余欣耐，王斌驛，劉 镕

武漢大學(xué)泰康醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）（武漢 430071）

重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體在臨床基因治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢，如特定組織和細(xì)胞的感染偏好性、相對(duì)較低的免疫排斥反應(yīng)、基因非整合性以及持久穩(wěn)定的外源基因表達(dá)，這些使其成為臨床中最具有應(yīng)用潛力的基因遞送工具[1-6]。rAAV 載體在單基因疾病治療（如血友病、遺傳性失明和肌肉萎縮癥等）的臨床試驗(yàn)中取得了階段性的成果[7]，其臨床安全性和有效性相較于之前常用的其他類型病毒載體有顯著提高，目前已有多個(gè)基于rAAV 的基因治療藥物在國際上獲準(zhǔn)使用。rAAV 的最大優(yōu)勢在于亞型的多樣性，不同亞型在細(xì)胞類群的感染偏好上有所不同，從而可實(shí)現(xiàn)基因藥物向特定組織和細(xì)胞的靶向精準(zhǔn)遞送，研究人員也在積極探索特異化rAAV 衣殼的設(shè)計(jì)篩選以及現(xiàn)有亞型的應(yīng)用領(lǐng)域[8-10]。本研究針對(duì)rAAV1、rAAV2、rAAV2/8、rAAV6 幾種亞型對(duì)睪丸中不同細(xì)胞類型的感染特性進(jìn)行評(píng)估，以期為臨床上基于睪丸細(xì)胞基因治療男性不育的決策提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6JNifdc 小鼠（6～8 周齡，20 g±2 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司湖北分公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房中（溫度：23 ℃±2 ℃，濕度：50%±5%，12 小時(shí)照明光暗循環(huán)）。

1.2 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

HEK293T 細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中（每1 mL 培養(yǎng)基含青霉素和鏈霉素各100 U），置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 rAAV病毒包裝與提取

使用prAAV-CMV EGFP、pAAV1-RC、pAAV2-RC、pAAV2/8-RC、pAAV6-RC 和pHelper 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 后進(jìn)行克隆擴(kuò)增，無內(nèi)毒素化提取純化質(zhì)粒、并檢測濃度。

按每15 cm 皿40 μL PEI（1 mg/mL）、120 μg質(zhì)粒（prAAV-CMV EGFP、pAAV-RC 和pHelper質(zhì)粒摩爾比為1 ∶ 1 ∶ 1）和1.5 mL DMEM 培養(yǎng)基混合15 min 配制轉(zhuǎn)染試劑，加入含25 mL DMEM培養(yǎng)基和長有70%～80%密度HEK293T 細(xì)胞的15 cm 皿中，4～6 小時(shí)后更換為含血清的常規(guī)培養(yǎng)基，72 小時(shí)后分別取培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液過濾，使用100 kDa 超濾管進(jìn)行超濾濃縮，最后通過qPCR 的方法檢測病毒滴度。

1.4 病毒接種小鼠睪丸

實(shí)驗(yàn)使用6～8 周齡雄性小鼠，在小鼠單側(cè)睪丸進(jìn)行生精小管內(nèi)注射或睪丸間質(zhì)注射處理，另一側(cè)睪丸不進(jìn)行處理作為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)使用3 只鼠作重復(fù)。

戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，使用玻璃針于睪丸與附睪連接處的輸出小管向睪丸內(nèi)生精小管注射10 μL 病毒（生精小管內(nèi)注射[11]）；或使用注射針于睪丸白膜扎出小孔，用玻璃針向間質(zhì)注射5 μL 病毒（睪丸間質(zhì)內(nèi)注射[12]）；接種后縫合并正常飼養(yǎng)。

1.5 感染特性分析

接種病毒后第7 天使用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，取睪丸組織進(jìn)行冰凍切片[12]，10%山羊血清室溫封閉1 小時(shí)，一抗SOX9（Abclonal，A19710，1 ∶ 100）或CYP17A1（Proteintech，14447-1-AP，1 ∶ 100）4 ℃孵育過夜，二抗（1 ∶ 200）（CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Proteintech，SA00013-4）室溫孵育1 小時(shí)，用含DAPI 封片劑封片，最后于熒光顯微鏡（Zeiss，Axio Imager）下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在Microsoft Excel 2021 中使用線性回歸擬合方法得到病毒滴度檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其決定系數(shù)R2值。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度檢測

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行病毒滴度檢測。首先，將已知濃度為1×1010molecule/μL 的標(biāo)準(zhǔn)pAAV-CMV EGFP 溶液進(jìn)行梯度稀釋后用qPCR 測定得到的Ct 值，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），將得到的滴度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方程用于計(jì)算各收獲的rAAV 病毒液的病毒濃度，最后均使用PBS 溶液稀釋至1.0×107molecule/μL 用于病毒接種。

圖1 qPCR方法檢測病毒濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1.The standard curve for virus concentration calculation generated by using quantitative PCR method

2.2 幾種rAAV接種感染小鼠睪丸細(xì)胞的特性

分別用rAAV1、rAAV2、rAAV6、rAAV2/8 病毒進(jìn)行小鼠生精小管內(nèi)注射，注射劑量為每個(gè)睪丸接種1.0×108個(gè)病毒顆粒。在接種后第7 天用頸椎脫臼法處死小鼠，取睪丸進(jìn)行冷凍切片并免疫熒光染色檢測。利用病毒載體攜帶外源Egfp報(bào)告基因的特點(diǎn)，通過檢測EGFP 熒光信號(hào)可表征病毒載體感染的細(xì)胞并證實(shí)其成功表達(dá)了外源蛋白，同時(shí)使用SOX9 抗體標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞，可觀察評(píng)估不同rAAV 載體對(duì)睪丸不同細(xì)胞類型的感染情況。如圖2 所示，rAAV1、rAAV2、rAAV6三種亞型均可感染支持細(xì)胞（SOX9 陽性，紅色信號(hào)）和生殖細(xì)胞（靠近生精小管腔面），對(duì)生精上皮的支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的感染能力未表現(xiàn)出明顯的偏好性；在rAAV2 感染組，SOX9 陽性支持細(xì)胞中的EGFP 綠色熒光信號(hào)比其他SOX9 陰性細(xì)胞更強(qiáng)，提示rAAV2 對(duì)支持細(xì)胞的感染能力相較于對(duì)生殖細(xì)胞更強(qiáng)，具有一定偏好性；在rAAV2/8 的感染組，EGFP 陽性信號(hào)與SOX9 陽性信號(hào)共定位，SOX9 陰性的細(xì)胞也呈現(xiàn)EGFP 陰性，說明rAAV2/8 經(jīng)生精小管注射可特異性感染支持細(xì)胞，而不感染生殖細(xì)胞。

圖2 幾種重組AAV病毒載體對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞的感染特性Figure 2.The infection characteristics of several rAAV subtypes on mouse testicular cells

2.3 rAAV2/8經(jīng)不同接種方式接種睪丸的感染特性

鑒于rAAV2/8 在經(jīng)生精小管接種感染時(shí)呈現(xiàn)出特異性感染支持細(xì)胞，本研究進(jìn)一步將rAAV2/8 分別經(jīng)生精小管和睪丸間質(zhì)注射接種，接種病毒后第7 天處死小鼠取其睪丸進(jìn)行冷凍切片和免疫熒光染色以觀察rAAV2/8感染睪丸細(xì)胞的特性。使用CYP17A1 抗體標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，與經(jīng)生精小管接種的感染結(jié)果不同，在經(jīng)睪丸間質(zhì)注射接種組，EGFP 陽性信號(hào)與間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記CYP17A1 陽性信號(hào)共定位，而生精小管內(nèi)為陰性，見圖3，說明rAAV2/8 不能穿越血睪屏障，當(dāng)經(jīng)生精小管內(nèi)接種感染時(shí)特異性感染支持細(xì)胞，當(dāng)經(jīng)睪丸間質(zhì)接種感染時(shí)特異性感染間質(zhì)細(xì)胞。

圖3 rAAV2/8病毒不同接種方式對(duì)睪丸細(xì)胞的感染特性Figure 3.The infection characteristics of rAAV2/8 virus with different inoculation methods on testicular cells

3 討論

男性不育是目前亟待解決的一項(xiàng)重大健康問題，而遺傳缺陷是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一[13]。近年來基因治療技術(shù)的快速發(fā)展，給男性不育患者帶來了一線曙光。目前主要應(yīng)用于臨床治療的基因遞送病毒載體有兩種，即慢病毒和腺病毒載體，但其在臨床應(yīng)用方面均存在不足[14]。腺病毒會(huì)引起炎癥反應(yīng)，且其攜帶目的基因的表達(dá)能力逐漸喪失[15]；慢病毒遞送載體具有整合性，會(huì)將目的基因整合入宿主細(xì)胞的基因組[16]，因此，在男性不育的治療過程中由于基因組可遺傳而引起安全和倫理問題。

rAAV治療手段是目前興起的基因治療方式，具有廣泛的治療優(yōu)勢和應(yīng)用前景，在部分醫(yī)療領(lǐng)域臨床試驗(yàn)中已經(jīng)取得了一些成果[17]。例如，rAAV 治療為癌癥治療開辟了新途徑，盡管其在癌癥治療方面的應(yīng)用仍處于早期階段，但研究人員已開始探索利用rAAV 載體遞送抗癌基因、免疫調(diào)節(jié)基因等治療癌癥的可行性[18]，這為癌癥患者帶來了新的希望。在不孕不育疾病的治療嘗試方面，已有學(xué)者在小鼠上通過AAV 回補(bǔ)基因，恢復(fù)了不孕小鼠的生育能力，并成功產(chǎn)生后代[19]。Watanabe 等評(píng)估了AAV1/9 在生精小管中的感染偏好性，發(fā)現(xiàn)AAV1/9 具有穿越血睪屏障并感染多種細(xì)胞類型的能力，但卻無法滿足臨床治療對(duì)于精準(zhǔn)遞送的要求，即只感染某種特定細(xì)胞類型[20]。在另一項(xiàng)研究中，Xia 等使用AAV8 作為遞送載體對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰竭的Lhcgr 缺陷小鼠進(jìn)行了基因治療，使小鼠成功產(chǎn)生了可育后代，展現(xiàn)出AAV 進(jìn)行基因回補(bǔ)治療生殖障礙疾病的可行性[12]。

為系統(tǒng)檢測其他幾種AAV 亞型對(duì)睪丸細(xì)胞的感染特性，本研究利用可獲得的幾種rAAV 亞型檢測發(fā)現(xiàn)，rAAV1、rAAV6 在經(jīng)生精小管注射感染時(shí)未表現(xiàn)出明顯的感染細(xì)胞類型偏好性，生精小管內(nèi)大部分細(xì)胞均可被感染并表達(dá)外源EGFP 綠色熒光蛋白，這與Watanabe 等[20]報(bào)道的rAAV1存在穿透血睪屏障的感染能力不一致。本研究發(fā)現(xiàn)rAAV1 經(jīng)生精小管接種并不能穿透血睪屏障感染間質(zhì)細(xì)胞；此外，rAAV2 雖然可同時(shí)感染生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞，但是對(duì)支持細(xì)胞的感染能力更強(qiáng)；而新增檢測的rAAV2/8 則表現(xiàn)出明顯的感染支持細(xì)胞偏好性。本研究進(jìn)一步利用經(jīng)生精小管和經(jīng)睪丸間質(zhì)注射兩種感染方式研究了rAAV2/8 亞型在睪丸中的感染特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)生精小管注射感染時(shí)，rAAV2/8 僅特異性地侵染支持細(xì)胞，幾乎不感染精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精子等生殖細(xì)胞；而在經(jīng)間質(zhì)感染時(shí)，rAAV2/8 偏好性地感染間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底細(xì)胞等其他細(xì)胞感染能力弱。以上說明rAAV2/8 無法穿越血睪屏障，可精準(zhǔn)靶向支持細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞遞送目的基因，這使得rAAV2/8 載體有望作為靶向睪丸支持細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞的基因修復(fù)治療或基因編輯的工具，為男性不育等生殖系統(tǒng)疾病的治療提供參考工具。

本研究檢測出幾種rAAV 亞型對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞的感染特性，但由于小鼠和高等動(dòng)物（包括人）之間存在差異，本研究結(jié)論可能無法直接推及到人，未來有待進(jìn)一步在靈長類動(dòng)物乃至人的睪丸組織中測試。