王小紅,錢 晶,翁文俊,周國(guó)雄,朱順星,祁小鳴,劉 春,程睿智

(南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院 1.消化內(nèi)科,2.普通外科,3.心胸外科,江蘇 儀征 211900;4.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,江蘇 南通226006;5.南通大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,江蘇 南通 226001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是需要緊急入院的常見消化系統(tǒng)疾病,其中約20%的病人會(huì)發(fā)展成重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP具有發(fā)病急、進(jìn)展快等特征,病死率高達(dá)30%,甚至可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征,影響預(yù)后并可并發(fā)多器官功能不全綜合征,嚴(yán)重威脅病人生活質(zhì)量和生命安全[1],明確AP的發(fā)病機(jī)制并探索治療靶點(diǎn)具有重要意義。巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)是一種廣泛存在于多種組織器官中的硫基轉(zhuǎn)移酶,可催化線粒體內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)生成,是調(diào)控H2S生成的關(guān)鍵酶,廣泛參與炎癥、細(xì)胞凋亡和血管松弛等病理生理過程[2]。H2S是一種功能相關(guān)介質(zhì),其異常產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物組織的炎癥有關(guān)[3]。我們的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MPST可通過NF-κB信號(hào)誘導(dǎo)胰腺組織自噬和炎癥反應(yīng),進(jìn)而加重大鼠SAP病情;抑制MPST對(duì)SAP大鼠具有保護(hù)作用。然而,MPST在AP中的靶向作用細(xì)胞仍不明確。本研究將小鼠胰腺腺泡細(xì)胞266-6作為研究對(duì)象,構(gòu)建AP體外細(xì)胞模型,探討MPST對(duì)AP的具體作用及可能機(jī)制,為臨床AP治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠胰腺腺泡細(xì)胞株266-6購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器

正置顯微鏡(UB203i-POL,重慶澳浦光電技術(shù)有限公司,中國(guó));凝膠電泳儀(EPS300,Tanon,中國(guó));流式細(xì)胞儀(FACSCelesta,BD,美國(guó));凝膠成像儀(5200/5200R,Tanon,中國(guó));酶標(biāo)儀(Multiskan FC,ThermoFisher,美國(guó))。

1.3 主要藥品及試劑

腸促胰酶肽(cholecystokinin,CCK)(產(chǎn)品貨號(hào)96827-04-2,上海楚肽生物科技有限公司,中國(guó));細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)(產(chǎn)品貨號(hào)KTC011001,abbkine,中國(guó));MPST一抗(產(chǎn)品批號(hào)A11587,ABclonal,中國(guó))、微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ/Ⅰ一抗(產(chǎn)品批號(hào)E-AB-61027,Elabscience,中國(guó))、beclin1一抗(產(chǎn)品批號(hào)abx125564,Abbexa,英國(guó))、自噬相關(guān)基因5 (autophagy related gene 5,ATG5)一抗(產(chǎn)品批號(hào)E-AB-60008,Elabscience,中國(guó))、β-actin一抗(產(chǎn)品批號(hào)ab6276,Abcam,美國(guó))、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗(產(chǎn)品批號(hào)ab181602,Abcam,美國(guó));小鼠淀粉酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA試劑盒(產(chǎn)品貨號(hào)EY-M98729,上海一研生物科技有限公司,中國(guó)),小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α (產(chǎn)品批號(hào)SEKM-0034)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1(產(chǎn)品批號(hào)SEKM-0002)和IL-6 (產(chǎn)品批號(hào)SEKM-0007)ELISA試劑盒(Solarbio,中國(guó));Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)CA1020,Solarbio,中國(guó));Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(產(chǎn)品貨號(hào)L3000001,Invitrogen,美國(guó));MPST干擾質(zhì)粒(siMPST)、MPST過表達(dá)質(zhì)粒(oeMPST)和陰性對(duì)照(NC)購(gòu)自于漢恒生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞株復(fù)蘇于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基5 mL,放入37 ℃ 5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每48 h觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。

1.4.2 AP細(xì)胞模型建立 將266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞傳代至6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)換液。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合率至70%～80%后,加入終濃度為10 μmol/L的CCK試劑,對(duì)照組加入等量PBS溶液,分別在0、6、12、24 h收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞或分子生物學(xué)后續(xù)研究。

1.4.3 細(xì)胞上清液淀粉酶活性水平檢測(cè) 收集0、6、12、24 h細(xì)胞上清液1 mL,采用ELISA試劑盒進(jìn)行淀粉酶活性水平檢測(cè),操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/孔傳代至6孔板中,培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁,更換為無血清培養(yǎng)基。將Lipofectamine 3000和質(zhì)粒稀釋:125 μL無血清培養(yǎng)基+5 μL Lipofectamine 3000;125 μL無血清培養(yǎng)基+2.5 μg DNA+5 μL Lipofectamine 3000溶液。將兩管混合,室溫放置20 min。將混合后的Lipofectamine 3000+質(zhì)粒試劑加入孔板中,6 h后更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)或AP造模。根據(jù)AP造模和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體類型將細(xì)胞分為4組,分別為:CON組(無AP造模+對(duì)照質(zhì)粒)、AP組(AP造模+對(duì)照質(zhì)粒)、AP+siMPST組(AP造模+MPST干擾質(zhì)粒)和AP+oeMPST組(AP造模+MPST過表達(dá)質(zhì)粒)。

1.4.5 CCK-8檢測(cè) 將266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞以5×104個(gè)/孔傳代至96孔板中,設(shè)置6個(gè)平行副孔,孵育24 h使細(xì)胞貼壁。根據(jù)上述方法進(jìn)行各組模型建立后,每孔加入10 μL CCK-8工作液,37 ℃孵育1 h,450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,記錄并繪制曲線。

1.4.6 細(xì)胞上清液炎癥因子檢測(cè) 收集各組細(xì)胞上清液1 mL,采用小鼠TNF-α、IL-1和IL-6 ELISA試劑盒進(jìn)行炎癥因子檢測(cè),操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4.7 凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞至1.5 mL EP管中,計(jì)算細(xì)胞濃度,將細(xì)胞分裝為每管1×106/mL,離心洗滌3 min×2次;將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)。各組設(shè)置流式雙熒光檢測(cè)分管:空白對(duì)照、單陽管和雙陽管。室溫孵育15 min后,使用流式細(xì)胞儀FITC和PI通道進(jìn)行雙熒光檢測(cè),即使用空白對(duì)照設(shè)置電壓,使用單陽管調(diào)節(jié)補(bǔ)償;每組檢測(cè)5 000個(gè)細(xì)胞,使用Flowjo軟件進(jìn)行流式分析。

1.4.8 Western blotting蛋白水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞,通過RIPA/PMSF法提取蛋白,BCA法蛋白定量,與上樣緩沖液混合配制蛋白樣本。15 μg樣品上樣,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后,以1∶1 000濃度的LC3 Ⅱ/Ⅰ、beclin1、ATG5、MPST、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、p-AKT、β-actin或GAPDH一抗4 ℃孵育過夜。洗膜后,以對(duì)應(yīng)1∶2 000二抗室溫孵育1 h。洗膜后,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法顯色,拍照并分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CCK處理對(duì)細(xì)胞上清液淀粉酶活性水平、細(xì)胞活力和MPST蛋白表達(dá)水平的影響

10 μmol/L CCK處理266-6細(xì)胞,細(xì)胞上清淀粉酶活性水平和MPST蛋白水平均0～12 h呈上升趨勢(shì)(P<0.01), 12 h達(dá)到高峰,24 h時(shí)回落(P<0.05和P<0.01);細(xì)胞存活率0～12 h呈下降趨勢(shì)(P<0.01),24 h時(shí)保持平穩(wěn)狀態(tài)(見圖1、表1)。結(jié)果表明AP體外細(xì)胞模型成功建立,后續(xù)AP細(xì)胞造模條件為:10 μmol/L CCK處理266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞12 h。

表1 不同時(shí)間細(xì)胞上清液淀粉酶活性水平、細(xì)胞存活率和MPST蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 調(diào)控MPST對(duì)AP體外模型細(xì)胞活力和凋亡的影響

與CON組相比,AP組、AP+siMPST組和AP+oeMPST組的細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.01),AP+siMPST組的細(xì)胞存活率高于AP組(P<0.01),而AP+oeMPST組的細(xì)胞存活率則低于AP組(P<0.01);與CON組相比,AP組、AP+siMPST組和AP+oeMPST組的細(xì)胞凋亡率均明顯上升(P<0.01),但AP+siMPST組的凋亡率明顯低于AP組(P<0.01),AP+ oeMPST組明顯高于AP組(P<0.01)(見圖2、表2)。

表2 各組細(xì)胞存活率和凋亡率的比較

2.3 調(diào)控MPST對(duì)AP體外模型細(xì)胞上清液炎癥因子表達(dá)水平的影響

AP組、AP+siMPST組和AP+oeMPST組的TNF-α、IL-1和IL-6水平均明顯高于CON組(P<0.01);AP+siMPST組TNF-α、IL-1和IL-6水平均明顯低于AP組(P<0.01),而AP+oeMPST組則明顯高于AP組(P<0.01)(見表3)。

表3 各組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1和IL-6表達(dá)水平的比較

2.4 調(diào)控MPST對(duì)AP體外模型細(xì)胞自噬相關(guān)因子水平及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

Western blotting結(jié)果顯示,AP組、AP+oeMPST組腺泡細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、beclin1、ATG5、MPST、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平均明顯高于CON組(P<0.01);AP+siMPST組上述指標(biāo)水平均明顯低于AP組(P<0.01),而AP+oeMPST組上述指標(biāo)水平則均明顯高于AP組(P<0.01)(見圖3～4、表4)。

表4 各組細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、beclin1、ATG5、MPST、p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT Western blotting蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

盡管對(duì)于AP的疾病預(yù)測(cè)、嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)、治療和預(yù)后評(píng)估在過去十年中迅速發(fā)展,但AP仍然是一種復(fù)雜的疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[4]。更重要的是,在目前臨床治療中尚無特異性的AP治療藥物。因此,明確AP的發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找AP新治療靶點(diǎn)具有重要意義。

MSPT是催化內(nèi)源性H2S生成的關(guān)鍵酶之一,可催化3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,從而形成過硫化物和H2S,可見其與硫代謝相關(guān)的重要生理功能密切相關(guān)[5]。有研究[6]顯示,H2S參與AP的炎癥反應(yīng)過程;LIU等[7]研究也顯示,H2S可通過PI3K/Akt/Sp1信號(hào)通路促進(jìn)SAP炎癥反應(yīng)的發(fā)生。然而,MSPT作為H2S代謝關(guān)鍵酶,其在AP中作用的研究仍嚴(yán)重不足。本研究成功構(gòu)建了AP體外細(xì)胞模型,結(jié)果顯示AP細(xì)胞模型的MSPT表達(dá)和相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著升高,提示MSPT可能在AP中發(fā)揮促炎作用。BRONOWICKA等[8]研究發(fā)現(xiàn),AP胰腺組織中半胱氨酸水平顯著升高可能是由于MPST催化的反應(yīng)中半胱氨酸消耗率降低所致,提示MPST相關(guān)H2S代謝與AP密切相關(guān);另一項(xiàng)研究顯示,在經(jīng)雨蛙素處理AR42J細(xì)胞的AP模型中鑒定出了包括MPST在內(nèi)的5種差異表達(dá)的蛋白升高[9],支持本研究結(jié)果。

為闡明MPST對(duì)AP的確切作用,本研究在AP體外造?；A(chǔ)上,應(yīng)用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)。結(jié)果顯示,過表達(dá)MSPT的AP細(xì)胞模型的炎癥因子、凋亡和自噬水平均較AP組顯著升高,提示MSPT水平的上調(diào)可加劇AP的病理生理學(xué)反應(yīng);反之,下調(diào)MSPT水平可顯著改善AP細(xì)胞模型炎癥因子、凋亡和自噬水平,起到治療作用,提示MSPT可能作為一種AP的新治療靶點(diǎn)。自噬和凋亡紊亂在AP發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。有研究顯示,在AP中存在損傷性的、不完全的自噬激活,誘導(dǎo)溶酶體功能缺失,酶原累積在自噬溶酶體中,導(dǎo)致胰蛋白酶活化,最終導(dǎo)致AP[10]。AP中的自噬反應(yīng)與beclin1介導(dǎo)的吞噬作用有關(guān),并涉及ATG5等復(fù)合物和LC3的泛素化偶聯(lián)系統(tǒng)控制[11]。自噬和凋亡的信號(hào)通路具有明顯的相互作用連接,如beclin1不僅可調(diào)控自噬,也作為促凋亡切割受損中的靶點(diǎn)而被廣泛研究[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)控MPST可通過改變LC3 Ⅱ/Ⅰ、beclin1和ATG5等分子表達(dá)影響266-6小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的自噬和凋亡水平。

在AP中,PI3K/AKT信號(hào)通路也發(fā)揮重要作用。XU等[13]通過PI3K/AKT的抑制劑麥芽甘素處理AP模型,發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT可有效降低AP小鼠血清淀粉酶和炎癥因子活化,改善胰腺組織學(xué)壞死程度;轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號(hào)通路與肥胖相關(guān)酒精誘導(dǎo)的AP有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)MPST可激活PI3K/AKT通路介導(dǎo)AP體外模型的自噬、凋亡和炎癥反應(yīng);反之,下調(diào)MPST可抑制PI3K/AKT通路表達(dá)。然而,MPST與PI3K/AKT通路的相關(guān)性研究較少。HU等[15]研究顯示,MPST可能通過H2S代謝調(diào)控胰腺癌的侵襲和遷移,此過程可能與PI3K/AKT通路相關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果說明MSPT可通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)調(diào)控AP體外模型細(xì)胞的凋亡與自噬反應(yīng),降低MSPT水平可能對(duì)AP具有一定的治療作用。然而,鑒于MSPT的復(fù)雜機(jī)理和與H2S可能協(xié)同作用的多樣性,本研究?jī)H部分揭示了MSPT對(duì)AP作用的潛在機(jī)制,仍需要進(jìn)一步深入研究。