歐陽(yáng)輝,陳桂秀,熊什銳,朱興春

(1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,重慶 405400;2.達(dá)州市中心醫(yī)院心內(nèi)科,四川達(dá)州 635000;3.川北醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,四川南充 637000)

高血壓不僅是心血管疾病和卒中的危險(xiǎn)因素,也是代謝綜合征的危險(xiǎn)因素之一,而代謝綜合征與肥胖和糖尿病密切相關(guān)[1]。既往研究表明,遺傳易感性和環(huán)境因素促進(jìn)高血壓的發(fā)生、發(fā)展[2]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示,高血壓與腸道菌群的改變有關(guān)[3],而口服抗生素和益生菌都可以通過(guò)改變腸道菌群從而控制血壓升高[4]。近期研究表明,高血壓患者血清脂多糖(LPS)水平升高[5]。高脂肪飲食(HFD)會(huì)增加腸道來(lái)源的LPS,進(jìn)而引發(fā)體內(nèi)胰島素抵抗和低級(jí)別炎癥[6],腸道菌群改變或促進(jìn)腸道通透性可以增加循環(huán)LPS水平?？股刂委熆梢詷O大地改變小鼠的腸道菌群,從而降低循環(huán)LPS水平,最終改善胰島素抵抗和慢性炎癥[7],而胰島素抵抗和慢性炎癥在高血壓的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[8-9]。

腸道菌群對(duì)HFD喂養(yǎng)大鼠血壓影響的潛在機(jī)制是復(fù)雜的。硫酸慶大霉素是氨基糖苷類抗生素的一種,口服硫酸慶大霉素不會(huì)經(jīng)消化道吸收入血,而是直接作用于腸道的革蘭氏陰性菌[10],而革蘭氏陰性菌占腸道菌群中所有細(xì)菌的99%以上。故本研究通過(guò)比較正常飲食(ND)、HFD、HFD聯(lián)合硫酸慶大霉素干預(yù)后血壓、血脂、血糖水平和大鼠腸道菌群的變化,以及內(nèi)毒素、炎癥因子、胰島素抵抗等指標(biāo),探討HFD對(duì)腸道菌群的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

從川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠37只[SYXK(川)2013-076]。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

將大鼠適應(yīng)性地喂食ND 1周,然后分為3組:ND組(n=11)、HFD組(n=13)和HFD聯(lián)合硫酸慶大霉素灌胃組(GS組,n=13)。第2～13周,HFD組、GS組喂食HFD,ND組接受ND。第9～13周,GS組通過(guò)灌胃額外給予硫酸慶大霉素(四川長(zhǎng)征制藥有限公司,7.2 mg/kg,每周1次),HFD組和ND組接受相同劑量的生理鹽水。ND、HFD膳食營(yíng)養(yǎng)成分的比例見表1。ND中脂肪供能10.5%,碳水化合物供能62.5%,蛋白質(zhì)供能27.0%。HFD中脂肪供能40.0%,碳水化合物供能42.5%,蛋白質(zhì)供能17.5%。

表1 ND、HFD膳食營(yíng)養(yǎng)成分(g/100 g)

1.2.2血壓測(cè)量

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的清晨,用血壓計(jì)系統(tǒng)(BP6A,四川成都泰盟科技有限公司)給大鼠尾部阻斷氣囊充氣加壓,當(dāng)阻斷器放氣減壓至脈搏波剛開始出現(xiàn)時(shí)記錄為收縮壓,繼續(xù)減壓出現(xiàn)的波峰處記錄為舒張壓,再繼續(xù)減壓隨即出現(xiàn)平均動(dòng)脈壓(或計(jì)算平均動(dòng)脈壓=1/3收縮壓+2/3舒張壓)。每只大鼠連續(xù)測(cè)定3次,取其安靜狀態(tài)下的血壓計(jì)算平均值,每周測(cè)1次。第1周測(cè)得3組大鼠血壓值作為基線水平,第5周開始下一次血壓測(cè)量,直至第13周,每周測(cè)量每只大鼠的血壓,記錄血壓水平進(jìn)行評(píng)估。

1.2.3標(biāo)本采集

在第13周結(jié)束時(shí),大鼠麻醉后頸椎脫臼,立即對(duì)其進(jìn)行右心室穿刺,采集血液標(biāo)本到肝素真空管,離心1 000×g 15 min,收集血漿于-80 ℃儲(chǔ)存。隨即解剖大鼠采集結(jié)腸部分的糞便標(biāo)本,并在液氮中冷凍,于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.4ELISA分析

ELISA用于測(cè)定血漿胰島素(CEA448Ra,武漢云克隆科技股份有限公司)、白細(xì)胞介素(IL)-1β(KGEHC002b/KGEHC002b-1,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)、IL-6[KGEHC007(HS)/KGEHC007(HS)-1,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司]和腫瘤壞死因子-α(TNF-α,KGEHC103a/KGEHC103a-1,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.5血漿LPS和生化指標(biāo)測(cè)定

按照試劑說(shuō)明書,用鱟試劑測(cè)定法(EC32545S,廈門生物科技有限公司)對(duì)血漿LPS進(jìn)行定量。自動(dòng)生化分析儀(bs-420,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)通過(guò)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMA-IR=空腹血清胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

1.2.6宏基因組分析

按照說(shuō)明書,用TIAN amp Stool DNA試劑盒(DP328)提取結(jié)腸糞便的DNA,DNA標(biāo)本在上海美吉生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行宏基因組分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 硫酸慶大霉素可改變高脂血癥引起的血壓升高

第1周,3組血壓比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第5～10周,GS組血壓高于ND組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第5～13周,HFD組血壓高于ND組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第10～13周,GS組血壓低于HFD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

a:P<0.05,GS組與ND組比較;b:P<0.05,GS組與HFD組比較;c:P<0.05,HFD組與ND組比較。

2.2 硫酸慶大霉素可改變HFD誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂

與ND組比較,HFD組TC、TG、LDL-C水平、HOMA-IR更高,HDL-C水平更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組比較,GS組TG、LDL-C水平、HOMA-IR更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 3組大鼠生化和糖脂代謝指標(biāo)比較

2.3 硫酸慶大霉素改變HFD誘導(dǎo)的腸道微生物群相關(guān)的LPS和炎癥因子水平

HFD組LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于ND組,而GS組低于HFD組(P<0.05),見圖2。

2.4 硫酸慶大霉素改變HFD喂養(yǎng)小鼠的微生物群結(jié)構(gòu)

偏最小二乘判別分析結(jié)果表明,HFD組、GS組腸道微生物群在結(jié)構(gòu)上與ND組不同,表明本研究中的分類模型在區(qū)分ND、HFD和GS組方面具有令人滿意的性能,見圖3。

紅色:ND組;藍(lán)色:HFD組;綠色:GS組;每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)標(biāo)本,點(diǎn)密度越大,標(biāo)本之間的差異就越小。

2.5 腸道微生物群落豐富度(家族水平)

家族水平結(jié)果顯示,3組腸道微生物群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,包括24個(gè)發(fā)生明顯變化的微生物群。層次分析結(jié)果顯示,HFD組f-脫硫弧菌比例高于ND組,而GS組低于HFD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

A:3組腸道菌群的家族水平分析;B:3組腸道f-脫硫弧菌的家族水平分層分析;a:P<0.05。

3 討 論

人體腸道具有復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu),是人體及其代謝過(guò)程的重要組成部分,與健康密切相關(guān)[11]。據(jù)報(bào)道,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與心血管疾病相互作用,包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、肥胖、2型糖尿病和慢性腎臟疾病[3]。超過(guò)60%的高血壓危險(xiǎn)因素與代謝紊亂有關(guān)。因此,有學(xué)者認(rèn)為腸道菌群通過(guò)影響宿主代謝和能量吸收、破壞腸道屏障和影響炎癥因子的釋放來(lái)影響血壓[12-13]。故本研究比較了ND、HFD和HFD聯(lián)合硫酸慶大霉素喂養(yǎng)的大鼠在血壓、HOMA-IR、LPS、炎癥因子和腸道菌群方面的差異,還探討了硫酸慶大霉素降低血壓的可能機(jī)制和途徑。

既往研究表明,HFD誘導(dǎo)的腸道菌群直接促進(jìn)肥胖發(fā)生、發(fā)展[14]。肥胖會(huì)刺激交感神經(jīng)系統(tǒng),增加身體對(duì)鈉和水的吸收及血管緊張素Ⅱ的形成,從而增加患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究結(jié)果表明,HFD會(huì)升高血壓,這與既往研究[15]結(jié)果一致。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)口服益生菌或口服抗生素可以通過(guò)改變腸道菌群來(lái)緩解大鼠原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展[16]。然而,腸道菌群是否通過(guò)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物或基因調(diào)節(jié)高血壓的發(fā)生和發(fā)展尚不清楚。既往研究已經(jīng)證實(shí),f-脫硫弧菌是一種革蘭氏陰性腸道厭氧細(xì)菌[17],與腸道中LPS的產(chǎn)生密切相關(guān)[18]。LPS通過(guò)腸道黏液進(jìn)入腸道,導(dǎo)致短鏈脂肪酸的分解和硫化氫的產(chǎn)生[19]。同時(shí),LPS激活Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路,增加IL-1β、IL-6、TNF-α和巨噬細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)等炎癥因子的形成和釋放。炎癥因子直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖,增加血管阻力并導(dǎo)致高血壓[20]。

本研究腸道菌群測(cè)序結(jié)果顯示,與ND組比較,HFD組f-脫硫弧菌的比例更高,而GS組則較低。此外,第5～13周,HFD組血壓高于ND組。這一結(jié)果表明,HFD喂養(yǎng)可能通過(guò)增加腸道菌群中f-脫硫弧菌的豐度來(lái)促進(jìn)炎癥,從而增加血漿LPS和作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞并升高血壓的炎癥因子水平。這些發(fā)現(xiàn)與上述既往研究結(jié)果一致。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),抗生素改變了腸道菌群,從而改善了代謝內(nèi)毒素血癥,降低了慢性炎癥引起的胰島素抵抗[21]。TLR4信號(hào)通路的激活與胰島素抵抗密切相關(guān)[22]。TNF-α結(jié)合胰島素受體并使其失活,IL-18和IL-1β等炎癥因子也可導(dǎo)致胰島素抵抗,其具體分子機(jī)制尚不清楚[23]。胰島素抵抗也被認(rèn)為會(huì)損害內(nèi)皮依賴性血管舒張,從而升高血壓[24]。因此作者推測(cè),與ND組比較,HFD組f-脫硫弧菌的富集增加了LPS的合成,破壞了腸上皮,增加了腸通透性,從而升高了IL-1β、IL-6和TNF-α水平。在HFD喂養(yǎng)的大鼠中灌胃硫酸慶大霉素降低了腸道菌群中f-脫硫弧菌的豐度,從而降低了HOMA-IR、LPS、炎癥并最終降低了血壓。

既往研究證實(shí),慶大霉素是一種針對(duì)革蘭氏陰性菌的廣譜抗菌劑[25],但對(duì)有益的厭氧菌無(wú)效,可以有效保護(hù)體內(nèi)的益生菌,且口服后被快速代謝,不會(huì)被腸道吸收。一些研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌在死亡、自溶、繁殖或黏附在其他細(xì)胞上時(shí)往往會(huì)釋放LPS,從而導(dǎo)致毒性[26]。從本研究結(jié)果推斷,HFD可能會(huì)增加革蘭氏陰性菌f-脫硫弧菌的菌群豐度,而硫酸慶大霉素可能會(huì)抑制革蘭氏陰性菌的豐度,從而釋放大量LPS。因此,GS組LPS水平高于ND組。在GS組中,盡管LPS水平未降至與ND組相同的水平,但血壓已降至與ND組幾乎相同的水平。這些結(jié)果提示,當(dāng)體內(nèi)的LPS超過(guò)一定水平時(shí),可能會(huì)增加炎癥因子水平并升高血壓,但將LPS水平控制在一定范圍內(nèi)是否對(duì)防治高血壓有益還需深入研究。

綜上所述,口服抗生素硫酸慶大霉素可改善HFD引起的糖脂代謝異常和炎癥,機(jī)制可能為通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度及LPS水平來(lái)緩解高血壓。