彭寅嘯，俸斌，黃智，杭方學(xué)，李凱，牛德寶，*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)甘蔗與制糖產(chǎn)業(yè)學(xué)院,廣西南寧 530004；3.廣西廣業(yè)貴糖糖業(yè)集團有限公司,廣西貴港 537100）

以水果或水果汁液為原料,通過微生物（如釀酒酵母）發(fā)酵得到的產(chǎn)品被稱為果酒[1]；酒精濃度按體積計算一般在1.2%～14%[2]。果酒是傳統(tǒng)的酒精飲料,其中最為盛行的是葡萄酒[3-5]。果酒具有很高的功能價值,如促進身體新陳代謝、調(diào)整膽固醇水平、促進人體血液循環(huán)、延緩衰老等,同時因其具有果香濃郁、外觀清亮、口感獨特清新、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點,深受新時代廣大消費者的喜愛[6-7]。

甲醇是果酒釀造中產(chǎn)生的一種有害化學(xué)物質(zhì),嚴重威脅著消費者的身體健康。攝入過量的甲醇會導(dǎo)致受害者出現(xiàn)多種癥狀,包括意識喪失、呼吸困難、視力模糊甚至失明、腹痛、惡心、腹瀉和嘔吐等,嚴重的還會危及生命[8]。甲醇中毒最常見的原因是飲用甲醇超標(biāo)的酒精飲料,甲醇在人體中被迅速吸收和擴散,其毒性作用在初次攝入后的12～24 h 即可發(fā)生[9-10]。受害者通常錯誤的認為是攝入了過多的乙醇,而沒有及時就診,導(dǎo)致中毒進一步加劇。甲醇在人體內(nèi)大部分通過肝臟代謝為甲酸或甲酸鹽而清除,只有2%～5% 經(jīng)腎臟排泄[11]。成年人每日安全耐受甲醇的劑量為2 g,毒性劑量為8 g[12]。可見,即使少量的甲醇攝入也會對人體造成損害。因此,嚴格控制果酒中甲醇的含量對消費者的健康有著重要意義。

1 果酒中甲醇產(chǎn)生的過程及機理

1.1 果膠與內(nèi)源果膠酶酶解

果膠是果酒中甲醇的主要前體物質(zhì),它是一種普遍存在于高等植物細胞壁的多糖[13-14]。果膠中約70%的成分為半乳糖醛酸,其相互連接形成半乳糖醛酸鏈[13]（見圖1）。果膠酯酶可以使半乳糖醛酸脫酯產(chǎn)生甲醇與果膠酸[15-16]。果膠酯酶廣泛分布于高等植物中,它們在一些水果的自然成熟過程中參與果膠的修飾[17]。果膠的酶促降解反應(yīng)發(fā)生在果酒釀造的各個階段:在發(fā)酵之前[18],原料汁液中的內(nèi)源果膠酯酶開始降解果膠,人工添加的商業(yè)果膠酶則會促進反應(yīng)的發(fā)生；發(fā)酵過程中,微生物產(chǎn)生的果膠酶也會進一步加快該反應(yīng)的進行[19]。幾乎所有的酒精飲料都含有甲醇,其中葡萄酒和蒸餾酒中甲醇的含量相對較高,啤酒和谷物酒中的甲醇含量則非常少[20-21]。

圖1 半乳糖醛酸鏈Fig.1 Galacturonic acid chain

1.2 微生物與甘氨酸途徑

在傳統(tǒng)的發(fā)酵酒精飲料中,部分果膠酯酶是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。包括果膠酶在內(nèi)的植物細胞壁降解酶在病原體、腐生細菌和真菌中普遍存在[9]。另有研究報道,在釀酒過程中,微生物也可利用甘氨酸生成一定量的甲醇[22]。張香等[23]認為這是在酒精發(fā)酵時,酵母通過脫氨脫羧酶分解甘氨酸時生成了甲醇,或酵母通過甘氨酸裂解酶分解甘氨酸時生成了甲胺并進一步與亞硝酸反應(yīng)生成甲醇。Liang 等[24]的研究表明甘蔗烈酒里的甲醇含量隨著甘氨酸含量的增加而增加,甘氨酸轉(zhuǎn)化為甲醇的轉(zhuǎn)化率為24.56%。

2 果酒中甲醇產(chǎn)生的影響因素

2.1 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度會影響成品酒中甲醇的含量,在適宜酵母生長的溫度范圍內(nèi),甲醇含量隨著溫度的升高而增加。例如,張香[25]的研究中發(fā)現(xiàn),主發(fā)酵溫度為25 ℃的柑橘酒相比于主發(fā)酵溫度10 ℃的柑橘酒中甲醇質(zhì)量濃度要高出40 mg/L。此外,有關(guān)香蕉酒[26]和刺葡萄酒[27]的研究結(jié)果均表明在適宜酵母菌生長的溫度范圍內(nèi),甲醇的含量隨溫度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢。相比于26 ℃,在30 ℃發(fā)酵的刺葡萄酒甲醇質(zhì)量濃度增長了約100 mg/L。有研究者認為,這是因為溫度適度升高,酵母菌以及相關(guān)酶的活性都有所提高,有利于果膠的分解,從而產(chǎn)生更多的甲醇[28]。

2.2 釀酒酵母的種屬

發(fā)酵過程中的微生物包括酵母也會對甲醇的含量產(chǎn)生影響,這些微生物會在發(fā)酵過程中通過一些復(fù)雜的代謝途徑持續(xù)產(chǎn)生甲醇。例如Joshi 等[29]分別使用4 種酵母（來自美國加州戴維斯大學(xué)分校,編碼分別為UCD 595、UCD 522、UCD 505 和W）進行蘋果酒發(fā)酵研究,其中釀酒酵母的局部分離株——W 菌株發(fā)酵的蘋果酒相較于UCD595 菌株甲醇含量高出23%。蔣成等[30]分別使用5 種商業(yè)酵母（菌株KD、D254、EC1118、X16、BO213）進行無花果酒發(fā)酵研究,其中菌株KD 發(fā)酵的甲醇含量顯著低于其它菌株（p<0.05）,僅為297.19 mg/L,菌株D254 發(fā)酵的無花果酒中甲醇含量也與其它菌株存在顯著差異,達390.54 mg/L（p<0.05）,而其他3 組樣品甲醇質(zhì)量濃度均超過500 mg/L。類似地,董文娟[31]分別使用5 種釀酒酵母（SIHA、LALVIN 71B、LALVIN K1、LALVIN R-HST 和貝酵母LALVIN EC1118）進行了冰蘋果酒和山楂酒的發(fā)酵研究,其中冰蘋果酒有兩組樣品甲醇含量與其他樣品存在顯著差異,山楂酒5 組樣品彼此均存在顯著差異。Satora 等[32]在研究中也發(fā)現(xiàn)了這種酵母種屬帶來的差異,他們認為這是由于不同酵母產(chǎn)生的果膠酯酶的活性不同導(dǎo)致的。

2.3 原料成分

包括果膠在內(nèi)的原料成分對果酒中甲醇的含量也會產(chǎn)生影響。多項關(guān)于果膠的研究[33-35]表明,各類水果的果膠含量及酯化程度存在顯著差異。例如,雙子葉植物中的果膠含量相對較高；番茄類水果表皮中果膠的酯化程度相對較高等。很多研究者[36-37]認為釀酒原料的果膠含量和果膠酯化程度直接影響著果酒中的甲醇含量。Zhang 等[38]使用不同的原料（李子壓榨汁與李子帶渣混合汁）進行對比試驗,發(fā)現(xiàn)在相同發(fā)酵條件下壓榨汁組的甲醇含量遠低于帶渣汁組,3 個品種（來自紐約手指湖水果種植區(qū)的Geneva Mirabelle、French Damson和Pozegaca）壓榨汁組甲醇均比帶渣汁組低15%以上。

2.4 果膠酶

原料中果膠酶的活性也會影響果酒中甲醇的含量。果膠酯酶作用于原料中的果膠,引發(fā)酶解反應(yīng),導(dǎo)致半乳糖醛酸脫酯,從而生成甲醇[23]。Han 等[39]研究了3 種蘋果酒（添加氯化鈣的并接種0.2 g/L 酵母的樣品、只接種0.2 g/L 酵母的樣品和自發(fā)酵樣品）中甲醇含量和果膠酶活性的關(guān)系。研究結(jié)果揭示,這3 組樣品的甲醇含量與發(fā)酵過程中的果膠酯酶活性和果膠裂解酶活性呈正相關(guān)。此外,有研究指出葡萄酒中的大部分甲醇是由葡萄原料中的內(nèi)源性果膠酶分解葡萄果膠產(chǎn)生的[17]。Rollero 等[40]在葡萄酒的研究中發(fā)現(xiàn),添加了商業(yè)果膠酶（包括半乳糖醛酸酶、果膠酯酶和果膠裂解酶）的樣品中甲醇含量是未添加商業(yè)果膠酶的樣品的1.5 倍。這表明商業(yè)果膠酶的添加也影響著果酒中的甲醇含量。

3 傳統(tǒng)甲醇控制方法

許多研究報道了利用傳統(tǒng)手段降低果酒中甲醇含量的方法（見表1）,主要包括熱處理、釀酒酵母改良、外源物質(zhì)添加以及蒸餾4 個類型。盡管傳統(tǒng)方法在技術(shù)層面相對成熟,但仍存在損害酒品質(zhì)、應(yīng)用范圍受限等局限性。

表1 果酒中甲醇的傳統(tǒng)控制方法Table 1 Traditional control method of methanol in fruit wine

3.1 熱處理

在果酒生產(chǎn)過程中,除了通過調(diào)整溫度以簡單控制果酒發(fā)酵外,加熱處理也是一種傳統(tǒng)且常見的甲醇控制方法。主要方法是在釀造前,對釀造原料進行加熱處理,例如浸沸、蒸煮和巴氏消毒等。通過加熱使果膠分解,不再酶解為甲醇,同時使原料中含有的果膠酶失活從而降低果膠酶對果膠的酶解作用,進而降低成品中的甲醇含量[41]。

呂佳瑋等[42]在釀造柿子酒前對原料進行蒸煮處理,研究結(jié)果證明這種方式降低了成品中30%左右的甲醇。李桂林[41]對紅棗進行10～25 min 的浸沸處理后,發(fā)酵得到的紅棗白蘭地中甲醇質(zhì)量濃度顯著降低,相比對照組下降了0.2 g/L。此外,經(jīng)過巴氏殺菌后的蘋果蒸餾酒樣品中甲醇質(zhì)量濃度為217 mg/100 mL,而未經(jīng)巴氏殺菌處理的對照組中為400 mg/100 mL[43]。超聲作用對于酶的失活和甲醇的作用不明顯,但熱超聲的效果顯著[44]。熱超聲的降甲醇效果明顯高于單純熱處理,在50 ℃和60 ℃的溫度下超聲處理原料果渣5～15 min,李子酒中甲醇質(zhì)量濃度分別下降了15%和22%。然而,該方法處理會損害李子酒的風(fēng)味。熱微波可以有效降低甲醇的含量,在85 ℃、1 min 處理條件下,甲醇降低了60%。同時微波在高溫下所需的處理時間較短,對風(fēng)味的損害遠低于熱處理和熱超聲[44]。

然而,釀酒原料的加熱處理存在較大弊端,可能導(dǎo)致原料中原有的營養(yǎng)物質(zhì)（比如多酚、維生素等熱敏成分）受到破壞,同時影響產(chǎn)品的風(fēng)味和感官色澤[45-47],極大降低果酒的品質(zhì)。此外,釀酒原料自帶的果膠酶受熱失活會使果膠分解不足,影響原料的出汁率。盡管熱超聲在降低甲醇含量方面優(yōu)于傳統(tǒng)熱處理方法,但仍需一定程度的加熱處理,無法避免對果酒品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。熱微波能夠有效減少甲醇含量,但其大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用還不成熟,需要制定規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)以及驗證其安全性[48]。

3.2 釀酒酵母的改良

發(fā)酵過程中的微生物包括酵母會對甲醇的含量產(chǎn)生一定影響,這些微生物會在發(fā)酵過程中持續(xù)產(chǎn)生甲醇。有學(xué)者認為對酵母進行誘變選育,培養(yǎng)出產(chǎn)甲醇能力更弱的酵母突變體也是一種有效減少果酒甲醇含量的方法。例如,武曉娜[49]用紫外輻照（ultraviolet,UV）和硫酸二乙酯（diethyl sulfate,DES）對酵母進行誘變選育,獲得最佳變異菌株,其能使甘蔗烈酒中甲醇含量相較于對照組降低25% 以上。UV 與DES 結(jié)合誘變選育后,培育出的低甲醇產(chǎn)量（97.3 mg/L）的突變型釀酒酵母DU9,與僅使用DES 處理的釀酒酵母D4 相比,其生產(chǎn)的甘蔗烈酒甲醇含量降低12.3%；相較于未進行任何處理的菌株,降低幅度達27.8%。這表明,紫外誘變與DES 結(jié)合是培育出具有較低甲醇生成量的釀酒酵母突變體的有效方法。

另有研究證明使用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）射流在培育低甲醇產(chǎn)量的酵母菌屬突變體中表現(xiàn)出較強作用[50]。在該研究中,突變率達到了47.4%,正向突變率為26.3%。研究結(jié)果顯示,突變體釀酒酵母S12 的產(chǎn)甲醇能力最低,與野生型菌株相比,S12 發(fā)酵樣品中的甲醇含量降低了72.54%。

值得注意的是,上述誘變方法雖然有效培育出了甲醇生成量更低的酵母突變體,但這些研究中多以單一的甲醇和乙醇含量為檢測指標(biāo),未有香氣以及風(fēng)味物質(zhì)的檢測與感官評定的報告對比。經(jīng)過誘變培育后的酵母雖然降低了甲醇的產(chǎn)量,但其發(fā)酵能力和最終成品的品質(zhì)能否得到保證缺乏進一步的數(shù)據(jù)支撐。

3.3 外源物質(zhì)的添加

傳統(tǒng)的控制果酒甲醇的方法多為抑制果膠的酶解反應(yīng),添加外源物質(zhì)抑制甲醇生成也是一種控制策略。在果酒發(fā)酵初期添加膨潤土能有效降低甲醇含量。Han 等[37]研究表明在10 ℃和25 ℃發(fā)酵條件下,無論是鮮榨蘋果混合汁還是靜置處理得到的蘋果清汁,在發(fā)酵前添加膨潤土處理都能有效降低甲醇含量,能使甲醇含量下降30%左右,其中對鮮榨蘋果混合汁的影響更為顯著。膨潤土作為良好的蛋白質(zhì)吸附劑,有很強的吸附作用,作者推測其對果膠酯酶和果膠都有吸附作用,從而影響酶解反應(yīng)來降低甲醇的產(chǎn)生。研究中膨潤土處理組的果膠酯酶活性和果膠含量均有下降,其中果膠酯酶活性降低了50%以上,果膠含量下降了30% 左右。Milji? 等[44]在發(fā)酵前的李子果渣中加入了少量的單寧,在20 g/100 kg 和30 g/100 kg 的單寧用量下,果酒中甲醇含量下降了8%左右,作者認為更大劑量的添加會有更好的效果,但大劑量單寧會對果酒的風(fēng)味造成不良影響,影響果酒品質(zhì)。

Hou 等[51]在葡萄酒釀造過程中添加沒食子酸和香豆酸來減少酒中甲醇含量。結(jié)果表明,添加沒食子酸或香豆酸的樣品中,甲醇含量顯著低于對照組,下降了約45%。這表明在2 mg/L 水平下添加沒食子酸或香豆酸會減少酒中甲醇的含量。添加果膠酶解反應(yīng)生成物也被認為是一種潛在的降甲醇手段,Milji? 等[44]在梅子酒中添加了15 g/kg 果膠酸,使甲醇含量降低了10%。Wu 等[52]在楊桃酒中添加了愛玉子（FicusɑwɑkeosɑngMakino）果膠酯酶抑制劑（pectinesterase inhibitor,PEI）用于減少甲醇的產(chǎn)生,其中未經(jīng)處理的空白組甲醇含量為256 mL/1 000 L,而添加了PEI 的樣品則僅為58 mL/1 000 L。此外,有研究報道一種提取自獼猴桃中的果膠酯酶抑制劑,對多種植物（如橙子、蘋果、番茄、獼猴桃、柿子）果膠酯酶具有特異性抑制作用,但未見該果膠酯酶抑制劑在果酒中應(yīng)用的相關(guān)研究[53]。

果膠酸和膨潤土在果渣發(fā)酵酒中對甲醇含量的作用效果不夠理想,甲醇含量僅下降了15% 左右,雖然膨潤土在蘋果汁發(fā)酵酒中效果較好,但很多果酒更適用于帶渣發(fā)酵,使用膨潤土難以達到生產(chǎn)要求。而PEI 在研究中的表現(xiàn)更為優(yōu)異,在果酒甲醇控制方面有著良好的應(yīng)用潛力。還有許多抑制果膠酯酶的物質(zhì)未有在果酒釀造中的研究,使用外源添加物質(zhì)來調(diào)控甲醇還需要做更多的探索,尋找更具效率且仍能保證食用安全性的物質(zhì)。

3.4 蒸餾

除了抑制果膠酶解反應(yīng)以外,許多研究者采用蒸餾手段除去果酒中已經(jīng)存在的甲醇。在整個蒸餾過程中,餾出物被分離成3 個餾分:頭酒、中酒和尾酒。蒸餾會把一些不利于成品品質(zhì)的化學(xué)物分離至頭酒中,然后將其棄掉,從而保留最有價值的中酒部分（也稱為中心餾分）,但甲醇只能被部分分離到頭酒中,會同時存在于頭酒和中酒中[54]。在整個蒸餾過程中,各餾分中甲醇占比一直保持穩(wěn)定,沒有顯著下降[55]。因此,初次蒸餾很難除去酒中的甲醇,進行二次蒸餾才能有效去除這一有害物質(zhì)[36,54]。Zhang 等[56]對櫻桃酒的研究結(jié)果也證實了二次蒸餾能更有效降低甲醇含量。一次蒸餾后甲醇質(zhì)量濃度為1.57 g/L,二次蒸餾后下降為1.39 g/L。

Carvallo 等[57]通過建立準(zhǔn)確有效的模型來研究甲醇蒸餾技術(shù),對沸騰溫度、乙醇含量和餾出物流速的模擬結(jié)果誤差均小于2%。該模型可以使用計算機進行動態(tài)優(yōu)化,用以模擬不同操作參數(shù)對甲醇含量的影響,從而最大限度地減少甲醇含量,保留乙醇和香氣。一些模型研究也揭示了在蒸餾中對果酒甲醇含量影響較高的操作參數(shù),初始甲醇含量為2.3 g/L 的樣品在不同的操作參數(shù)下,甲醇濃度下降幅度為12.8% 到22.7%不等[58]。模型中不同操作因素對甲醇含量的影響存在差異,這種差異與在梨酒[59]和獼猴桃酒[60]蒸餾研究中觀察到的一致。分析結(jié)果表明,頭酒中酒分離所需的時間和頭酒階段結(jié)束時的降溫速度兩項參數(shù)對甲醇濃度的影響最大。除了蒸餾清除酒中的甲醇外,對某些甲醇含量高的果酒原料汁進行蒸餾也能一定程度上降低果酒中的甲醇。趙巖[61]使用分子蒸餾法實現(xiàn)了紅棗原料汁中82%的甲醇清除率。

與前面的控制方法相比,蒸餾去除甲醇效果并不理想,部分研究顯示一次蒸餾后甲醇含量幾乎不變,相對甲醇含量甚至有所升高。即使調(diào)整蒸餾工藝后甲醇下降的幅度也非常有限[54-56]。而二次蒸餾操作要求較高,成本也高,對于實際生產(chǎn)來說應(yīng)用困難。同時,由于蒸餾會改變酒類的風(fēng)味香氣,因此并非所有類型的果酒都適合蒸餾,尤其是低醇果酒和一些甜果酒并不適用于蒸餾。這些特點決定了蒸餾方法只適應(yīng)于那些本身甲醇含量較少的蒸餾型果酒。

3.5 其他傳統(tǒng)控制技術(shù)

除熱處理、釀酒酵母改良、外源物質(zhì)添加以及蒸餾4 類較為常見的方法外,研究者們也探究了一些其他方法用于控制最終產(chǎn)品中甲醇的含量,例如,在葡萄酒釀造過程中,選擇木制的容器可以減少成品中一定的甲醇。陳同強等[62]對比了不同發(fā)酵容器（塑料、木制、玻璃、陶瓷）對葡萄酒中甲醇含量的影響,其中木制容器釀造的葡萄酒中甲醇含量最少,推測可能與木材對甲醇有一定吸附作用相關(guān),但去除甲醇效果不明顯也不穩(wěn)定。

此外,陳釀作為常見的改善果酒成分的手段,往往也能降低果酒中甲醇的含量,陳釀蘋果酒的研究結(jié)果[63]表明,在陳釀初期6 個月內(nèi),甲醇含量呈現(xiàn)小幅度上升趨勢,隨后大幅度下降。陳釀1 年后,所有樣品中的甲醇濃度趨于穩(wěn)定。陳釀導(dǎo)致甲醇含量減少的原因尚不明確,可能是甲醇的蒸發(fā)和吸附導(dǎo)致的,也可能是酒液在成熟過程中發(fā)生的其他反應(yīng)所導(dǎo)致的,例如甲醇氧化成甲醛、甲醇的酯化、縮醛轉(zhuǎn)化。陳釀雖然能實現(xiàn)甲醇含量的下降,但其處理周期長,不利于實際生產(chǎn)應(yīng)用。

4 新興控制技術(shù)

傳統(tǒng)方法主要是通過加熱和添加外源物質(zhì)兩種手段來抑制果膠酶解反應(yīng),從而減少果酒中甲醇的含量。但隨著新興非熱加工技術(shù)的出現(xiàn),一些具備降解果膠能力的新興物理場技術(shù)有望應(yīng)用在果酒甲醇含量的控制上。除了直接降解果膠,運用非熱技術(shù)滅活果膠酶在理論上也是甲醇控制的一種有效途徑。這些新興技術(shù)（見表2）在果酒甲醇含量控制的應(yīng)用上潛力巨大。

表2 果酒甲醇的新興控制技術(shù)Table 2 New technology to control methanol content in fruit wine

5 結(jié)論與展望

隨著果酒市場的擴大與發(fā)展,越來越多的學(xué)者開始關(guān)注和研究果酒中甲醇含量的控制問題。一方面,傳統(tǒng)方法以發(fā)酵溫度、釀酒酵母的種屬、原料成分和果膠酶4 個果酒中甲醇含量影響因素為研究基礎(chǔ),發(fā)展出了熱處理、釀酒酵母的改良、外源物質(zhì)的添加以及蒸餾4 類主流的果酒甲醇控制技術(shù),但也仍存在損害酒品質(zhì)、應(yīng)用范圍受限等局限性。另一方面,超聲波、脈沖電場、超高壓等非熱加工技術(shù)在果膠降解和果膠酶滅活上的優(yōu)異效果使其在果酒甲醇控制上表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力,但在生產(chǎn)上的應(yīng)用還需要進一步的探索。對果酒品質(zhì)損害更小、效果更顯著、應(yīng)用范圍更廣的果酒甲醇控制技術(shù)有待成為未來果酒研究的重點,這將為果酒行業(yè)的發(fā)展提供有力的技術(shù)支持。