封雪 馬海瀟 張美玲 蔣宜軒 劉貴巧 翁 瑞

（1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院， 河北邯鄲 056038； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所， 北京 100081）

辣椒屬于茄科辣椒屬， 是全球經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)中較重要的蔬菜作物[1]。 由于辣椒在烹飪、 工業(yè)、 醫(yī)療和作為觀賞植物上的用途， 辣椒市場(chǎng)規(guī)模在世界各地都呈上升趨勢(shì)。 根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織報(bào)告的最新數(shù)據(jù)， 從2011 年到2021 年， 全球辣椒總產(chǎn)量在10 年間增長(zhǎng)了15.7%。 2021 年我國(guó)新鮮辣椒種植面積為75 萬(wàn)hm2， 產(chǎn)量22 萬(wàn)t， 是全球最大的新鮮辣椒生產(chǎn)國(guó)。

在過(guò)去的20 年里， 人們對(duì)天然基質(zhì)中存在的生物活性物質(zhì)的化學(xué)和功能特性越來(lái)越感興趣， 加上人們對(duì)健康食品益處的認(rèn)識(shí)和分析儀器的進(jìn)步，促進(jìn)了以辣椒果實(shí)及其副產(chǎn)品為生物活性成分來(lái)源的研究。 辣椒中的生物活性成分主要為酚類化合物、 辣椒素和類胡蘿卜素， 其含量因果實(shí)組織（胎盤、 果皮和種子）、 栽培品種、 成熟階段、 氣候和儲(chǔ)存條件以及加工方式而異[2]。 辣椒中的生物活性物質(zhì)具有抗炎、 抗氧化、 抗癌等生理功能， 在風(fēng)味、 顏色等方面為辣椒增加了很高的商業(yè)價(jià)值[3]。

揭示辣椒的生物活性物質(zhì)， 從辣椒基質(zhì)中分離， 并在食品工業(yè)上加以利用， 以及開(kāi)發(fā)富含理想生物活性成分的辣椒新品種， 這些目標(biāo)在很大程度上取決于對(duì)生物活性成分的準(zhǔn)確定性和定量分析。不少學(xué)者對(duì)辣椒中重要的生物活性成分， 如酚類化合物、 辣椒素和類胡蘿卜素進(jìn)行了分析方法開(kāi)發(fā)和應(yīng)用， 但信息分散在不同的文獻(xiàn)中， 很少有人進(jìn)行系統(tǒng)的梳理。 ASNIN 和PARK[4]收集和整理了有關(guān)辣椒中活性成分的制備和分析方法等信息， 但到目前為止儀器和分析技術(shù)都取得了新的重大進(jìn)展， 一些分析方法已經(jīng)成為過(guò)去式。 本文的目的是收集近幾年關(guān)于辣椒中生物活性成分的分析方法， 特別是具有高選擇性、 靈敏性和通用性的分析技術(shù)， 以期為辣椒中生物活性成分的檢測(cè)提供一定的參考。

一、 酚類化合物的分析方法

酚類化合物是植物在脅迫條件下產(chǎn)生的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物， 由于其強(qiáng)大的抗氧化活性， 在過(guò)去的幾十年中引起了科研工作者的廣泛興趣。 它們?cè)谥参镏械暮渴懿煌蛩氐挠绊懀?如基因型、 發(fā)育階段、 生長(zhǎng)區(qū)域、 農(nóng)業(yè)栽培方式、 氣候和采后加工條件等[5]。 辣椒中的酚類化合物主要為黃酮類化合物（木犀草素6－C－己糖苷、 山奈酚戊糖基二糖苷等）[6]和酚酸類化合物 （香草酸、 咖啡酸、 阿魏酸、 對(duì)香豆酸、 對(duì)羥基苯甲酸等）[7]。 這些酚類化合物在一定程度上賦予辣椒的味道和風(fēng)味， 并具有很高的抗氧化活性， 對(duì)人體健康有益，如保護(hù)血管、 預(yù)防癌癥、 預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、 抗菌、抗炎、 抗腫瘤、 抗肥胖等[8]。

（一） 樣品的制備和提取辣椒收獲后的前處理過(guò)程對(duì)其酚類化合物含量有至關(guān)重要的影響。 其中， 干燥是食品工業(yè)中廣泛使用的一種保存方法[9]。常用的干燥技術(shù)包括熱風(fēng)、 微波、 紅外線、 真空和冷凍干燥等[10]。 YAP 等[11]評(píng)價(jià)了不同熱風(fēng)干燥溫度（60～160℃） 和時(shí)間 （30～120 min） 對(duì)辣椒中酚類化合物含量的影響， 結(jié)果顯示， 120℃熱風(fēng)干燥30 min 提取酚類化合物的效果較好， 其中綠原酸是最穩(wěn)定且含量最高的化合物， 蘆丁和槲皮素在160℃的高溫下還可以檢測(cè)到， 但含量隨溫度的增加呈下降趨勢(shì)。 紅外干燥因其穿透力強(qiáng)、 傳遞速度快等優(yōu)點(diǎn)， 可以在更短的時(shí)間內(nèi)減少水分， 從而減少酚類化合物的降解， GUCLU 等[6]的研究證明了這一點(diǎn)。 真空冷凍干燥可最大程度保留干燥后食品的色澤和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 相比于其他干燥方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12]。 但該技術(shù)成本和能源消耗較高， 凍干時(shí)間較長(zhǎng)。 由于所有干燥技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)， 所以建議根據(jù)原材料的種類使用組合技術(shù)以最大效率地保持干燥產(chǎn)品的品質(zhì)。 有研究表明， 冷凍干燥和滲透預(yù)處理的組合可最大程度保持原材料的功能和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[13]。 TURKIEWICZ 等[14]采用70℃的對(duì)流預(yù)干燥和120 W 的真空微波干燥的組合方法對(duì)木瓜進(jìn)行干燥， 酚類化合物含量與采用真空冷凍干燥技術(shù)時(shí)接近， 且其成本更低， 干燥時(shí)間更短。

萃取是酚類化合物分離的重要步驟。 傳統(tǒng)溶劑萃取是分離酚類化合物的最常用且最簡(jiǎn)單的萃取技術(shù)， 酚類化合物通常在極性比水低的溶劑中更易溶解[15]。 甲醇[16]、 乙醇[17]、 乙腈[7]、 己烷、 丙酮以及其水溶液是提取酚類化合物常用的有機(jī)溶劑。MARINCAS 等[18]采用甲醇（100%）、 乙醇（100%）、甲醇－乙醇（50∶50， 體積比）、 己烷（100%）、 己烷－乙醇（50∶50， 體積比）、 丙酮（100%） 以及己烷－丙酮（50∶50， 體積比） 7 種不同萃取溶劑對(duì)辣椒中黃酮類化合物進(jìn)行萃取， 發(fā)現(xiàn)甲醇是最適合的提取溶劑。 但由于辣椒中酚類化合物的極性差異較大， 有機(jī)溶劑與水的混合溶劑是提取辣椒中酚類化合物的常用溶劑[7，19]。

傳統(tǒng)方法會(huì)消耗大量的溶劑和樣品， 操作時(shí)間長(zhǎng)， 處理溫度高， 可能導(dǎo)致酚類化合物的降解。 在樣品前處理技術(shù)方面， 學(xué)者們一直在努力開(kāi)發(fā)更快、 更環(huán)保、 成本更低的萃取和凈化方法， 旨在克服傳統(tǒng)方法的局限性[20]。 超臨界流體萃取 （SFE）、微波輔助萃取（MAE）、 加壓液體萃取（PLE） 和超聲輔助萃?。║AE） 等綠色萃取工藝已被用于提取酚類化合物， 可有效減少提取時(shí)間和溶劑用量[21]。DIAS 等[22]通過(guò)超聲波輔助二氧化碳超臨界流體萃取法（SFE－US） 從紅辣椒中提取酚類化合物， 超聲波的應(yīng)用使SFE 的總提取率提高了45%。 傳統(tǒng)萃取方法的小型化也被用于酚類化合物的提取， 其主要優(yōu)點(diǎn)是減少樣品、 溶劑的用量， 降低成本和廢棄物的產(chǎn)生， 此外還可以減少試驗(yàn)步驟和分析時(shí)間[20]。μ－QuEChERS （“微型快速、 簡(jiǎn)單、 便宜、 高效、堅(jiān)固和安全” 的縮寫） 是傳統(tǒng)QuEChERS 的小型化技術(shù)。 QuEChERS 技術(shù)一般用于蔬菜水果中農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)[23]， 是將振蕩法萃取、 液液萃取法初步凈化、 基質(zhì)分散固相萃?。╠－SPE） 凈化相結(jié)合的一種樣品前處理方法， 常用的吸附劑有十八烷基鍵合硅膠 （C18）、 乙二胺－N－丙基硅膠（PSA）和石墨化碳黑（GCB）等[24]， 該技術(shù)操作簡(jiǎn)單， 萃取效率高， 近年來(lái)也被用于檢測(cè)食品中的活性成分。RODRIGUES 等[25]用優(yōu)化的μ－QuEChERS 方法對(duì)紅辣椒中的酚酸和黃酮類化合物進(jìn)行檢測(cè)， 萃取部分采用Mg SO4和CH3COONa， 凈化步驟選擇MgSO4、 PSA 與GCB 的組合， 與傳統(tǒng)的樣品制備技術(shù)相比， 樣品的量以及溶劑體積分別減少了32倍和14 倍。 但由于現(xiàn)有的酚類化合物數(shù)量眾多，傳統(tǒng)制備技術(shù)具有嚴(yán)重的局限性， 且綠色節(jié)能的新技術(shù)還沒(méi)有被廣泛應(yīng)用， 因此到目前為止并沒(méi)有針對(duì)所有類型的酚類化合物的通用萃取方法。

（二） 鑒定和定量酚類化合物總量的測(cè)定主要基于Folin－Ciocalteau （FC） 比色法[26]， 已使用了幾十年。 測(cè)定酚類化合物的方法還包括熒光法[27]、 電化學(xué)檢測(cè)法[28]、 氣相色譜法（GC）[29]、 高效液相色譜－紫外檢測(cè)法（HPLC－UV）[30]和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）[31]等。 熒光法根據(jù)分子吸收的能量而發(fā)射出熒光， 根據(jù)熒光的光譜和熒光強(qiáng)度， 對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量， 是一種靈敏而有選擇性的分析技術(shù)， 酚類化合物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)一般在275～500 nm， 激發(fā)波長(zhǎng)在260～380 nm。 但該方法干擾因素多， 容易被光分解， 且對(duì)于單個(gè)酚類化合物的檢測(cè)較為麻煩。 電化學(xué)檢測(cè)法是根據(jù)傳感器與分析物相互作用時(shí)電流、 電壓或電導(dǎo)的變化， 對(duì)酚類化合物進(jìn)行檢測(cè)。 該技術(shù)成本低、 效率高、 響應(yīng)時(shí)間短， 但是電化學(xué)傳感器存在電極結(jié)垢的巨大缺點(diǎn)，需要進(jìn)行頻繁校準(zhǔn)[32]。 GC 以及氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）主要檢測(cè)辣椒中的香氣以及脂肪酸等揮發(fā)性成分， 對(duì)于非揮發(fā)的酚類化合物一般需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化， TEMERDASHEV 等[33]通過(guò)固相萃?。苌璆C－MS 測(cè)定貫葉連翹水提取物中的酚類化合物， 與常規(guī)溶液分析衍生化相比， 在吸附劑上制備衍生物縮短了樣品制備時(shí)間， 減少了提取物的體積。 目前還沒(méi)有針對(duì)辣椒中酚類化合物的氣相色譜方法。

HPLC－UV 常被用于酚類化合物的分離和定量[34]， 檢測(cè)波長(zhǎng)一般在200～400 nm， 絕大多數(shù)酚類化合物可在C18柱[2，19]上進(jìn)行分離， 也可使用HSS T3 柱[35]和RP－Amide 柱[36]。 流動(dòng)相選擇甲醇或者乙腈， 可適當(dāng)加入甲酸或乙酸以調(diào)整峰型和保留時(shí)間。 XU 等[37]用HPLC 和超高效液相色譜 （UPLC）測(cè)定了貴州省9 個(gè)不同辣椒品種中的6 種酚類化合物， 其中兒茶素是主要的酚類化合物， 含量為192.21～384.73 μg/g； GUILHERME 等[38]對(duì)青椒和紅辣椒中9 種酚類化合物進(jìn)行鑒定和定量， 其中間香豆酸、 鄰香豆酸和槲皮素－3－O－鼠李糖苷在綠色青椒中含量更高， 綠原酸、 咖啡酸和蘆丁在紅色辣椒中的含量更高。 然而， 這種檢測(cè)器的主要局限性在于： 化合物的鑒定只能通過(guò)保留時(shí)間和紫外光譜進(jìn)行[15]， 在復(fù)雜樣品中其定量數(shù)據(jù)可能會(huì)受到一定影響。 為了克服這個(gè)問(wèn)題， 近年來(lái)， 利用LCMS/MS 檢測(cè)酚類化合物的研究越來(lái)越多。 LCMS/MS 能夠通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM） 掃描模式降低噪聲和提高靈敏度， 通過(guò)二級(jí)碎片離子信息對(duì)酚類化合物進(jìn)行定性， 采用外標(biāo)法進(jìn)行精確的定量分析[35]且樣品前處理簡(jiǎn)單。 BARBOSA 等[7]采用LCMS/MS 對(duì)辣椒粉中36 種酚類化合物進(jìn)行了定量分析， 檢出限 （LOD） 為0.01～1 400 μg/L， 定量限（LOQ） 為0.03～4 500 μg/L； RODRIGUES 等[25]測(cè)定了辣椒中的14 種酚酸和黃酮類化合物， 其中香蘭素、 阿魏酸和柚皮素含量較高， 占所評(píng)價(jià)酚類化合物總量的92.2%， LOD 為7～87 μg/kg， LOQ 為25～290 μg/kg； MI 等[19]通過(guò)同時(shí)對(duì)38 種黃酮類化合物進(jìn)行LC－MS/MS 測(cè)定， 建立了黃酮類化合物的指紋圖譜。 使用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)辣椒中的酚類化合物進(jìn)行定量分析， 是進(jìn)一步對(duì)其相關(guān)特性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)， 更是對(duì)其進(jìn)行后續(xù)加工與應(yīng)用的關(guān)鍵。

二、 辣椒素的分析方法

辣椒素是辣椒產(chǎn)生刺鼻、 灼熱感的次級(jí)代謝產(chǎn)物， 通常由辣椒胎座合成， 位于種子、 果皮和胎盤組織中， 是一種常見(jiàn)的天然食品添加劑和辣味調(diào)味品。 辣椒中的辣椒素主要是辣椒素、 二氫辣椒素、降二氫辣椒素、 高二氫辣椒素和高辣椒素， 其中辣椒素和二氫辣椒素含量最高， 約占總含量的90%以上[39]。 它們的含量主要取決于基因型、 果實(shí)成熟度和種植條件等[40]。 辣椒素因其辛辣的風(fēng)味， 具有增加食欲、 開(kāi)胃消食等作用[41]。 此外， 辣椒素還具有抗癌、 抗炎、 降糖、 抗肥胖[42]、 有利于胃腸道健康[43]等功效。

（一） 樣品的制備和提取液液萃取 （LLE）是從植物中提取次生代謝產(chǎn)物的最常見(jiàn)方法[44]， 其中萃取溶劑的極性是萃取條件中的重要因素之一。WAQAS 等[45]評(píng)估了不同溶劑和表面活性劑對(duì)辣椒素浸漬萃取效率的影響， 發(fā)現(xiàn)所用溶劑的萃取效率排序?yàn)橐宜嵋阴ィ径燃淄椋颈靖视停疽译妫炯状迹疽宜幔炯妆健?但傳統(tǒng)萃取技術(shù)有其明顯的缺點(diǎn)，例如LLE 的萃取程序繁瑣且需消耗大量的有毒有機(jī)溶劑， 固相萃取 （SPE） 使用的有機(jī)溶劑體積較小， 但濾芯的成本過(guò)高。 目前， 現(xiàn)代萃取技術(shù)， 如UAE、 MAE、 SFE、 PLE、 酶輔助提?。‥AE）、 深共晶溶劑提取 （DESs）、 脈沖電場(chǎng) （PEF） 等已被開(kāi)發(fā)為辣椒素的綠色萃取技術(shù)[46]。

近年來(lái)， 小型化萃取技術(shù)也成為辣椒素萃取技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。 分散液－液微萃取 （DLLME） 由于其快速、 環(huán)保、 高萃取效率和簡(jiǎn)便性在食品分析中有廣泛的應(yīng)用[47]。 該技術(shù)是將萃取劑 （有機(jī)溶劑） 和分散劑的混合物注入水相樣品基質(zhì)中， 形成水/ 分散劑/ 萃取劑的乳濁液體系， 乳化液滴具有很大的間隙面積， 因此， 快速達(dá)到平衡， 提取瞬間完成。 CALEB 等[48]使用DLLME， 結(jié)合高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器 （DAD） 對(duì)不同品種辣椒中的3 種主要辣椒素（辣椒素、 二氫辣椒素和降二氫辣椒素） 進(jìn)行了萃取濃縮和測(cè)定， 萃取時(shí)間僅需15 s， 且具有良好的回收率。 由于辣椒基質(zhì)的復(fù)雜性， 單一的萃取方法很難將辣椒素提取完全， 最好的萃取方法是根據(jù)不同萃取技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)將不同的萃取工藝組合在一起， 可顯著提高萃取過(guò)程和最終產(chǎn)品的質(zhì)量[46]。 但仍有很多需要研究的地方， 例如辣椒素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化、 最新先進(jìn)技術(shù)以及預(yù)處理工藝對(duì)辣椒素回收效率的影響等。

（二） 鑒定和定量辣椒中辣椒素的檢測(cè)技術(shù)主要是核磁共振法（NMR）[49]、 電化學(xué)法、 HPLC[50]、GC[51]、 LC－MS/MS[52]和GC－MS[53]等。 NMR 具有數(shù)據(jù)采集時(shí)間短、 分析物結(jié)構(gòu)鑒定可靠性高等優(yōu)點(diǎn)， 但該方法靈敏度較低， 定量范圍較窄。 BORA等[49]以苯為內(nèi)標(biāo)， 建立了測(cè)定干辣椒和油樹脂中辣椒素和總辣椒素的1H－qNMR 方法， 該方法檢出限為4.4 μg/mL， 定量限為14.8 μg/mL， 線性范圍為0.083～8.33 mg/mL， 回收率為98.51%～106.50%，滿足檢測(cè)要求。 辣椒素結(jié)構(gòu)中存在酚類片段容易進(jìn)行氧化， 因此可進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)， 電化學(xué)方法具有快速響應(yīng)、 靈敏度高、 成本效益低和易于小型化等特點(diǎn)， 但是電極的制備非常耗時(shí)， 且檢測(cè)范圍較窄。 目前對(duì)電化學(xué)檢測(cè)方法的研究主要集中在對(duì)電極的優(yōu)化， 如ZIYATDINOVA 等[54]開(kāi)發(fā)了用羧化單壁碳納米管（SWNT－COOH） 和CeO2表面活性劑分散體修飾的玻璃碳電極 （GCE）， 該電極對(duì)辣椒素具有高選擇性， 可用于辣椒素的定量， 線性范圍較寬， 為0.10～7.5 μmol/L 和7.5～500 μmol/L，檢出限、 定量限分別為28、 92 nmol/L； JIMENEZ等[55]開(kāi)發(fā)了一種基于還原氧化石墨烯修飾絲網(wǎng)印刷碳電極 （rGO－SPCE） 的伏安傳感器來(lái)檢測(cè)辣椒素， 通過(guò)清洗步驟有效減少電極結(jié)垢， 可進(jìn)行重復(fù)使用， 其線性范圍為1.1～25.0 μmol/L 和25.0～150.3 μmol/L， 檢出限為0.3 μmol/L。 因GC 需要對(duì)分析物進(jìn)行衍生化， 會(huì)延長(zhǎng)分析前樣品制備時(shí)間， 所以GC 使用相對(duì)較少。

目前， 使用HPLC 結(jié)合熒光 （FL） 和紫外（UV）[56]檢測(cè)辣椒素含量的研究較多， FL 檢測(cè)辣椒素的激發(fā)波長(zhǎng)為229 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為320 nm， 流動(dòng)相一般選擇甲醇或乙腈[57]， 色譜柱多為C18柱[50]。方林明等[58]采用HPLC 結(jié)合FL 測(cè)定食品中辣椒素類化合物含量， 其中辣椒素的檢出限為0.05 mg/kg，二氫辣椒素的檢出限為0.10 mg/kg， 在不同基質(zhì)中的回收率范圍為69.8%～105.7%， 但熒光檢測(cè)極易受背景熒光和猝滅效應(yīng)的影響， 導(dǎo)致定量數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。 UV 檢測(cè)器是HPLC 中最常用的檢測(cè)器， 辣椒素的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm， 其線性范圍寬， 為1～200 mg/L， 操作簡(jiǎn)單， 但其靈敏度有限， 辣椒素的LOD 為0.018 mg/L， LOQ 為0.062 mg/L[40]。 HPLC結(jié)合質(zhì)譜 （MS） 檢測(cè)可通過(guò)精確的分子量 （m/z）對(duì)辣椒素進(jìn)行鑒定， 比大多數(shù)HPLC－UV 方法具有更高的靈敏度， 其高選擇性也可用于直接測(cè)定辣椒果實(shí)中微量辣椒素的濃度。 ALOTHMAN 等[59]采用超高效液相色譜－質(zhì)譜 （UPLC－MS） 檢測(cè)辣椒中的降二氫辣椒素、 辣椒素、 二氫辣椒素、 高辣椒素、 高二氫辣椒素， LOD 分別為0.15、 0.05、 0.06、0.2、 0.1 μg/g， LOQ 分別為1.07、 1.16、 0.89、1.22、 1.11 μg/g。 該方法與傳統(tǒng)的HPLC－MS 方法相比， 具有分析時(shí)間短、 靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。 而LC－MS/MS 方法的靈敏度和選擇性更高， 適用于復(fù)雜的樣品基質(zhì)， 如LIU 等[60]采用LC－MS/MS 對(duì)辣椒中的辣椒素、 二氫辣椒素、 降二氫辣椒素進(jìn)行測(cè)定， 其LOD 分別為0.01、 0.01、 0.11 ng/mL，LOQ 分別為0.03、 0.04、 0.36 ng/mL。 液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合， 提高了檢測(cè)的靈敏度， 可檢測(cè)到更多的化合物， 但檢測(cè)成本也大大提高。 近幾年對(duì)辣椒素的研究著重在生物合成、 功能開(kāi)發(fā)等方面[61]， 對(duì)于檢測(cè)技術(shù)方法的開(kāi)發(fā)報(bào)道較少。

三、 類胡蘿卜素的分析方法

不同品種辣椒的成熟果實(shí)中的類胡蘿卜素被廣泛用作天然食用色素。 通常情況下， 每個(gè)辣椒品種的顏色都是可變的， 從未成熟果實(shí)的綠色、 黃色或白色， 到成熟階段的紅色、 暗紅色、 棕色， 有時(shí)甚至幾乎是黑色[62]。 顏色的變化主要源于在成熟過(guò)程中， 果實(shí)細(xì)胞中的質(zhì)體表現(xiàn)出劇烈的變化， 通常從葉綠體轉(zhuǎn)化為色質(zhì)體， 同時(shí)伴隨著葉綠素的降解和類胡蘿卜素的積累[63]。

類胡蘿卜素是具有多烯鏈和不同端基的親脂性C40類異戊二烯， 該結(jié)構(gòu)可以經(jīng)歷高度多樣的修飾，如一端或兩端的環(huán)化、 氫化、 脫氫、 添加側(cè)基等，從而產(chǎn)生非常廣泛的化合物群[64]。 這些化合物主要分為兩類， 分別為碳?xì)浠衔?（通常稱為胡蘿卜素， 主要包括α－胡蘿卜素和β－胡蘿卜素） 和含氧化合物 （通常命名為葉黃素， 包括β－隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、 紫黃質(zhì)和辣椒紅素等）[65]。 其中， 辣椒紅素是辣椒中主要的紅色色素， 約占類胡蘿卜素總量的50%， 其次是辣椒玉紅素， 這兩種色素是辣椒屬中特有的[66]。 類胡蘿卜素具有良好的抗氧化和抗癌活性， 因此在預(yù)防癌癥、 心血管疾病、 骨質(zhì)疏松癥和糖尿病等方面發(fā)揮著重要作用[67]。

（一） 樣品的制備和提取辣椒中的類胡蘿卜素在自然環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定， 但熱、 光、 空氣、 氧或化學(xué)物質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致其降解、 氧化和異構(gòu)化。 因此，在分析辣椒中類胡蘿卜素的過(guò)程中須小心避免其分解。 一般建議是在溫度低于4℃的黑暗環(huán)境或柔和光線下， 盡快地進(jìn)行均質(zhì)、 萃取和后續(xù)程序[4]。 最常用的萃取溶劑是丙酮[68]， 其他萃取劑包括正己烷－丙酮－無(wú)水乙醇（2∶1∶1， 體積比）[69]、 乙醇－正己烷 （1∶1， 體積比）[70]、 乙醇－丙酮 （1∶1， 體積比）[71]等。

由于成熟辣椒中存在酯類化合物， 通常建議增加皂化步驟， 以改善類胡蘿卜素的定量。 提取類胡蘿卜素的一般流程為稱取辣椒樣品加入丙酮（含有0.1%BHT） 進(jìn)行萃取， 直至樣品沒(méi)有顏色為止，將提取物進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮至最終的體積為50 mL， 將提取液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中， 加入乙醚和氯化鈉（10%） 進(jìn)行分離， 棄去水相， 用無(wú)水Na2SO4（2%）洗滌除去剩余水分， 加入甲醇－KOH （10%～20%）進(jìn)行皂化， 皂化在黑暗環(huán)境下進(jìn)行， 時(shí)間為1～24 h， 皂化完成后加入氯化鈉 （10%） 將溶液洗滌至中性， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（35℃） 至干， 檢測(cè)之前將其用丙酮復(fù)溶[66]。 但是GIUFFRIDA 等[72]認(rèn)為皂化步驟是一種清理過(guò)程， 可能會(huì)導(dǎo)致樣品中天然類胡蘿卜素的降解， 其利用HPLC－MS 對(duì)辣椒中的天然類胡蘿卜素直接進(jìn)行分析， 共鑒定出52 種類胡蘿卜素，其中也包括酯類。 考慮到傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取過(guò)程會(huì)大量使用溶劑， 有些溶劑有毒， 會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生危害。 酶法提取、 超臨界流體提取、 微波輔助提取、索氏提取、 超聲波提取以及使用綠色溶劑 （植物油、 深層共晶溶劑、 離子液體和檸檬烯） 等方法已被用于提取類胡蘿卜素， 其中超臨界CO2技術(shù)和基于酶的提取工藝在回收效率和環(huán)境安全性方面顯示出良好的結(jié)果， 兩種或多種方法結(jié)合也可以提高產(chǎn)量并減少提取時(shí)間[73]。

（二） 鑒定和定量HPLC 是檢測(cè)類胡蘿卜素的常用方法[74]， 色譜柱一般選擇C18柱[66]或YMC C30柱[37]， 流動(dòng)相為丙酮水體系或甲醇/ 乙腈－水（含有一定比例的甲基叔丁基醚） 體系[75]， HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)在400～500 nm， 通常選擇450 nm[5，74]。對(duì)類胡蘿卜素的定量分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法， 內(nèi)標(biāo)法選擇β－apo－8'－胡蘿卜素作為內(nèi)標(biāo)添加到樣品中，大批量進(jìn)樣時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)。 外標(biāo)法是將類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的類胡蘿卜素成分進(jìn)行定量， 定量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確， 耗時(shí)較少， 但是類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)品較為昂貴， 且容易氧化， 標(biāo)準(zhǔn)品的保存條件較為苛刻， 一般避光、 密封保存在－20℃或－80℃， 配成溶液后盡快使用。 XU等[74]采用HPLC 對(duì)辣椒中5 種類胡蘿卜素（辣椒紅素、 玉米黃質(zhì)、 葉黃素、β－隱黃質(zhì)、β－胡蘿卜素） 進(jìn)行定量分析， 5 種類胡蘿卜素的LOD 范圍在0.020～0.063 mg/L， LOQ 在0.067～0.209 mg/L，線性范圍為0.1～50 mg/L， 回收率在87.80%～107.47%。 但由于類胡蘿卜素異構(gòu)體和/ 或類似結(jié)構(gòu)的存在， 色譜特征可能相似。 此外， 辣椒中的一些類胡蘿卜素高度酯化， 這阻礙了單獨(dú)使用HPLC進(jìn)行提取和鑒定。 因此， LC－MS/MS 是測(cè)定辣椒中類胡蘿卜素的首選方法[75]。 LC－MS/MS 整合了LC 的色譜容量以及MS 在儀器中提供的高靈敏度、準(zhǔn)確性和豐富的結(jié)構(gòu)信息， 可以對(duì)辣椒中的類胡蘿卜素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和準(zhǔn)確定量。 考慮到類胡蘿卜素通常以非常低的水平存在于辣椒基質(zhì)中， 因此使用質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器是必要的。

四、 同時(shí)檢測(cè)辣椒中多種生物活性成分的方法

隨著高分辨色譜和質(zhì)譜的發(fā)展， 辣椒中活性成分同時(shí)檢測(cè)的方法也在不斷開(kāi)發(fā)， 同時(shí)檢測(cè)可以在很大程度上減少分析時(shí)間以及所需溶劑的量， 但由于辣椒中的生物活性成分極性各不相同， 所以極少有兩種或者3 種活性成分同時(shí)檢測(cè)的情況， 目前同時(shí)檢測(cè)的方法還需進(jìn)一步完善。 ARRIZABALAGALARRANAGA 等[76]采用UPLC 與高分辨質(zhì)譜（HRMS） 相結(jié)合的方法對(duì)辣椒粉中的4 種辣椒素和6 種類胡蘿卜素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)， 大多數(shù)化合物的線性范圍在0.001～10 mg/kg，β－隱黃質(zhì)和葉黃素的線性范圍為0.1～10 mg/g， 相關(guān)系數(shù) （R2） 高于0.998； 大多數(shù)目標(biāo)化合物的LOD 范圍為0.001～0.025 mg/kg，β－隱黃質(zhì)和葉黃素的值略高 （分別為0.1、 0.25 mg/kg）， 運(yùn)行和日常精密度RSD 分別低于15%和10%， 相對(duì)誤差低于10%。 這些結(jié)果證明了所開(kāi)發(fā)的方法在測(cè)定辣椒素和類胡蘿卜素方面具有良好的儀器性能， 但是該方法沒(méi)有對(duì)辣椒素和類胡蘿卜素的回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。 MARINCAS等[18]采用HPLC 同時(shí)定量了辣椒中7 種黃酮類物質(zhì)和辣椒素的含量， 線性范圍為0.5～40 μg/mL，黃酮類物質(zhì)和辣椒素的LOD 分別為0.1 ～0.2 μg/mL 和0.05 μg/mL， LOQ 分別為0.3～0.4 μg/mL和0.1 μg/mL， 回收率為90.60%～115.05%， 方法性能良好， 但檢測(cè)的化合物相對(duì)較少且靈敏度較低。 BIJTTEBIER 等[77]使用液相色譜－光電二極管陣列－精確質(zhì)譜法 （LC－PDA－amMS） 開(kāi)發(fā)一種通用的分析方法， 鑒定和定量紅辣椒中的無(wú)機(jī)植物代謝物， 包括類胡蘿卜素、 甾醇衍生物、 糖脂、 甘油脂質(zhì)、 辣椒素和脂溶性維生素。 這種通用的分析方法可以提供辣椒中大量的代謝物信息， 但同樣的對(duì)于方法學(xué)驗(yàn)證的相關(guān)信息較少。

五、 結(jié)語(yǔ)和展望

辣椒中富含酚類化合物、 辣椒素、 類胡蘿卜素等天然活性成分， 具有抗氧化、 抗炎、 抗菌和抗癌等生物活性功能。 隨著人們對(duì)天然活性成分的逐漸認(rèn)識(shí)， 功能成分和天然藥物的市場(chǎng)也在不斷擴(kuò)大，這些天然化合物可以為產(chǎn)品提供良好的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 將其應(yīng)用于食品或醫(yī)藥產(chǎn)品可有效改善人體健康。 對(duì)這些活性成分的提取和檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化可顯著提高辣椒中生物活性成分的利用率。對(duì)于活性成分的提取， 大部分的研究仍使用傳統(tǒng)的溶劑浸提法， 但一些綠色的提取方法也在不斷開(kāi)發(fā)和完善。 對(duì)于分離和檢測(cè)技術(shù)， HPLC 和LC－MS/MS 成為檢測(cè)辣椒中活性成分的主流方法， 但到目前為止， 對(duì)于這些活性成分的定量分析以及方法優(yōu)化和開(kāi)發(fā)方面的研究較少。 對(duì)辣椒中生物活性成分功能的挖掘和應(yīng)用有待進(jìn)一步開(kāi)展， 相信在不久的將來(lái)， 辣椒中的生物活性成分也將會(huì)應(yīng)用于食品工業(yè)以及醫(yī)藥學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。