林爽 翟京宇 羅彬

膿毒癥心肌炎是由膿毒癥引起的心肌炎癥反應(yīng),可造成嚴(yán)重的心肌功能損傷,其特征是左心室射血分?jǐn)?shù)降低和左心室擴(kuò)張受限[1-4]。研究表明,線粒體損傷與膿毒癥心肌炎密切相關(guān)[5]。去乙酰化酶3(SIRT3)主要表達(dá)于線粒體,其調(diào)控的單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素(mTOR)信號(hào)通路不僅可改善線粒體損傷,也能修復(fù)膿毒癥中的炎癥損傷[6-7]。但在膿毒癥心肌炎中,SIRT3調(diào)控的AMPK/mTOR信號(hào)通路對線粒體損傷的調(diào)控作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)表明,腸道糞菌移植(FMT)是改善膿毒癥心肌炎的一種有效工具[8],該治療可減輕膿毒癥中的炎癥反應(yīng)和氧化損傷[9],表明其在治療膿毒癥方面具有很大的潛力。然而,腸道菌群對膿毒癥心肌炎和心肌細(xì)胞線粒體損傷的具體調(diào)控作用并不清楚。本研究探討正常腸道FMT對膿毒癥心肌炎和心肌細(xì)胞線粒體損傷的改善作用與機(jī)制。

材料與方法

1.材料:10周齡的雄性SD大鼠40只(219.5g～242.8g)購于新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SIRT3、AMPK、mTOR、磷酸化AMPK(p-AMPK)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)、IL-1β、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自于英國Abcam公司;SIRT3的抑制劑3-TYP(HY-108331)購于美國MCE公司;IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

2.方法

(1)分組及手術(shù)方式:40只SD大鼠在控溫環(huán)境(21 ℃～23 ℃)進(jìn)行飼養(yǎng),12 h光/12 h暗交替循環(huán),并自由攝取標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和自來水。將其隨機(jī)分為盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立的膿毒癥模型組(CLP組)、假手術(shù)對照組(sham組)、FMT治療組(CLP+FMT組)及FMT聯(lián)合SIRT3抑制劑(3-TYP)治療組(CLP+FMT+3-TYP組),每組各10只。所有大鼠均接受腹腔注射4%戊巴比妥(0.2 ml/kg)麻醉,CLP組大鼠在手術(shù)剖腹后,先用不可吸收的縫線在第一個(gè)盲腸上進(jìn)行結(jié)扎,再用50 ml注射器針制造兩對小孔,部分腸內(nèi)內(nèi)容物被擠出,返回腹腔,傷口閉合。sham組大鼠進(jìn)行開腹和閉腹術(shù),未行CLP。在無菌環(huán)境下收集大鼠正常糞便標(biāo)本,糞便標(biāo)本用0.9%生理鹽水均勻化(200 mg/ml),然后以2 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min后收集上清液作為正常菌群菌液。CLP+FMT組大鼠在CLP術(shù)前30 min用滅菌導(dǎo)管經(jīng)肛門插入深約5 cm后緩慢注入5 ml上述方法收集的菌液,然后將大鼠倒置3～5 min,其余步驟同CLP組,并在CLP術(shù)后1～8天,每天繼續(xù)注入菌液1次。CLP+FMT+3-TYP組同CLP+FMT組的操作并在術(shù)后立即尾靜脈注射3-TYP(30 mg/kg),且在CLP術(shù)后1～8天,每天注射1次3-TYP(30 mg/kg)。8天后收集所有大鼠新鮮血液和心肌組織,并用福爾馬林固定心肌組織,用于石蠟切片和電鏡觀察。新鮮的心肌組織保存于-80 ℃冰箱中。本實(shí)驗(yàn)所有大鼠的研究均經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

(2)HE染色:采用HE染色觀察sham組和CLP組大鼠心肌組織的病理變化,包括形態(tài)變化和炎性細(xì)胞浸潤情況。

(3)ELISA:采用ELISA法對4組大鼠血液中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平進(jìn)行檢測。

(4)Western blot:將大鼠新鮮心肌組織勻漿后取總蛋白,采用Western blot檢測IL-1β、NLRP3、SIRT3、AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR的表達(dá)水平。

(5)透射電鏡:使用HT7700日立顯微鏡對大鼠心肌組織進(jìn)行透射電鏡檢測。大鼠新鮮心肌組織剪碎經(jīng)胰酶消化后,以1 500 rpm離心5 min。用4%多聚甲醛孵育后固定于聚醋酸甲基乙烯脂-鎳網(wǎng)上。1 min后,滴加1%磷鎢酸溶液10 μl,靜置1 min,然后用濾紙將多余的液體從網(wǎng)邊緣吸去。得到的樣品在室溫空氣中干燥10 min,最后用透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)。

(6)流式細(xì)胞術(shù):用胰酶消化4組大鼠的心肌組織,以1 500 rpm離心5 min,在0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中重懸,然后用10 nmol/L熒光陽離子染料TMRM在37 ℃下培養(yǎng)30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測熒光水平,分析各組大鼠心肌細(xì)胞的線粒體膜電位變化。

結(jié) 果

1.膿毒癥心肌炎大鼠模型建立情況:與sham組比較,CLP組大鼠心肌組織出現(xiàn)顯著的炎性細(xì)胞浸潤,且心肌組織IL-1β[(11.27±2.02)比(1.00±0.03)]和NLRP3[(5.59±0.58)比(1.00±0.01)]表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),表明CLP誘導(dǎo)的膿毒癥心肌炎大鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 sham組和CLP組大鼠心肌組織(A:sham組;B:CLP組,箭頭所示為炎性細(xì)胞;HE染色,×200)

2.4組大鼠心肌組織與血液中相關(guān)指標(biāo)比較:與sham組比較,CLP組、CLP+FMT組、CLP+FMT+3-TYP組心肌組織SIRT3和p-mTOR表達(dá)水平均顯著降低,而心肌組織p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。與CLP組比較,CLP+FMT組心肌組織SIRT3和p-mTOR的表達(dá)水平均顯著增加,而心肌組織p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與CLP+FMT組比較,CLP+FMT+3-TYP組心肌組織SIRT3和p-mTOR的表達(dá)水平均顯著降低,而心肌組織中p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠心肌組織與血液中相關(guān)指標(biāo)比較

3.4組大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷情況比較:sham組、CLP組、CLP+FMT組與CLP+FMT+3-TYP組大鼠紅/綠熒光強(qiáng)度比值分別為0.24±0.04、0.07±0.01、0.19±0.03、0.10±0.02,4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.335,P=0.021)。與sham組比較,CLP組心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生腫脹、線粒體膜發(fā)生了嚴(yán)重裂解,而且線粒體膜電位的紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著下降;與CLP組比較,CLP+FMT組心肌細(xì)胞線粒體也發(fā)生了腫脹但線粒體膜是完整的,且線粒體膜電位的紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著增加;與CLP+FMT組比較,CLP+FMT+3-TYP組中心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生膨脹和線粒體膜的完整性降低,且線粒體膜電位的紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著下降(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組大鼠心肌組織線粒體損傷情況(A、E:sham組;B、F:CLP組;C、G:CLP+FMT組;D、H:CLP+FMT+3-TYP組;A、B、C、D:橫截面;E、F、G、H:縱切面;黑色箭頭:線粒體膜破裂;白色箭頭:線粒體膜少量破裂;×10 000)

討 論

本文采用CLP建立膿毒癥心肌炎大鼠模型,觀察到CLP可顯著誘導(dǎo)大鼠膿毒癥心肌炎和心肌細(xì)胞的線粒體損傷,而FMT治療對線粒體損傷和心肌炎有明顯的改善作用。此外,正常腸道菌群的治療作用依賴于SIRT3激活的AMPK/mTOR信號(hào)通路,而抑制SIRT3后導(dǎo)致AMPK/mTOR信號(hào)通路失活可減弱腸道菌群對線粒體功能和心肌炎的改善作用。因此,正常腸道菌群可通過SIRT3激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路對膿毒癥心肌炎和心肌細(xì)胞線粒體損傷均有改善作用。癥心肌炎和線粒體損傷。

已知SIRT3可通過減少氧化損傷和炎癥反應(yīng),對線粒體損傷起保護(hù)作用[10],且SIRT3通過增加AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬對膿毒癥誘導(dǎo)的腎損傷起改善作用[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后SIRT3表達(dá)降低,提示SIRT3可能在此過程中扮演重要角色。研究證實(shí),SIRT3的激活尤其是對下游信號(hào)AMPK/mTOR的激活促進(jìn)了細(xì)胞自噬[12]。本研究同樣證實(shí)上調(diào)SIRT3可顯著促進(jìn)AMPK/mTOR信號(hào)軸激活,且當(dāng)抑制SIRT3后p-mTOR水平顯著降低,表明SIRT3也可能對膿毒癥導(dǎo)致的心臟功能損傷有修復(fù)作用,這些作用伴隨著p-AMPK上調(diào)和p-mTOR下調(diào)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在膿毒癥心肌炎模型中,干預(yù)SIRT3從而調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路對炎癥和線粒體損傷改善作用的重要性。

細(xì)胞線粒體損傷由mTOR作為主要途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。在有害刺激下,維持心功能正常的關(guān)鍵因素是維持細(xì)胞能量和代謝穩(wěn)定。而mTOR信號(hào)被認(rèn)為是代謝應(yīng)激條件下細(xì)胞能量的主要調(diào)節(jié)因子,因其可通過抑制ATP消耗的合成代謝通路和激活分解代謝通路來建立ATP穩(wěn)態(tài)[14]。本研究使用腸道菌群治療模型大鼠,觀察到正常腸道FMT可明顯激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路,并顯著減少心肌組織中NLRP3和IL-1β及血液中炎癥因子水平,此外我們通過透射電鏡平臺(tái)觀察到正常腸道FMT可顯著保護(hù)線粒體膜并防止其破裂。而當(dāng)使用SIRT3特異性抑制劑后腸道菌群對線粒體的保護(hù)作用和對促炎反應(yīng)的抑制作用均顯著減弱。Zhao等[11]的研究也表明,SIRT3對線粒體具有保護(hù)作用,當(dāng)敲除SIRT3后膿毒癥明顯加重,而當(dāng)重新激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路后SIRT3的保護(hù)作用顯著恢復(fù),該研究支持了我們的結(jié)果?；诖?本實(shí)驗(yàn)表明,正常腸道FMT可改善膿毒癥心肌炎和減緩線粒體損傷,其關(guān)鍵機(jī)制是SIRT3-AMPK/mTOR通路激活。本研究存在一些局限性:首先,對動(dòng)物模型分離的心肌組織和心肌組織酶解后的細(xì)胞進(jìn)行了分析,但缺乏具體的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證;其次,樣本數(shù)量仍較少,需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行體內(nèi)外研究。

綜上所述,腸道菌群通過SIRT3激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路改善膿毒癥心肌炎和心肌細(xì)胞線粒體損傷。腸道菌群可能是極具潛力的膿毒癥心肌炎和線粒體損傷的保護(hù)策略,SIRT3-AMPK/mTOR信號(hào)軸是潛在抑制膿毒癥心肌損傷、炎癥反應(yīng)和線粒體損傷的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。