楊艾，魯衛(wèi)東

外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包裹，與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的多囊體小腔內(nèi)，直徑為 30 ～ 100 nm[1]、密度為 1.13 ～ 1.21 g/ml[2]的囊泡。外泌體通過(guò)在體內(nèi)游走，與受體細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞交流、調(diào)控近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞微環(huán)境等作用，內(nèi)含 mRNA、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[3]。外泌體來(lái)源廣泛，主要從體內(nèi)（血液、唾液等體液）和體外（細(xì)胞培養(yǎng)）分離提取[4]。但外泌體具有內(nèi)在的異質(zhì)性，到目前為止，在內(nèi)容和大小方面還不可能產(chǎn)生完全同質(zhì)的外泌體群體[5]，這給外泌體的提取帶來(lái)了巨大困難。

目前的大多數(shù)分離技術(shù)無(wú)法將外泌體與具有相似生物物理特性的脂蛋白和非內(nèi)泌體途徑衍生的細(xì)胞外囊泡完全分離，導(dǎo)致外泌體純度低。因此，如何有效地收集外泌體是當(dāng)下一個(gè)主要問(wèn)題，這對(duì)外泌體的下游分析至關(guān)重要。對(duì)于不同的目的和應(yīng)用，可選擇不同的分離方法，現(xiàn)階段主要采用超高速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法等方法分離提取外泌體[6]。超高速離心法是目前應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)，也是外泌體提取和分離的金標(biāo)準(zhǔn)。Johnstone等[7]首次應(yīng)用該方法分離網(wǎng)織紅細(xì)胞組織培養(yǎng)基中的外泌體，Théry 等[8]進(jìn)行了優(yōu)化，但由于耗時(shí)、成本高，容易對(duì)外泌體的結(jié)構(gòu)造成損傷，外泌體易聚集成塊，不利于下游分析[9]，并且超高速離心法獲得的沉淀中除含有外泌體外，還混有其他蛋白質(zhì)和囊泡[10]。密度梯度離心法通常與超速離心結(jié)合使用以提高外泌體的純度，主要有兩種方法，其中一種是使用蔗糖作為培養(yǎng)基，在研究中廣泛使用，但蔗糖溶液的高黏度會(huì)降低外泌體的沉積速率，導(dǎo)致分離時(shí)間更長(zhǎng)[11]。聚合物沉淀的方法通常使用聚乙二醇（PEG）作為介質(zhì)，PEG是通過(guò)將環(huán)氧乙烷與水或乙二醇添加而形成的，通過(guò)降低外泌體的溶解度，在離心條件下獲得外泌體。聚合物沉淀法相對(duì)容易操作，分析時(shí)間短，適用于處理大劑量樣品。然而，利用此方法獲取的外泌體純度和回收率相對(duì)較低，并且產(chǎn)生的聚合物很難去除，不利于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)分析[6]。超濾方法通常使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超濾膜來(lái)選擇性地分離樣品。然而，外泌體和超濾膜存在非特異性結(jié)合的問(wèn)題，從而降低了回收率[12]。這些方法缺乏特異性，使得外泌體的分離和純化并不理想。

外泌體缺乏安全穩(wěn)定的來(lái)源也是產(chǎn)量低下的一個(gè)主要原因。外泌體主要是從體外的細(xì)胞培養(yǎng)基（如腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、免疫細(xì)胞培養(yǎng)基、干細(xì)胞培養(yǎng)基）中分離得到的。體外細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體含量非常有限，不利于規(guī)模化生產(chǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。不同來(lái)源的外泌體有著不同的組成，即使是同一來(lái)源的外泌體對(duì)于受體細(xì)胞也會(huì)有多重功能，在臨床上不能普適或可控[13]。這些因素直接或間接地導(dǎo)致了外泌體得率較低，因此亟需提高外泌體的產(chǎn)量來(lái)解決以上問(wèn)題。本文對(duì)外泌體的形成分泌過(guò)程以及在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)條件改進(jìn)等方面進(jìn)行綜述。

1 外泌體形成過(guò)程

外泌體形成的具體過(guò)程分為 3 個(gè)階段：第一階段形成早期內(nèi)吞體，之后成熟形成晚期內(nèi)吞體，晚期內(nèi)吞體向內(nèi)出芽形成管腔囊泡（ILVs）；第二階段 ILVs 發(fā)育成熟進(jìn)一步形成多囊泡（MVBs）；第三階段，大部分 MVBs 被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解，僅有小部分 MVBs 與質(zhì)膜融合后以胞吐的形式將外泌體釋放到胞外[14-16]。

從分泌機(jī)制可知外泌體的生物發(fā)生關(guān)鍵步驟在第三階段，近年來(lái)對(duì)外泌體分泌至胞外的過(guò)程，無(wú)論是 MVBs 與質(zhì)膜融合，還是 MVBs 被溶酶體降解的研究，也逐漸增多。

1.1 ILVs 形成階段

外泌體生物發(fā)生的核心成分涉及轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物所需的內(nèi)體運(yùn)輸分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），ESCRT 是一種蛋白復(fù)合物，主要作用是分選特異的組分進(jìn)入 ILVs 形成外泌體的前體，ESCRT包含了四種復(fù)合體及輔助蛋白（VPS4、VTA1、ALIX 等），也有報(bào)道稱外泌體的生物發(fā)生涉及 ESCRT 非依賴性途徑，ESCRT 非依賴性途徑通過(guò)脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺等的作用輔助生成 ILVs[17]。外泌體內(nèi)含物的成分主要為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，蛋白質(zhì)組成部分包括與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合的相關(guān)蛋白如Rab 家族，Rab 蛋白是類 Ras 的小 GTP 酶（GTPase）超家族中最大的分支，它們?cè)?GTP- 和 GDP-結(jié)合狀態(tài)之間交替，由鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）和 GTPase 激活蛋白（GAPs）促進(jìn)，能調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，比如囊泡的出芽、囊泡和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、囊泡銜接的不同階段，從而促進(jìn)膜的融合。

Rab5:Q79L 是 Rab5 蛋白的突變體，Barbieri 等[18]報(bào)道 Rab5:Q79L 僅促進(jìn)早期內(nèi)吞體之間的融合。且 Wegner等[19]研究表明 Rab5:Q79L 的過(guò)度表達(dá)不利于早期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)并導(dǎo)致晚期內(nèi)吞體擴(kuò)大。同時(shí)根據(jù) Kooijman 等[20]所研究的磷脂酶 D（PLD）將磷脂酰膽堿代謝為磷脂酸（PA），由于酰基鏈附近有一個(gè)非常小的帶負(fù)電荷的頭部基因，在膜的內(nèi)部小葉中產(chǎn)生的 PA 可能會(huì)誘導(dǎo)負(fù)膜曲率，這可能有利于內(nèi)腔內(nèi)出芽，以及神經(jīng)酰胺的錐形結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)膜雙層自發(fā)負(fù)彎曲，促進(jìn)膜內(nèi)陷[21]，局部脂質(zhì)成分可重組為專門的內(nèi)胚體區(qū)域，誘導(dǎo)膜彎曲并促使 ILVs 形成，該學(xué)者發(fā)現(xiàn)PA 探針富集在 Rab5:Q79L 早期內(nèi)吞體的限制膜上，可以進(jìn)行內(nèi)體出芽并產(chǎn)生巨大的 MVBs。

Stenmark 等[22]還發(fā)現(xiàn) Rab5:Q79L 的過(guò)度表達(dá)嚴(yán)重減少了合胞體蛋白（syndecan）、溶酶體相關(guān)膜蛋白 3（CD63）、突觸融合蛋白（syntenin）和凋亡誘導(dǎo)因子 6 相互作用蛋白（ALIX）的外泌體釋放。與 CD63 一樣，ALIX 和 syntenin是外泌體內(nèi)最常見的蛋白質(zhì)。

Baietti 等[23]進(jìn)一步研究了 syntenin-ALIX 是否支持晚期內(nèi)吞體膜上的出芽過(guò)程。共聚焦顯微鏡顯示用 mCherry（紅色熒光蛋白）熒光標(biāo)記的 syntenin 和 syndecan 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（ICD）廣泛共定位，包括它們與 ALIX 一起“聚集在”用 cerulean（cer）修飾 Rab5:Q79L 的內(nèi)吞體中。充滿 McHery-syntenin（指示 ILVs）的內(nèi)吞體中也充滿 CD63。相反，在沒(méi)有伴隨的 McHery-syntenin 表達(dá)的情況下，CD63主要局限于內(nèi)吞體的限制膜。這些結(jié)果表明，syntenin 通過(guò)LYPX(n)L 基序直接與 ALIX 相互作用，類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白，并支持內(nèi)吞體膜的腔內(nèi)出芽。該研究還表明syntenin 的缺失也顯著降低了晚期內(nèi)吞體的平均大小。這些較小的晚期內(nèi)吞體意味著 syntenin 可能使 ILVs 難以形成或維持，對(duì)晚期內(nèi)吞體的成熟及與膜融合也有影響。

乙酰肝素酶是一種葡萄糖醛酸酯酶，在血管形成、炎癥、組織發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中均起著重要作用。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶以濃度依賴性的方式刺激 syntenin-1、syndecan 和某些其他外泌體標(biāo)志蛋白（如CD63）的分泌，而外泌體 CD9、CD81 和脂筏標(biāo)記蛋白（flotillin-1）不受影響。相反，內(nèi)源性乙酰肝素酶含量的降低減少了含syntenin-1 的外泌體的分泌。這說(shuō)明乙酰肝素酶起到了激活syndecan-syntenin-ALIX 外泌體途徑的作用[24]。

ADP-核糖基化因子（ARF）是一類在真核細(xì)胞中廣泛存在的高豐度 N-豆蔻?；膯误w GTP 結(jié)合蛋白，可激活A(yù)DP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶。Ghossoub 等[25]表明小 GTPase ADP核糖基化因子 6（ARF6）缺失并沒(méi)有阻斷早期或循環(huán)內(nèi)吞體中 CD63 的轉(zhuǎn)運(yùn)，而是阻斷晚期內(nèi)吞體隔間中的 CD63。在 ARF6 缺失的細(xì)胞中 MVBs 形態(tài)明顯改變，這表明ARF6 在 MVBs 的限制膜上起作用。

1.2 MVBs 與質(zhì)膜融合階段

ILVs 發(fā)育成熟為 MVBs 后，MVBs 與質(zhì)膜融合后向胞外分泌外泌體主要依賴 Rab 家族和 SNARE 家族的協(xié)助作用。

1.2.1 Rab 家族 Rab 家族包括 Rab11、Rab35、Rab27A/B、Rab9 等，其中 Rab27 最具特征[26]。Rab27a 基因可通過(guò)其編碼的蛋白參與 T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及造血細(xì)胞等的顆粒分運(yùn)輸及胞吐作用。已有研究表明在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 中轉(zhuǎn)染 Rab27a 過(guò)表達(dá)載體，初步建立的 Rab27a過(guò)表達(dá)細(xì)胞系所分離出的外泌體，與對(duì)照組相比，典型的外泌體蛋白標(biāo)記物被鑒定為高表達(dá)，即表明外泌體的分泌量增加。EPI64 作為 Rab27a 的 GTP 結(jié)合酶激活蛋白，在正常肺癌細(xì)胞 A549 中過(guò)表達(dá) EPI64 會(huì)使外泌體分泌增加，但先在細(xì)胞 A549 沉默 Rab27a 后，再過(guò)表達(dá)的 EPI64 不能使外泌體增加，這說(shuō)明 EPI64 參與了 Rab27a 介導(dǎo)的外泌體分泌[27]。在黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10 和 SK-Mel-28 中有效地降低 Rab27a 的表達(dá)，導(dǎo)致外泌體分泌減少了 50%[28]，以及在乳腺癌 4T1 和 TS/A 細(xì)胞中抑制 Rab27a 的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致外泌體分泌減少[29]。Ostrowski 等[30]通過(guò)人 HeLa 細(xì)胞系分析 Rab 蛋白在外泌體分泌中的作用，發(fā)現(xiàn) Rab27a或 Rab27b 功能的喪失導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的外泌體數(shù)量減少，但既不改變其蛋白含量，也不改變其形態(tài)，并且 Rab27a 和 Rab27b 的沉默減少了 MVBs 與質(zhì)膜的融合。

Rab35 作為 Rab GTPase 家族成員之一，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)部囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程。Frühbeis 等[31]在原代少突膠質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)小 GTPase Rab35 進(jìn)行了小干擾 RNA（siRNA）沉默，發(fā)現(xiàn)外泌體分泌量減少，該研究還通過(guò)納米顆粒跟蹤分析顯示，谷氨酸刺激的細(xì)胞釋放出更多平均大小為 95 nm 的顆粒，反映了谷氨酸能夠刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體。Hsu 等[32]在中性粒細(xì)胞中，通過(guò)兩輪 siRNA核連接敲除 Rab35 可以明顯減少細(xì)胞裂解液中的 Rab35，并導(dǎo)致外泌體膜部分蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP）恢復(fù)顯著降低，說(shuō)明外泌體的分泌量顯著減少。

1.2.2 SNARE 家族 可溶性 NSF 附著蛋白受體（soluble NSF-attachment protein receptor，SNARE）家族是外泌體分泌中另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子，是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體。SNARE 蛋白為 Ral-1 的靶蛋白，Ral 是低分子量GTP-結(jié)合蛋白超家族的一員，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，有研究發(fā)現(xiàn) Ral GTPases 參與了外泌體的分泌，該研究表明外泌體由表皮 Hyp 細(xì)胞分泌，并有助于形成一種特殊的表皮結(jié)構(gòu)，即 alae，而 GTPase Ral-1 的缺失會(huì)導(dǎo)致 alae 缺陷，當(dāng) Ral-1 變得有限時(shí)，MVBs 和頂端質(zhì)膜的融合受到阻礙，以致外泌體分泌減少。并且該研究還表明突觸融合蛋白-5（SYX-5）參與 MVBs 膜和 Ral-1 下游的質(zhì)膜之間的融合，Ral-1 的活性形式可以在頂端質(zhì)膜水平激活或募集SYX-5，以促進(jìn) MVBs 融合。在缺乏 SYX-5 的情況下，MVBs 外膜不能再與質(zhì)膜融合[33]。囊泡相關(guān)的膜蛋白 7（VAMP7）是一種 v-SNARE 蛋白，作為 SNARE 家族的一員，在 K562 細(xì)胞中，VAMP7 是包含乙酰膽堿酯酶的外泌體分泌至胞外過(guò)程的必需組分。在 MDCK 細(xì)胞中抑制VAMP7 的表達(dá)，可阻止分泌型溶酶體的釋放，并抑制外泌體分泌至胞外[34-35]。

1.3 MVBs 被溶酶體降解階段

盡管 MVBs 形成后會(huì)分為兩個(gè)階段，但多數(shù)的 MVBs會(huì)與溶酶體融合被降解，這是導(dǎo)致外泌體產(chǎn)量低下的關(guān)鍵原因，因此阻斷或減少溶酶體降解 MVBs，增加 MVBs 與質(zhì)膜的融合率使其更多地向胞外釋放外泌體，成為提高外泌體產(chǎn)量的有效途徑。

沉默調(diào)節(jié)蛋白 1（SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的脫乙酰化酶，在細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激等方面作用顯著。Latifkar 等[36]發(fā)現(xiàn)敲除 SIRT1 導(dǎo)致外泌體數(shù)量增加了 3 倍以上。SIRT1 的缺失增加了乳腺癌細(xì)胞中 MVBs的大小，這是由于溶酶體功能失調(diào)造成，SIRT1 缺失使質(zhì)子泵功能不良，溶酶體無(wú)法維持降解內(nèi)容物時(shí)的低 pH 值，因此溶酶體中降解的 MVBs 會(huì)與質(zhì)膜融合向細(xì)胞外釋放外泌體。該研究表明浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞中 SIRT1 的缺失限制了溶酶體酸化并使 MVBs 重新導(dǎo)向與細(xì)胞表面融合，從而增加了外泌體的分泌。

Ca2+也與溶酶體降解有關(guān)，溶酶體胞外分泌受突出結(jié)合蛋白 VII（synaptotagmin VII）調(diào)控，它是位于溶酶體上的Ca2+結(jié)合蛋白 synaptotagmin 家族的成員。Synaptotagmins在其胞質(zhì)區(qū)域包含兩個(gè) Ca2+域，它們可以結(jié)合磷脂響應(yīng)Ca2+，是 SNARE 復(fù)合物的組成部分。有多項(xiàng)研究表明胞質(zhì) Ca2+水平的升高會(huì)刺激外泌體分泌，Ca2+調(diào)節(jié)的溶酶體胞吐是一個(gè)普遍存在的過(guò)程[37-39]。IP3（三磷酸肌醇）作為參與 G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，可以促使胞庫(kù)釋放 Ca2+，增加胞質(zhì) Ca2+的濃度，Ca2+通過(guò) IP3敏感的 Ca2+通道部分促進(jìn) MVBs 的產(chǎn)生[40]。莫能菌素（MON）是一種膜滲透性鈉離子載體，作用于酸性的胞內(nèi)細(xì)胞器，如內(nèi)核體和溶酶體。MON 能誘導(dǎo) Ca2+的產(chǎn)生。鈣依賴機(jī)制參與了 MON 刺激外泌體釋放，因其通過(guò)改變囊泡膜上的質(zhì)子梯度作用于酸性室，導(dǎo)致 Ca2+向胞質(zhì)內(nèi)移動(dòng)，故 MON 不僅促使大量 MVBs 的產(chǎn)生，而且還增加了外泌體的分泌。氯喹作為常用的抗瘧疾藥也能增加外泌體的分泌，其增加外泌體分泌有兩個(gè)原因，一是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，刺激外泌體的釋放[41]；二是氯喹具有弱堿性，通過(guò)中和溶酶體 pH 可阻斷溶酶體降解[42]。Xu 等[43]將氯喹與乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、SUM159PT 共孵育 40 ～48 h，收集外泌體進(jìn)行 Western blot 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氯喹具有刺激外泌體分泌的作用。巴弗洛霉素 A 也是可以改變液泡腔室 pH 值的藥物，Alvarez-Erviti 等[44]表明用巴弗洛霉素 A或 V1Vo-ATPase（膜蛋白復(fù)合物）抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，外泌體的釋放水平提高，該研究表明 MVBs 是進(jìn)入溶酶體降解途徑還是發(fā)生質(zhì)膜融合是由囊泡內(nèi)的 pH 環(huán)境決定的。

除了以上關(guān)于外泌體分泌的生物發(fā)展三階段，與外泌體結(jié)構(gòu)相似的脂質(zhì)體，同樣也可促進(jìn)外泌體的分泌。Emam等[45]受 Elsabahy 和 Wooley[46]報(bào)道的納米材料可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的啟發(fā)，結(jié)合脂質(zhì)體作為納米材料，以一種物理化學(xué)依賴的方式與細(xì)胞表面相互作用，從而刺激細(xì)胞產(chǎn)生外泌體。研究顯示脂質(zhì)體與細(xì)胞共培養(yǎng)可提高外泌體產(chǎn)量。該研究采用薄膜水合法制備了多種脂質(zhì)體，并將不同濃度的脂質(zhì)體制劑與 4 種癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，所有被試癌細(xì)胞系均能以依賴于細(xì)胞類型和時(shí)間的方式分泌外泌體，共培養(yǎng) 48 h 后，B16BL6 癌細(xì)胞株表現(xiàn)出最高的外泌體產(chǎn)量。隨著中性或陽(yáng)離子修飾的空白脂質(zhì)體（NL 或 CL）磷脂濃度的增加，所有細(xì)胞株的外泌體分泌量均增加。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，陽(yáng)離子修飾的空白脂質(zhì)體（CL1）比中性空白脂質(zhì)體（NL）表現(xiàn)出更強(qiáng)的外泌體分泌刺激活性，而中性空白脂質(zhì)體的聚乙二醇化會(huì)抑制外泌體的分泌。表明外泌體分泌受脂質(zhì)體的刺激/抑制作用取決于其劑量、表面電荷、膜流動(dòng)性和 PEG 修飾，以及癌細(xì)胞的類型和活力。雖然該研究對(duì)脂質(zhì)體刺激外泌體分泌的潛在機(jī)制尚不明確，但可能也與細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平的變化或引起細(xì)胞膜去極化有關(guān)。Ca2+對(duì)外泌體的影響并不是單方面，往往也是結(jié)合 Rab 家族及 SNARE 家族共同起到作用。

2 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程

外泌體主要從細(xì)胞培養(yǎng)基中提取得到，所以培養(yǎng)基條件以及對(duì)細(xì)胞的預(yù)處理與外泌體產(chǎn)量也有直接關(guān)聯(lián)。

2.1 細(xì)胞接種密度

外泌體由活體細(xì)胞分泌得到，當(dāng)活細(xì)胞數(shù)量越多時(shí)，分泌的外泌體也越多，但 Patel 等[47]研究表明外泌體的產(chǎn)生取決于細(xì)胞接種密度，而不是細(xì)胞傳代。高密度接種細(xì)胞容易出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，而通過(guò)以低密度接種干細(xì)胞且僅使用低傳代，并且提高收集頻次可以提高總產(chǎn)量。

2.2 三維培養(yǎng)

MSCs 的三維培養(yǎng)主要通過(guò)細(xì)胞間聚集或細(xì)胞與生物材料間的黏附實(shí)現(xiàn)。Kim 等[48]采用懸滴法（3D-HD）和聚甲基丙烯酸 2-羥基乙酯（poly-HEMA）涂層法（3D-PH），將 3D 球體中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）產(chǎn)生外泌體的效率與不同條件下單層培養(yǎng)的效率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示以上所述的兩種 3D 培養(yǎng)類型，MSCs 產(chǎn)生的外泌體明顯多于在傳統(tǒng)單層培養(yǎng)（2D）中獲得的外泌體。研究者認(rèn)為這種現(xiàn)象是由細(xì)胞變?yōu)榉丘じ降膱A形形態(tài)引起的。且該研究同樣表明無(wú)論是 3D 培養(yǎng)還是 2D 培養(yǎng)，當(dāng)增加細(xì)胞培養(yǎng)密度時(shí)，外泌體產(chǎn)量會(huì)減少。

2.3 缺氧和缺血

缺氧是指將細(xì)胞培養(yǎng)在 1% ～ 5% O2的微環(huán)境中。King等[49]發(fā)現(xiàn)暴露在缺氧（1% O2）條件下，乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體比正常對(duì)照組高 1.41 倍。而暴露在 0.1% 的 O2條件下的乳腺癌細(xì)胞，與正常組相比，要高出 2 倍。研究者認(rèn)為乳腺癌細(xì)胞外泌體的分泌量與缺氧程度成正比。

缺血預(yù)處理是指在短時(shí)間內(nèi)剝奪特定器官或組織的血液供應(yīng)，然后再進(jìn)行一段時(shí)間的再灌注恢復(fù)過(guò)程，通過(guò)內(nèi)源性保護(hù)途徑減輕再灌注對(duì)缺血組織的損傷。Davidson 等[50]表明缺血預(yù)處理后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和離體灌注大鼠心臟的外泌體分泌量均較正常對(duì)照組高出約 3 倍，通過(guò) NTA觀察到外泌體的大小并未有明顯變化。

3 展望

外泌體從最初被認(rèn)為是細(xì)胞產(chǎn)生的“廢物”到隨著廣泛的深入研究，其各種生物功能正在不斷地被探索挖掘。目前外泌體在多種器官及組織損傷修復(fù)中有巨大潛力，在皮膚再生抗衰老、腫瘤治療、藥物載體等多方面，外泌體都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，展現(xiàn)出良好的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。雖然目前外泌體領(lǐng)域發(fā)展迅速，但仍存在著許多障礙：①現(xiàn)有分離方法大多數(shù)都不規(guī)范，更像是對(duì)所分離的體系進(jìn)行濃縮，且操作方法均耗時(shí)耗力，不可擴(kuò)展；②外泌體的形成及分泌至胞外的機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論，這對(duì)于想要精準(zhǔn)定位于外泌體分泌作用靶點(diǎn)存在一定的阻礙；③細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中外泌體產(chǎn)量有限，最佳的接種密度和培養(yǎng)基條件仍需不斷探索，這些都是推動(dòng)外泌體廣泛應(yīng)用的挑戰(zhàn)。若想要增加外泌體的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，提高產(chǎn)量是至關(guān)重要的一步，產(chǎn)量的高效增加將會(huì)支持外泌體相關(guān)分析及其作為藥物載體應(yīng)用的基礎(chǔ)研究的擴(kuò)展。隨著研究人員對(duì)外泌體得率的探索，提高外泌體產(chǎn)量的方法一定會(huì)不斷地被開發(fā)，進(jìn)而推進(jìn)外泌體的臨床應(yīng)用。