談 艷, 陶菲兒, 王成海, 3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;2. 江蘇省揚(yáng)州洪泉醫(yī)院 放療中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225200;3. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌組織學(xué)亞型[1-2]。環(huán)狀核糖核酸(circRNA)是非編碼RNA的一種類型,其參與多種癌癥的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[3-4]。circRNA一直被認(rèn)為是微小RNA(miRNA)海綿來(lái)調(diào)節(jié)下游靶基因,可作為促癌基因和抑癌基因影響ESCC的形成和進(jìn)展[5-6]。研究[7]表明, ciRS-7中和了miR-7在體外和體內(nèi)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。目前,食管癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。本研究通過(guò)已有的circRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)獲得ESCC的差異表達(dá)circRNAs, 其中hsa_circ_0013058表達(dá)水平上調(diào),并得到驗(yàn)證[8]。本研究探討hsa_circ_0013058對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲、遷移的作用機(jī)制,以期為臨床治療轉(zhuǎn)移性ESCC提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

75例新鮮的ESCC組織和鄰近正常食管組織來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院和揚(yáng)州洪泉醫(yī)院外科手術(shù)患者。患者手術(shù)時(shí)間為2021年6月—2023年6月,年齡為38～72歲,中位年齡為54歲; 男42例,女33例。所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療。新鮮標(biāo)本采集后,立即放入液氮罐,于-80 ℃冰箱內(nèi)保存,以備后期實(shí)驗(yàn)使用。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)(第8版)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本分期進(jìn)行評(píng)估[8]。本研究經(jīng)揚(yáng)州洪泉醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞和材料

人正常食管上皮細(xì)胞Het-1A(#BFN60806666, BLUEFBIO, 中國(guó))、ESCC細(xì)胞株KYSE70(#ACC-379, 低分化鱗狀細(xì)胞瘤, DSMZ, 德國(guó))。細(xì)胞株在RPMI-1640培養(yǎng)基(#PM150110A, Procell, 武漢,中國(guó))中培養(yǎng),并添加青霉素G(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和10%胎牛血清(#10093, ThermoFisher)。所有細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的增濕空氣中培養(yǎng)。LPAR3抗體和GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam。hsa_circ_0013058過(guò)表達(dá)和敲低表達(dá)的質(zhì)粒由Thermofisher中國(guó)生物工程公司合成。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine3000、LPAR3 單抗(#PA5-33496)和GAPDH單抗(#MA1-16757)購(gòu)買于Invitrogen公司,轉(zhuǎn)染步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)

采用總RNA提取試劑盒分離腫瘤組織或細(xì)胞后,提取總RNA, -80 ℃儲(chǔ)存。使用Ambion試劑盒(美國(guó)Life Technologies公司)將總RNA合成cDNA, 然后使用KOD SYBR qPCR Mix(日本Toyobo Life Science公司)進(jìn)行qPCR分析。熱循環(huán)條件: 98 ℃ 2 min; 98 ℃ 10 s, 61 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Cq計(jì)算評(píng)估hsa_circ_0013058表達(dá)水平,內(nèi)參為GAPDH。引物序列: hsa_circ_0013058正向引物為5′-AACGTGAGCGGATGTTCACT-3′, 反向引物為5′-ACAGGCAGAAAAACGTCCCA-3′;GAPDH正向引物為5′-GAGTCACTGGCGTCTTCAC-3′, 反向引物為5′-TGCTGATGATCTTGAGGCTTT-3′。

1.4 RNA原位分子雜交實(shí)驗(yàn)(RISH)

hsa_circ_0013058 RNA探針和原位雜交試劑盒購(gòu)于武漢BOSTER生物公司。RISH實(shí)驗(yàn)步驟按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。雜交結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn): 細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì),則為hsa_circ_0013058陽(yáng)性病例; 實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和不加探針的空白對(duì)照。寡核苷酸探針序列: AUGAAGACGGUGAUGACUGUCCAGUCAUCACCGUCUUCAUUA; ACAGUGUCCAACCUCAUGGCCCCAUGAGGUUGGACACUGUCC。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

所有器械滅菌,直尺和記號(hào)筆在操作前進(jìn)行紫外線照射。先用記號(hào)筆在6孔板背后,參照直尺,均勻地劃?rùn)M線,每隔0.5～1.0 cm劃一道,橫穿過(guò)孔,每孔至少穿過(guò)5條線。加入約5×105個(gè)細(xì)胞,保證過(guò)夜能鋪滿。第2天用槍頭參照直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕。去除劃下的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第0、24、48小時(shí)分別取樣,拍照。

1.6 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn): 用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單個(gè)腫瘤細(xì)胞懸液。每個(gè)檢測(cè)樣品上室內(nèi)加0.2 mL懸液,下室內(nèi)添加有血清的培養(yǎng)液0.6 mL, 置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。將小室取出,棉簽擦掉基質(zhì)膠及沒穿膜的細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 95%乙醇固定15 min, 結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇5個(gè)光鏡視野,統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn): 腫瘤細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸浮液。把Matrigel于4 ℃融化,吸取50 μg Matrigel添加到95 μL的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi),將稀釋以后的Matrigel添加到Transwell小室內(nèi),轉(zhuǎn)移到37 ℃孵育1 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)hsa_circ_0013058的下游靶基因及驗(yàn)證

hsa_circ_0013058和微小RNA(miR)-548p的下游靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站分別為circinteractome.nia.nih.gov、www.targetscan.org和mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-548p下游靶基因。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)

在轉(zhuǎn)染48 h 的KYSE70細(xì)胞中加入RIPA緩沖液,于冰上裂解以提取總蛋白, 10 000 r/min離心10 min, 收集上清液。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白樣本,將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h; 然后將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天,室溫下將膜與二抗孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色,拍照并計(jì)算條帶相對(duì)灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)hsa_circ_0013058、miR-548p表達(dá)

在ESCC中, hsa_circ_0013058表達(dá)水平(3.323±0.203)高于癌旁正常組織(NC), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.078,P<0.05); miR-548p表達(dá)水平(0.654±0.027)低于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.675,P<0.05)。ESCC細(xì)胞株KYSE70 中hsa_circ_0013058表達(dá)水平(2.967±0.348)高于人正常食管上皮細(xì)胞Het-1A的(1.567±0.186), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示,在RNA水平上hsa_circ_0013058與miR-548p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.254 2,P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)提示hsa_circ_0013058在ESCC中可能發(fā)揮促癌基因作用,而miR-548p在ESCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。見圖1。

2.2 RISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hsa_circ_0013058的陽(yáng)性表達(dá)

RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,75例ESCC組織中hsa_circ_0013058 RNA陽(yáng)性染色為大小不等的棕黃色物質(zhì),主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,而在癌旁正常食管組織中幾乎沒有陽(yáng)性表達(dá)。ESCC組織hsa_circ_0013058陽(yáng)性率為72.00%(54/75), 高于癌旁正常組織的17.33%(13/75), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.862,P<0.05)。見圖2。

2.3 ESCC中hsa_circ_0013058表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

75例ESCC組織根據(jù)陽(yáng)性染色結(jié)果分為hsa_circ_0013058陽(yáng)性組(n=54)和hsa_circ_0013058陰性組(n=21)。hsa_circ_0013058表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05), 而與患者年齡、性別、腫瘤直徑和TNM分期均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 ESCC組織中hsa_circ_0013058表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013058后,劃痕傷口距離[(1.15±0.08) mm]短于對(duì)照[(3.45±0.12) mm], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013058增強(qiáng)了KYSE70細(xì)胞系的遷移能力。敲低hsa_circ_0013058表達(dá)后,劃痕傷口距離[(5.62±0.11) mm]長(zhǎng)于對(duì)照[(3.24±0.12) mm], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示敲低hsa_circ_0013058表達(dá)減弱了KYSE70細(xì)胞系的遷移能力。見圖3。

2.5 hsa_circ_0013058對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照比較[(59.8±6.21)個(gè)],過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013058后ESCC細(xì)胞的侵襲數(shù)目增多[(83.60±7.22)個(gè)],敲低hsa_circ_0013058表達(dá)后ESCC細(xì)胞的侵襲數(shù)目減少[(28.86±4.24)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照相比[(56.85±7.21)個(gè)],過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013058后ESCC細(xì)胞的遷移數(shù)目增多[(83.61±8.98)個(gè)],敲低hsa_circ_0013058表達(dá)后ESCC細(xì)胞遷移數(shù)目減少[(25.82±6.48)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

2.6 hsa_circ_0013058的下游靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

hsa_circ_0013058預(yù)測(cè)的下游miRNA一共22個(gè),根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目>7個(gè)且context+score percentile>90分進(jìn)行篩選,僅miR-548p符合上述條件。同時(shí)改變hsa_circ_0013058的表達(dá)后miR-548p也隨之變化(見圖5),提示miR-548p是hsa_circ_0013058的下游靶基因。預(yù)測(cè)miR-548p的下游靶基因是LPAR3, 通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(見圖6)得出在LPAR33′UTR野生型轉(zhuǎn)染中, miR-548p高表達(dá)可抑制相應(yīng)的熒光素酶活性,而在miR-548p突變中卻沒有熒光素酶活性的抑制作用。因此miR-548p與LPAR3為特異性結(jié)合,LPAR3是miR-548p的直接靶基因。

2.7 hsa_circ_0013058對(duì)ESCC細(xì)胞中miR-548p/LPAR3信號(hào)通路和侵襲、遷移的影響

回復(fù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)分組如下,1組: 對(duì)照; 2組: hsa_circ_0013058過(guò)表達(dá); 3組: hsa_circ_0013058敲低; 4組: hsa_circ_0013058過(guò)表達(dá)+miR-548p過(guò)表達(dá); 5組: hsa_circ_0013058過(guò)表達(dá)+miR-548p敲低; 6組: hsa_circ_0013058敲低+miR-548p過(guò)表達(dá); 7組: hsa_circ_0013058敲低+miR-548p敲低。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)hsa_circ_0013058后,miR-548p表達(dá)水平下降,而敲低hsa_circ_0013058表達(dá)后, miR-548p的表達(dá)水平升高(見圖7A), 進(jìn)一步說(shuō)明hsa_circ_0013058直接調(diào)控miR-548p。在變化hsa_circ_0013058或/和miR-548p的表達(dá)后,通過(guò)Western blot檢測(cè)LPAR蛋白變化,結(jié)果顯示,無(wú)論hsa_circ_0013058和miR-548p如何變化, LPAR3蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)變化(見圖7B),說(shuō)明LPAR3受hsa_circ_0013058的調(diào)控。以上結(jié)果表明, hsa_circ_0013058抑制miR-548p的表達(dá),進(jìn)而激活LPAR3信號(hào)通路,促進(jìn)ESCC細(xì)胞的侵襲和遷移。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)miR-548p能抑制hsa_circ_0013058對(duì)食管癌的侵襲、遷移的促進(jìn)作用,而降低miR-548p表達(dá)可增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲、遷移能力(見圖7C、表2)。

表2 ESCC細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目和LPAR3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

食管癌是一種起源于食管鱗狀上皮細(xì)胞或食管腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。目前, ESCC的治療方式包括手術(shù)切除、放療、化療和免疫治療,均取得了一定進(jìn)展,但晚期轉(zhuǎn)移性ESCC的臨床療效仍不理想[9-11]。因此,迫切需要探討有效的生物標(biāo)志物,以更好預(yù)測(cè)ESCC患者的預(yù)后。研究[12]表明, hsa_cir_0006168(circCNOT6L)在ESCC組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)。高表達(dá)circCNOT6L與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān),其通過(guò)miR-100/mTOR軸促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]。研究[14]表明, circ-FAT1在ESCC組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁非腫瘤組織; circ-FAT1通過(guò)在體外吸收miR-548g來(lái)抑制ESCC細(xì)胞的侵襲和遷移,從而發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。hsa_cir_0001666在ESCC組織和ESCC患者血漿中均下調(diào)[15], 與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān), hsa_cir_0001666低表達(dá)患者的預(yù)后較差。外源性hsa_cir_0001666抑制ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究[16]發(fā)現(xiàn), circDOCK5的表達(dá)水平在ESCC組織中下調(diào), circDOCK5通過(guò)發(fā)揮海綿作用增加miR-627-3p的穩(wěn)定性,并部分抑制TGFB2的表達(dá)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的分泌,抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究結(jié)果表明, hsa_circ_0013058為促癌基因,在ESCC組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,且在ESCC細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá); hsa_circ_0013058表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān),其陽(yáng)性表達(dá)率越高,腫瘤越易發(fā)生局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。由此提示, hsa_circ_0013058參與了癌細(xì)胞的局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移,可用于評(píng)估患者預(yù)后,有望成為浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性ESCC的生物標(biāo)記物。本研究中,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明hsa_circ_0013058可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了hsa_circ_0013058的下游靶基因是miR-548p, 并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了hsa_circ_0013058與miR-548p呈負(fù)相關(guān),提示hsa_circ_0013058發(fā)揮促癌基因功能,而miR-548p發(fā)揮抑癌基因功能,其共同參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展。此外,本研究預(yù)測(cè)了miR-548p下游靶基因是LPAR3, 并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明, miR-548p可直接調(diào)控LPAR3蛋白表達(dá)。本研究回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, hsa_circ_0013058可調(diào)控miR-548p的表達(dá); 抑制miR-548p的表達(dá)可激活LPAR3信號(hào)通路,促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移。本研究探討了hsa_circ_0013058在ESCC細(xì)胞侵襲、遷移中的作用機(jī)制,為今后診斷、治療轉(zhuǎn)移性食管癌提供了理論依據(jù)。

綜上所述, hsa_circ_0013058通過(guò)下調(diào)miR-548p表達(dá),激活LPAR3信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)ESCC細(xì)胞的侵襲和遷移。