劉琳，趙藤，高俊哲，李俊眾，2，孫雪，2，宗劍飛，劉逸寒，2，李玉，2*，李慶剛，2*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457；2.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室/天津市工業(yè)微生物重點實驗室/工業(yè)酶國家工程實驗室,天津 300457；3.山東合成遠(yuǎn)景生物科技有限公司,山東濰坊 262500）

母乳富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分,是新生兒最主要的營養(yǎng)和能量來源。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國兒童基金會建議,母乳喂養(yǎng)可持續(xù)至嬰兒兩歲或更長,這對于新生兒的健康保護意義重大[1]。人乳寡糖,即母乳低聚糖（human milk oligosaccharides,HMOs）,是母乳中含有的一類碳水化合物,在母乳固體營養(yǎng)物中的含量位于第三,僅次于乳糖和脂質(zhì)。HMOs 具有重要的營養(yǎng)價值,可以通過防止病原體在腸道內(nèi)的黏附、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方式來改善新生兒的健康[2]。HMOs 的種類豐富多樣,包括2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose,2′-FL）、乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose,LNnT）、3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose,3-FL）、6′-唾液酸乳糖（6′-sialyllactose,6′-SL）和3′-唾液酸乳糖（3′-Lactose sialic acid,3′-SL）等,其中,分泌型母乳中含量最高的為2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose,2′-FL）,其在HMOs 總量中占比可達(dá)30%[3]。

2′-FL 是由一分子巖藻糖與一分子乳糖通過α-1,2 糖苷鍵連接而成,結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 2′-FL 結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of 2′-FL

2′-FL 可作為益生元,促進雙歧桿菌、擬桿菌等益生菌生長,同時有效抑制病原體與腸道黏膜的結(jié)合與定殖,提高嬰兒免疫力[4]。2′-FL 對人體的作用主要包括調(diào)節(jié)腸道菌群生態(tài)、阻斷病原體黏附靶細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和促進大腦發(fā)育等。

1 2′-巖藻糖基乳糖的功能及其作用機制

巖藻糖基乳糖的功能及其作用機制如圖2 所示。

圖2 2′-巖藻糖基乳糖的功能及其作用機制Fig.2 The function and mechanism of 2′-fucosyllactose

1.1 調(diào)節(jié)腸道菌群生態(tài)

益生元是通過選擇性地刺激一種或幾種細(xì)菌的生長或活性,從而產(chǎn)生對寄主有益影響的成分,2′-FL 符合作為益生元的前提條件。采用全自動細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)監(jiān)測細(xì)菌生長情況,發(fā)現(xiàn)2′-FL 是具有高度選擇性的碳源,可以作為腸道益生菌菌群的唯一碳源促進其生長,而不被潛在致病菌吸收利用[5],從而有利于嬰兒腸道菌群的進化（圖2a）。

雙歧桿菌是一種腸道益生菌,Lewis 等[6]測定了母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便菌群的組成結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示嬰兒糞便中雙歧桿菌的百分含量與母乳中HMOs 的含量呈正相關(guān)。Mao 等[7]對具有代謝2′-FL 能力的雙歧桿菌進行研究,結(jié)果證實了雙歧桿菌聯(lián)合2′-FL 能夠顯著提高腸道菌群的物種豐富度。此外,雙歧桿菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生豐富的乳酸和短鏈脂肪酸,使得腸道環(huán)境pH 值顯著降低,從而抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌的繁殖及毒素的分泌,降低了誘發(fā)嬰兒分泌性腹瀉的風(fēng)險[8-9]。

1.2 阻斷病原體黏附靶細(xì)胞

細(xì)菌、病毒的感染是導(dǎo)致嬰幼兒患病的常見原因,大多數(shù)病原體感染宿主的第一步是通過凝集素或黏附素與腸道上皮細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合,而2′-FL 與宿主細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)構(gòu)相似,能夠作為可溶性誘餌受體與病原體結(jié)合（圖2b）,從而阻止了病原體在靶細(xì)胞表面的定植,最終被排出體外[10]。通過體外實驗證明了2′-FL 可以抑制空腸彎曲桿菌、腸致病性大腸桿菌、沙門氏菌血清變種和銅綠假單胞菌對人腸道細(xì)胞Caco-2 的黏附,并且2′-FL 顯著抑制了銅綠假單胞菌對人呼吸道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 的黏附,抑制率為24%[11]。

1.3 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)

2′-FL 對免疫系統(tǒng)也具有一定的積極影響,可作為免疫因子在全身發(fā)揮作用。Eiwegger 等[12]測試了2′-FL 對免疫系統(tǒng)的影響,結(jié)果顯示2′-FL 使Th1 細(xì)胞顯著增加,同時還促進γ 干擾素的分泌、抑制白細(xì)胞介素的產(chǎn)生,這表明2′-FL 具有抗炎作用,有助于降低嬰兒炎性疾病的發(fā)生率。2′-FL 還與腸道上皮細(xì)胞Ag-IgE復(fù)合物激活的調(diào)節(jié)相關(guān),能夠抑制炎癥細(xì)胞流入腸道,減輕食物過敏癥狀[13]。

2′-FL 對于疫苗接種的免疫應(yīng)答具有一定的改善作用。食用添加2′-FL 飼糧的小鼠,其疫苗特異性遲發(fā)型過敏（delayed-type hypersensitivity,DTH）反應(yīng)顯著增強,血清中疫苗特異性免疫球蛋白水平升高[14]。與對照組相比,喂養(yǎng)2′-FL 小鼠的脾臟B 細(xì)胞活化標(biāo)志物CD27 表達(dá)增加,體外再刺激后,脾細(xì)胞疫苗特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量和γ 干擾素的產(chǎn)生也顯著增加。另外還證實了2′-FL 對骨髓來源樹突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)和抗原提呈能力的直接影響。

1.4 促進大腦發(fā)育

在嬰兒的早期神經(jīng)發(fā)育過程中,神經(jīng)細(xì)胞髓鞘化對腦連接和行為認(rèn)知功能的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用,研究發(fā)現(xiàn)2′-FL 在促進少突膠質(zhì)祖細(xì)胞增殖、成熟、分化過程中發(fā)揮著重要作用,證實了2′-FL 能夠促進神經(jīng)細(xì)胞髓鞘化發(fā)育[15]（圖2c）。早期攝入2′-FL 對增強嬰兒的認(rèn)知發(fā)展和學(xué)習(xí)記憶是十分重要的,而并未發(fā)現(xiàn)其他HMOs 成分與嬰兒認(rèn)知發(fā)展相關(guān)[16]。事實上,2′-FL 可以滋養(yǎng)腸道微生物,并可能通過以下幾種機制促進嬰兒的認(rèn)知發(fā)育:1）防止腸道生態(tài)失衡,減少隨后從未成熟的腸道到發(fā)育中大腦的炎癥的發(fā)生,避免早期認(rèn)知缺陷[17]；2）提高腸道微生物擬桿菌和乳桿菌的豐度,增強腦信號傳導(dǎo)底物——短鏈脂肪酸的產(chǎn)生[18]。

在動物實驗中,Oliveros 等[19]以小鼠為模型檢驗了2′-FL 對大腦發(fā)育的影響,喂養(yǎng)了2′-FL 的小鼠在Y 形迷宮與莫里斯水迷宮中的表現(xiàn)都更好,而且補充了2′-FL 的大鼠長期增益效應(yīng)（long-term potentiation,LTP）比對照組更強烈且持續(xù)時間更長。研究發(fā)現(xiàn),小鼠認(rèn)知能力的提高是通過長期增強大腦海馬區(qū)來促進空間學(xué)習(xí)和記憶的,并檢測到2′-FL 增加了與新獲得記憶存儲相關(guān)分子的表達(dá)（如突觸后密度蛋白、磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴性激酶II 等）,表明2′-FL 會影響嚙齒動物的認(rèn)知領(lǐng)域,并改善學(xué)習(xí)和記憶[20]。

1.5 其他作用

病毒對于人類健康有著巨大的威脅,許多人類致死性傳染疾病通過病毒傳播,2′-FL 可起到預(yù)防病毒感染的功效。鑒定發(fā)現(xiàn)2′-FL 主要通過阻斷病毒的吸附和內(nèi)化來抑制柯薩奇病毒A 組9 型分離株（CV-A9）BUCT01 對人體細(xì)胞的感染,10 mg/mL 的2′-FL 對CVA9 有顯著的抑制作用且無細(xì)胞毒性,與對照組相比,2′-FL 阻斷了病毒的進入,使病毒在橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的感染顯著減少[21]。

皮膚在老化或紫外線照射等因素的作用下易出現(xiàn)色素沉著的現(xiàn)象,研究發(fā)現(xiàn)2′-FL 能夠誘導(dǎo)微管關(guān)聯(lián)蛋白1A 和1B（microtubule-associated proteins 1A/1B,MAP1LC3,LC3）的Ⅰ型轉(zhuǎn)化為自噬激活標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ,隨后形成LC3Ⅱ+/PMEL+自噬體[22]。此外,2′-FL 激活了AMP 依賴的蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）在Thr172 位點的磷酸化以及ULK1 在Ser555 位點的磷酸化,而這種磷酸化在AMPK 特異性抑制劑dorsmorphin 的存在下被逆轉(zhuǎn),從而使得2′-FL 介導(dǎo)的色素沉著減少,表明2′-FL 通過AMPK-ULK1 軸誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以促進黑色素降解。

近期研究表明,2′-FL 還具有一定的抗腫瘤與解毒作用。Li 等[23]在荷瘤裸鼠模型中,選擇結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 作為敏感細(xì)胞株,使用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）作為陽性藥物對HCT116 細(xì)胞進行處理。與對照組相比,2′-FL 組與2′-FL/5-Fu 組的腫瘤質(zhì)量均顯著降低,并發(fā)現(xiàn)了2′-FL 通過VEGFA/VEGFR2/PI3K/Akt/Caspase3 通路進行調(diào)控,從而實現(xiàn)新生血管數(shù)量的減少、腫瘤惡性程度的降低,證實了2′-FL 有一定的抗腫瘤及減輕肝腎組織毒性的作用。

2 2′-巖藻糖基乳糖的應(yīng)用領(lǐng)域及生產(chǎn)現(xiàn)狀

隨著生活水平的日益提高以及對更健康的膳食結(jié)構(gòu)的需求,2′-FL 因其優(yōu)越的性能被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。目前對2′-FL 最重要的應(yīng)用為添加到嬰幼兒配方奶粉中,此外,2′-FL 還可以添加到功能性食品和飲料中或用作醫(yī)療輔劑等。

2.1 嬰幼兒配方奶粉

2′-FL 不僅被美國食品及藥品管理局認(rèn)定為公認(rèn)安全（generally recognized as safe,GRAS）,而且被歐洲食品安全局批準(zhǔn)為一種新型食品（novel food,NF）,并進一步研究得出結(jié)論:將1.2 g/L 2′-FL、0.6 g/L LNnT聯(lián)合添加到嬰兒配方奶粉中時,2′-FL 對嬰兒是安全的[24]。2′-FL 可以顯著降低母乳喂養(yǎng)嬰兒腹瀉的發(fā)生率,作為益生元改善嬰兒的腸道健康,且較高濃度的2′-FL 可降低母乳喂養(yǎng)嬰兒的死亡率[25]。

2.2 功能性食品和飲料

近年來,具有益生元特性的功能性食品和飲料需求較高,研究與市場報告預(yù)計,到2027 年全球功能性食品和飲料市場達(dá)到2 291 億美元,且保持6.3%的復(fù)合年增長率。2′-FL 具有多種益生功效,添加到食品或者飲料中,能夠起到改善腸道菌群、增強免疫力等作用。因此,作為功能性原料的2′-FL 將在未來的食品和飲料領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

2.3 醫(yī)療輔劑

近期研究發(fā)現(xiàn),使用2′-FL 能夠減輕咪喹莫特（imiquimod,IMQ）誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的皮損炎癥。2′-FL 能夠抑制輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17,Th17）免疫應(yīng)答并減少Th17 相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生,2′-FL 干預(yù)后顯著減輕了IMQ 引起的皮膚紅斑和皮損增厚,同時能夠顯著降低皮膚角質(zhì)層增生并改善皮膚組織病理變化[26]。

另外,在腸道疾病的治療中,2′-FL 也具有一定的輔助改善效果。研究HMOs 改善腸易激綜合征的臨床試驗結(jié)果表明,每天定量服用HMOs 混合物對于腸易激綜合征癥狀的減輕具有顯著改善效果。隨著2′-FL多種生物活性的發(fā)掘,如何保障2′-FL 供給市場需求是目前亟需解決的問題。

2.4 2′-巖藻糖基乳糖生產(chǎn)現(xiàn)狀

目前,國外多家公司均供應(yīng)HMOs。同時,我國多家新銳企業(yè)已實現(xiàn)2′-FL 的產(chǎn)業(yè)化落地,并通過將合成生物學(xué)與人工智能算法進行有機整合、建立新的研發(fā)路徑、利用機器學(xué)習(xí)對整條代謝通路進行模塊化整合、采用新一代基因編輯技術(shù)對底盤微生物進行基因定向改造等方式來生產(chǎn)HMOs。

當(dāng)今很多國家和地區(qū)已經(jīng)批準(zhǔn)了HMOs 應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉原料中的相關(guān)法規(guī),為HMOs 市場提供了巨大的發(fā)展前景。目前,美國食品和藥物管理局、歐洲食品安全局已經(jīng)批準(zhǔn)了5 家公司的十多項與2′-FL 相關(guān)的產(chǎn)品[27]。2022 年,2′-FL 獲得了澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局批準(zhǔn),可應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉中。

法規(guī)的持續(xù)完善為HMOs 市場提供了巨大的發(fā)展前景,2018 年HMOs 的全球市場規(guī)模為7 882 萬美元,預(yù)計到2026 年將達(dá)到2.388 億美元,期間復(fù)合年增長率將達(dá)15.3%。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的擴展以及生產(chǎn)工藝的突破,未來HMOs 市場仍將保持增長態(tài)勢,科漢森公司預(yù)測到2025 年HMOs 的潛在市場價值將超過4.7 億美元,長期市場價值有望超過12 億美元。

我國在2016 年國家衛(wèi)計委就發(fā)布了2′-FL 作為食品營養(yǎng)強化劑的征求意見,但尚未得到批準(zhǔn)。在2021 年,國家衛(wèi)健委開放了國內(nèi)轉(zhuǎn)基因微生物食品添加劑的申報路徑,正式開始受理和審批轉(zhuǎn)基因微生物食品添加劑新品種；隨后在2022 年,國家發(fā)展改革委發(fā)布了《“十四五”生物經(jīng)濟發(fā)展規(guī)劃》,提出培育壯大生物經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè),大力發(fā)展合成生物學(xué)技術(shù),探索“人造”新型食品的研發(fā)。相關(guān)政策的制定將進一步加快2′-FL 的合法化進程,在未來我國2′-FL 發(fā)展空間進一步擴大的同時,其生產(chǎn)應(yīng)用也將迎來新的突破。

3 2′-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)方法

目前,生產(chǎn)2′-FL 的方法主要有3 種:化學(xué)合成法、酶催化合成法、微生物法。

3.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法以L-巖藻糖為底物,進行數(shù)十步反應(yīng)后經(jīng)過色譜分離,最終得到純度較高的2′-FL 產(chǎn)物。2019 年,Agoston 等[28]實現(xiàn)了2′-FL 的千克級化學(xué)合成,過程如圖3 所示。

圖3 2′-FL 的化學(xué)合成過程Fig.3 Chemical synthesis of 2′-FL

具體分為以下4 步:1）乳糖受體的制備:以D-乳糖為原料進行2 步反應(yīng),使用了包括2,2-二甲氧基丙烷、哌戊酰氯、吡啶和二氯甲烷等化學(xué)試劑,后進行柱層析獲得純的乳糖受體,得率為52%；2）巖藻糖基供體的制備:以L-巖藻糖為原料,經(jīng)過乙?；?、引入噻吩基、催化脫除乙酸酯反應(yīng)后,進一步在N,N-二甲基酰胺中進行芐基化反應(yīng),過程中以溴化芐為烷化劑、叔丁醇鉀為堿,最終在以四氫呋喃為溶劑的體系中結(jié)晶分離出糖基供體,得率為67%～72%；3）糖基化:使用Lemieux 方法,從乙酸乙酯中結(jié)晶分離得到晶體,再用甲醇重結(jié)晶進一步純化；4）目標(biāo)產(chǎn)物的分離:去除保護基團、脫除芐基,2′-FL 以白色無定形固體的形式被分離得到,最終得率僅為19.8%～27.3%。

化學(xué)合成法涉及的步驟繁瑣、反應(yīng)條件嚴(yán)苛、產(chǎn)率低、底物成本高,且反應(yīng)過程中大量使用的有機試劑會對環(huán)境造成污染,故化學(xué)合成法在2′-FL 生產(chǎn)方面暫未實現(xiàn)較大的應(yīng)用規(guī)模[29]。

3.2 酶催化合成法

酶法合成由于具有能夠進行糖苷鍵的特異性合成以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點,獲得了極大的關(guān)注。酶催化反應(yīng)中涉及到的酶主要包括α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,2-fucosyltransferases）和α-L-巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase）[30],可使用的底物有鳥苷5′-二磷酸-L-巖藻糖（guanosine 5′-diphospho-L-fucose,GDP-L-fucose）、乳糖和4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucosidase,pNP-FUC）,通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)完成2′-FL 的催化合成,如圖4 所示。

圖4 2′-FL 的酶法合成Fig.4 Enzymatic synthesis of 2′-FL

Shi 等[31]表達(dá)了來自土地桿菌屬（Pedobɑctersp.CAU209）的新型α-L-巖藻糖苷酶PbFuc,該酶以pNPFUC 為供體,乳糖為受體催化2′-FL 的合成。該酶對pNP-FUC 及2′-FL 表現(xiàn)出的比活力分別為26.3 U/mg和3.4 U/mg,在pH5.0 和35°C 的條件下,轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%,表明PbFuc 在特異性合成2′-FL 方面具有較大的潛力。Liu 等[32]采用計算機輔助設(shè)計和篩選與生化試驗相結(jié)合的半理性操作,增強了α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶對底物乳糖的識別,與野生型相比,突變體的催化效率提高了100 倍,通過體外酶促法獲得的2′-FL 可達(dá)2.56 g/（mL·h）。

與化學(xué)法合成相比,酶法合成的反應(yīng)條件較溫和、易控制,但因當(dāng)前酶法合成的產(chǎn)量較低、底物GDP-L-巖藻糖成本較高,以及以pNP-FUC 為底物進行合成的產(chǎn)物存在對硝基苯酚污染問題,故其在生產(chǎn)規(guī)模及食品領(lǐng)域的應(yīng)用等方面仍然存在許多限制[33]。未來,繼續(xù)發(fā)掘能夠替代pNP-FUC 等合成底物的低成本天然底物,同樣是進一步降低酶法合成2′-FL 成本的一種有效方法。

3.3 微生物法

相較于化學(xué)法和酶催化法,微生物法合成2′-FL具有易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、可使用廉價原料作為底物等優(yōu)勢,更容易實現(xiàn)2′-FL 的高水平生產(chǎn)。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的不斷發(fā)展進步,人們不斷探尋微生物中的特定基因,適當(dāng)?shù)貙ζ浼右愿脑觳?gòu)建2′-FL合成途徑,在實現(xiàn)2′-FL 工業(yè)化、大規(guī)模生產(chǎn)方面取得了顯著的成果和突破。

微生物合成2′-FL 的主要代謝途徑包括補救途徑和從頭合成途徑,如圖5 所示。

圖5 2′-FL 的從頭合成途徑和補救途徑Fig.5 De novo pathway and salvage pathway of 2′-FL

補救途徑中,首先是具有L-巖藻糖激酶活性和L-巖藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的雙功能酶Fkp 將外源添加的巖藻糖轉(zhuǎn)化為GDP-L-巖藻糖；隨后,乳糖在乳糖透過酶的催化作用下被轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞內(nèi)；最后,在外源引入的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,巖藻糖殘基從GDP-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移到乳糖上,完成乳糖的巖藻糖基化,最終生成2′-FL[34]。補救途徑以巖藻糖為起始底物,途徑簡單,容易改造,但由于巖藻糖價格昂貴,導(dǎo)致了補救途徑的成本過高而無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[35]。

從頭合成途徑中,微生物從糖酵解途徑的中間代謝產(chǎn)物果糖-6-磷酸開始合成GDP-L-巖藻糖。該途徑依次經(jīng)過甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶、磷酸甘露糖變位酶和甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)得到GDP-甘露糖,然后,在GDP-D-甘露糖-4,6-脫氫酶和GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶-4-還原酶的催化作用下,生成GDP-L-巖藻糖[36]。最終,由α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化乳糖完成巖藻糖基化反應(yīng)。2′-FL 的從頭合成途徑涉及到的合成步驟相對于補救途徑更復(fù)雜一些,但從頭合成途徑可選擇使用蔗糖、葡萄糖、甘油等廉價原料作為底物進行2′-FL 的發(fā)酵合成,從而更具有實用價值、更容易實現(xiàn)2′-FL 的規(guī)模化生產(chǎn)。

4 2′-巖藻糖基乳糖生產(chǎn)菌種構(gòu)建

目前,尚未發(fā)現(xiàn)能夠自然合成2′-FL 的微生物,需要通過基因工程手段在微生物細(xì)胞中構(gòu)建相關(guān)的合成途徑來實現(xiàn)2′-FL 的生產(chǎn)。目前最常用的底盤菌株為大腸桿菌（Escherichiɑcoli）,但大腸桿菌不屬于食品安全菌株,對產(chǎn)品純化的要求更高,因此在提高大腸桿菌發(fā)酵液的分離純化技術(shù)的同時,也在不斷探尋安全性更高的宿主菌株,包括釀酒酵母（Sɑcchɑromycescerevisiɑe）、解脂耶氏酵母（Yɑrrowiɑlipolyticɑ）、枯草芽孢桿菌（Bɑcillussubtilis）、谷氨酸棒桿菌（Corynebɑcterium glutɑmicum）和乳酸乳球菌（Lɑctococcuslɑctis）等。

4.1 大腸桿菌菌種構(gòu)建

因大腸桿菌具有清晰的遺傳背景、簡單的基因操作被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中。此外,大腸桿菌自身具有GDP-L-巖藻糖的合成途徑,通過增加GDP-L-巖藻糖的供給和引入α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶,就能夠在大腸桿菌中構(gòu)建2′-FL 合成的代謝途徑[37]。但大腸桿菌本身胞內(nèi)的GDP-L-巖藻糖積累量少,同時大部分已知的α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性較低,因此,需要經(jīng)過大量的代謝工程改造才能實現(xiàn)2′-FL 的高效合成。

4.1.1 提高底物的積累量

2′-FL 合成的關(guān)鍵中間體GDP-L-巖藻糖的積累是2′-FL 生產(chǎn)的限制因素,因此通常從加強GDP-L-巖藻糖的合成及阻斷GDP-L-巖藻糖的旁路代謝通量兩個方面進行代謝工程改造。為了提高工程大腸桿菌中GDP-L-巖藻糖的積累量,通常需要過表達(dá)2′-FL 從頭合成途徑中的關(guān)鍵基因,包括mɑnA、mɑnB、mɑnC、gmd和wcɑG等。此外,作為從頭合成途徑中最后一步WcɑG催化反應(yīng)的關(guān)鍵輔因子NADPH,過表達(dá)其合成酶,包括NADH 激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[38],也能夠達(dá)到這一目的。在阻斷GDP-L-巖藻糖的旁路代謝通量方面,敲除GDP-L-巖藻糖轉(zhuǎn)化為可拉酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因wcɑJ,對巖藻糖的積累具有促進作用[39]。

同時,作為合成2′-FL 另一底物的乳糖,增加其輸入到細(xì)胞中的通量也至關(guān)重要。但當(dāng)大腸桿菌以葡萄糖作為細(xì)胞生長的碳源,乳糖由乳糖操縱子中的乳糖透過酶（LacY）轉(zhuǎn)運時,乳糖轉(zhuǎn)運會受到分解代謝阻遏（catabolite repression,CR）,限制了細(xì)胞中用于巖藻糖基化反應(yīng)的乳糖供應(yīng),從而減少了2′-FL 的產(chǎn)生。Park 等[40]從E.coliBL21 的lac 操縱子上解除CR,并使用lac 啟動子取代tac 啟動子,使lac 操縱子可以啟動的同時解除了菌株受到的CR 影響,從而顯著提高2′-FL的產(chǎn)量,達(dá)到了40 g/L。Ni 等[41]利用lɑcZ突變的E.coliC41（DE3）ΔZ 構(gòu)建了工程化細(xì)胞工廠,并采用了一對正調(diào)控因子RcsA 和RcsB 來促進GDP-L-巖藻糖的形成,使2′-FL 產(chǎn)量達(dá)到6.86 g/L。

4.1.2 優(yōu)化2′-FL 合成途徑中的關(guān)鍵酶

除了調(diào)節(jié)GDP-L-巖藻糖的積累量之外,限速酶α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性也是微生物合成2′-FL 的關(guān)鍵限制因素。Li 等[42]通過引入多級代謝工程策略,進行GDP-L-巖藻糖合成模塊的基因組合優(yōu)化,進一步使用RBS 篩選、融合肽段和多拷貝基因克隆等手段提高限速酶的催化性能,并通過分析2′-FL 合成途徑中的關(guān)鍵中間體、切斷競爭途徑使得碳通量流向2′-FL的生成,最終在3 L 發(fā)酵罐中通過補料分批培養(yǎng)的2′-FL 產(chǎn)量達(dá)64.62 g/L。Liu 等[43]采用核糖體結(jié)合位點、融合肽和酶基因協(xié)同修飾的組合工程策略,增強α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)并提高其酶活性,在E.coli（DE3）PlySs 中使用優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點區(qū)域驅(qū)動3×FLAG 作為融合伴侶與α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶同時進行表達(dá),最終蛋白產(chǎn)量和酶活顯著提高,分別提高了11.51 倍和13.72 倍,促進了2′-FL 的生產(chǎn)。

目前使用的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶大多是致病菌幽門螺桿菌來源的FucT2 和FutC,Chin 等[44]使用脆弱擬桿菌來源的WcfB 進行2′-FL 的合成,使其產(chǎn)量提高了10 倍。因此,從其他微生物中挖掘高催化活性的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶以進一步優(yōu)化2′-FL 的生物合成,仍是未來研究的重要方向。Chen 等[45]將來自生脂固氮螺菌（Azospirillumlipoferum）的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶SAMT 整合至大腸桿菌染色體中,同時敲除了lɑcZ和wcɑJ基因并引入調(diào)控因子RcsA 和RcsB,在5 L 發(fā)酵罐中通過分批補料發(fā)酵,使2′-FL 產(chǎn)量達(dá)到112.56 g/L。

此外,Chen 等[46]采用空間合成生物學(xué)策略,利用能夠相互作用的肽段序列,構(gòu)建了由相關(guān)途徑酶組成的多酶復(fù)合物,通過自組裝改善了大腸桿菌中2′-FL 生物合成途徑酶的空間組裝。與表達(dá)游離酶和未組裝酶的對照菌株相比,試驗組的2′-FL 合成通量提高了2.1倍,達(dá)到25.1 g/L,為2′-FL 的合成提供了新的思路。

4.1.3 補救途徑中的代謝改造

相比于從頭合成途徑,補救途徑生產(chǎn)成本較高,但其途徑簡單、容易改造,在2′-FL 生產(chǎn)方面仍然具有較大的潛力。首先,增強Fkp 的表達(dá)是提高補救途徑中胞內(nèi)GDP-L-巖藻糖含量的主要方法。GTP 是Fkp 的關(guān)鍵限速底物,通過過表達(dá)gsk基因從而加強GTP 的再生、優(yōu)化GTP 的供應(yīng),已被證實有利于增強2′-FL 的合成[47]。提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性、阻斷巖藻糖的分解代謝等措施在補救途徑的代謝改造中同樣適用。Chin 等[48-49]在工程菌株E.coliBL21star（DE3）中引入脆弱擬桿菌（Bɑcteroidesfrɑgilis）來源的Fkp 和幽門螺桿菌（Helicobɑcterpylori）來源的Fuct2 構(gòu)建了2′-FL 補救途徑,首先使用來自大腸桿菌K12 的含有l(wèi)acZ△M15 的乳糖操縱子替換了原本的內(nèi)源性乳糖操縱子,并在FucT2 的N 端加入了3 個天冬氨酸分子進一步提高2′-FL 的合成,發(fā)酵后2′-FL 產(chǎn)量為6.4 g/L。考慮到巖藻糖分解代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶L-巖藻糖異構(gòu)酶（L-fucose isomerase,FucI）和L-墨角藻糖激酶（L-fuculose kinase,FucK）會分解巖藻糖并產(chǎn)生相關(guān)副產(chǎn)物,在構(gòu)建了2′-FL 補救途徑的基礎(chǔ)上又敲除了fucIfucK基因簇和編碼降解乳糖的β-半乳糖苷酶基因lɑcZ,最終使2′-FL 胞外濃度達(dá)到23.1 g/L。除了FucI和FucK 之外,阿拉伯糖異構(gòu)酶（arabinose isomerase,AraA）和鼠李糖異構(gòu)酶（rhamnose isomerase,RhaA）也能夠催化巖藻糖異構(gòu)化,不利于巖藻糖的積累。Jung等[50]構(gòu)建了ɑrɑA和rhɑA基因缺失菌株,使2′-FL 的產(chǎn)量達(dá)到47 g/L,相比于對照菌株提高了2 倍。

同時構(gòu)建補救途徑與從頭合成途徑也可以提高2′-FL 的生物合成。Li 等[51]將2′-FL 從頭合成途徑和補救途徑共同構(gòu)建到單一的工程菌株E.coliBL21（DE3）中,導(dǎo)入了fucT2基因,并利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)使lɑcZ、fucI、fucK和wcɑJ基因失活,通過改變質(zhì)?？截悢?shù)對不同的靶基因進行調(diào)控以提高2′-FL 的生物合成,使2′-FL 產(chǎn)量達(dá)到14.1 g/L。

4.1.4 菌種構(gòu)建的新思路

近年來,隨著合成生物學(xué)與代謝工程的不斷發(fā)展,嘗試使用更多的代謝工程方法及工具進行2′-FL 生產(chǎn)菌種的構(gòu)建。Sun 等[52]采用理性的精細(xì)調(diào)控途徑基因表達(dá)和非理性的實驗室適應(yīng)性進化組合策略來提高2′-FL 積累,對2′-FL 合成途徑基因的表達(dá)進行單拷貝或多拷貝精細(xì)調(diào)控,并在此基礎(chǔ)上刪除分支途徑基因、過表達(dá)2′-FL 外排蛋白SetA 和果糖-1,6-二磷酸酶GlpX,得到的菌株在5 L 發(fā)酵罐中的2′-FL 產(chǎn)量為46.06 g/L。隨后進行實驗室適應(yīng)性進化,獲得了耐受性提高的rpoC基因突變株,該菌株2′-FL 產(chǎn)量為61.06 g/L,生產(chǎn)強度可達(dá)1.70 g/（L·h）,是目前相關(guān)報道的最高生產(chǎn)強度。

除此之外,在合成途徑關(guān)鍵基因（如mɑnC-mɑnB和gmd-wcɑG）處利用強組成型啟動子替代原有的啟動子,將額外的wbgL（α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因）表達(dá)盒整合到recA位點[53]；增加futC的基因拷貝數(shù)并在FutC 的N 端融合TrxA 標(biāo)簽[54]等途徑精細(xì)調(diào)控優(yōu)化措施已被用來提高2′-FL 合成,并取得了一定成效。為了簡化產(chǎn)物純化過程、避免抗生素在具有營養(yǎng)用途的產(chǎn)品中殘留,Baumg?rtner 等[55]將途徑基因整合到大腸桿菌的染色體上,實現(xiàn)2′-FL 的無抗生素全細(xì)胞合成,最終得到2′-FL 濃度為20.28 g/L。使用蛋白質(zhì)工程對α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進行改造,通過對FutC-配體底物對接分析,發(fā)現(xiàn)了可以提高FutC 溶解度和活性的突變位點,其中4 個突變位點的組合（F40S/Q150H/C151R/Q239S）使2′-FL 產(chǎn)量提高了2.4 倍[40]。

4.2 釀酒酵母菌種構(gòu)建

釀酒酵母（Sɑcchɑromycescerevisiɑe）作為GRAS 菌株,具有合成2′-FL 的理想特性,如細(xì)胞內(nèi)含有豐富的GDP-巖藻糖前體物質(zhì)GDP-甘露糖,以及缺乏乳糖的分解代謝能力。在2018 年首次報道了通過代謝工程改造釀酒酵母[56],成功實現(xiàn)了2′-FL 的生物合成,但產(chǎn)量較低,以乙醇為碳源進行發(fā)酵獲得的2′-FL 僅有503 mg/L。之后,Xu 等[57]注意到釀酒酵母存在無法攝入乳糖、不能合成GDP-巖藻糖等問題,需要轉(zhuǎn)入異源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白以及表達(dá)GDP-巖藻糖合成相關(guān)基因,于是在釀酒酵母中表達(dá)大腸桿菌來源的gmd、wɑcj基因,實現(xiàn)了GDP-巖藻糖的有效合成。另外,在α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇方面,從不同微生物中挖掘鑒定潛在的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,其中采用蠟樣芽孢桿菌中的FutBc 實現(xiàn)了較高的2′-FL 產(chǎn)量,比常用的幽門螺桿菌來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FutC）提高了1.8 倍。進一步通過強化GDP-甘露糖的合成、敲除半乳糖誘導(dǎo)型啟動子的主要轉(zhuǎn)錄抑制因子gɑl80后,得到2′-FL 的產(chǎn)量為26.63 g/L[58]。雖然利用釀酒酵母產(chǎn)生的2′-FL 與工程大腸桿菌相比在產(chǎn)量上仍然有一定的差距,但研究結(jié)果對于開發(fā)食品級微生物細(xì)胞工廠、實現(xiàn)2′-FL 的商業(yè)化、規(guī)?；?jīng)濟生產(chǎn)具有巨大潛力。

4.3 枯草芽孢桿菌菌種構(gòu)建

枯草芽孢桿菌（Bɑcillussubtilis）同樣是GRAS 菌株,在食品級產(chǎn)品的微生物合成中被廣泛使用,通過引入fkp、futC等基因在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了2′-FL 補救途徑[59],過表達(dá)L-巖藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（glcP）、引入異源乳糖滲透酶基因（lɑcY、lɑc12）以及消除內(nèi)源性β-半乳糖苷酶基因（yesZ）,改善了L-巖藻糖和乳糖的輸入、避免了乳糖的降解。此外,通過微調(diào)輔因子GTP再生模塊基因（gmd、ndk、guɑA、guɑC、ykfN、deoD和xpt）的表達(dá)提高了GDP-L-巖藻糖的積累量,最終該菌的2′-FL 產(chǎn)量達(dá)到了5.01 g/L。隨后,Zhang 等[60]在枯草芽孢桿菌中引入大腸桿菌和幽門螺旋桿菌來源的mɑnB、mɑnC、gmd、wcɑG和futC基因構(gòu)建了2′-FL 從頭合成途徑,通過減少競爭性乳糖消耗、增加輔因子GTP 的再生和前體甘露糖-6-磷酸（M6P）的供應(yīng)進一步提高2′-FL 產(chǎn)量,同時,使用組成型啟動子P7 替換編碼M6P 異構(gòu)酶的內(nèi)源性mɑnA基因的天然啟動子,最終在不添加抗生素和化學(xué)誘導(dǎo)劑的情況下,使2′-FL產(chǎn)量達(dá)到了88.3 g/L。由此可見,通過改造枯草芽孢桿菌工程菌,亦可實現(xiàn)2′-FL 的高效合成。

已報道的部分2′-FL 生產(chǎn)菌株如表1 所示。

表1 已報道的部分2′-FL 生產(chǎn)菌株Table 1 Some reported 2′-FL producing strains

5 結(jié)論與展望

目前,2′-FL 的合成主要通過化學(xué)合成、酶法合成和基因工程微生物發(fā)酵來實現(xiàn),其中,構(gòu)建2′-FL 高產(chǎn)微生物具有易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、可使用廉價原料作為底物等優(yōu)勢,被認(rèn)為是極具前景的生產(chǎn)方式。構(gòu)建高效的重組菌株是2′-FL 工業(yè)化生產(chǎn)的重要任務(wù)。

大腸桿菌是目前合成2′-FL 最主要的工程菌種,可對其代謝途徑進一步優(yōu)化以提高其合成效率,包括提高GDP-巖藻糖的積累量、優(yōu)化2′-FL 合成途徑中的關(guān)鍵酶、提高菌種的耐受性等?？紤]大腸桿菌不屬于食品安全菌株,已嘗試構(gòu)建釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等食品安全級的工程菌來進行2′-FL 的生物合成,目前報道的產(chǎn)量較低,但結(jié)合代謝工程、啟動子工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等多種改造策略,有望進一步提高產(chǎn)量。隨著2′-FL 生產(chǎn)菌株的高效合成、提取技術(shù)的優(yōu)化以及相關(guān)應(yīng)用準(zhǔn)則的批準(zhǔn),2′-FL在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有更加廣闊的應(yīng)用前景。