孵化率最低,分別為27.36%、18.91%、22.11%,抑制效果遠(yuǎn)高于對(duì)照1和對(duì)照2,且高于2種單劑處理。質(zhì)量比為3∶5的處理在處理12、18、30 h時(shí)的孵化率均達(dá)到各處理中的最低值,分別為18.91%、27.18%、28.87%。

表4 不同處理在不同處理時(shí)間松材線(xiàn)蟲(chóng)的卵孵化率

3 結(jié)論與討論

通過(guò)兩種藥劑單獨(dú)使用時(shí)的殺線(xiàn)效果發(fā)現(xiàn),氟吡菌酰胺對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的殺線(xiàn)效果更好,且目前這種藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的作用研究結(jié)果較少,具備成為一種新的防治松材線(xiàn)蟲(chóng)注射劑的潛力[15],其主要作用于靶標(biāo)生物的呼吸系統(tǒng)[9]。甲維鹽的作用機(jī)理是影響害蟲(chóng)體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞功能,使害蟲(chóng)神經(jīng)細(xì)胞中氯離子濃度升高,進(jìn)而破壞神經(jīng)傳導(dǎo)功能,使害蟲(chóng)肢體發(fā)生麻痹[16],導(dǎo)致其致死中濃度偏高。

氟吡菌酰胺與甲維鹽的的作用機(jī)理不同,兩者復(fù)配可以實(shí)現(xiàn)不同的作用位點(diǎn)共同作用的效果,有效克服作用位點(diǎn)單一、產(chǎn)生抗藥性突變等問(wèn)題[17]?，F(xiàn)階段已有不少關(guān)于藥劑聯(lián)合使用的研究,如硫酸銅與溴氰菊酯、硫酸銅與阿維菌素以及涕滅威與溴氰菊酯對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的聯(lián)合用藥都能使對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒性增強(qiáng)[13]。也有研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素和吡蟲(chóng)啉聯(lián)合染毒,對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)也表現(xiàn)出增效作用[18]。本試驗(yàn)通過(guò)共毒系數(shù)法[12]對(duì)氟吡菌酰胺和甲維鹽進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定,結(jié)果表明,7個(gè)混配比例中,除了氟吡菌酰胺和甲維鹽質(zhì)量比為7∶1和6∶2時(shí),效果顯示為相加作用外,其他5個(gè)復(fù)配比例效果均為增效。

為了進(jìn)一步篩選出最佳的增效配比,將共毒系數(shù)高、增效作用明顯的質(zhì)量比組合3∶5、5∶3、2∶6,以及氟吡菌酰胺和甲維鹽兩種單劑進(jìn)行松材線(xiàn)蟲(chóng)的產(chǎn)卵試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)不同藥劑處理過(guò)的線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵量和時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì),這是由于雌蟲(chóng)死亡率的上升以及卵正處于孵化時(shí)間內(nèi)等原因?qū)е?并且經(jīng)過(guò)復(fù)配藥劑處理后的松材線(xiàn)蟲(chóng)在不同處理時(shí)間的產(chǎn)卵量均低于兩種單劑處理后的松材線(xiàn)蟲(chóng)的產(chǎn)卵量。

卵孵化率是體現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖力的重要因素之一,25 ℃培養(yǎng)時(shí),卵孵化為二齡幼蟲(chóng)需要25 h[19]。有研究發(fā)現(xiàn),甲維鹽處理過(guò)的卵孵化率低于氟吡菌酰胺處理過(guò)的卵孵化率[20]。質(zhì)量比為3∶5、5∶3、2∶6時(shí)能大大降低松材線(xiàn)蟲(chóng)的卵孵化率,其中,質(zhì)量比為3∶5時(shí)對(duì)卵孵化的抑制作用最大。

綜合氟吡菌酰胺和甲維鹽在不同配比時(shí)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的殺線(xiàn)效果、共毒系數(shù)、產(chǎn)卵和卵孵化的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),質(zhì)量比為3∶5、5∶3、2∶6時(shí)都具有良好的防治松材線(xiàn)蟲(chóng)病的潛力,為后續(xù)防治松材線(xiàn)蟲(chóng)復(fù)配注干劑配方的篩選及林間應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。