劉洋洋，袁源，陳龍，李如一，奎杰，李積華*，廖良坤*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524001）

花椒（ZɑnthoxylumbungeɑnumMaxim.）是蕓香科、花椒屬植物的果皮,是典型的“藥食同源”作物。全世界大約有260 種花椒,我國(guó)目前栽培約有39 種[1]。我國(guó)是花椒第一生產(chǎn)大國(guó),主產(chǎn)區(qū)為河北、陜西、山西、四川、云南等地。最新研究表明,花椒中含有生物堿、香豆素、類(lèi)固醇、萜類(lèi)等化學(xué)成分,具有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血脂、抑制單胺氧化酶等生物活性[2]?；ń分械穆槲端厥且活?lèi)生物堿類(lèi)化合物,作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑[3],能夠改善小鼠的糖脂代謝紊亂,具有潛在的2-型糖尿病治療作用[4]。

多酚是一類(lèi)具有多元酚結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng),廣泛存在于植物體內(nèi)。研究表明,多酚可以防止紫外線破壞膠原蛋白的合成,起到抗衰老的作用[5]。多酚是大量草本植物及植物果實(shí)的主要抗氧化活性物質(zhì)[6],可以通過(guò)清除自由基,起到預(yù)防腫瘤、保護(hù)心腦血管、治療或預(yù)防人體慢性疾病的作用。針對(duì)多酚、黃酮類(lèi)化合物的分析和鑒定,是食品及中醫(yī)藥領(lǐng)域的熱門(mén)方向之一。石青浩等[7]通過(guò)高效液相色譜電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS）方法鑒定鼠曲草乙醇提取物中含有11 種多酚類(lèi)化合物,包括8 種黃酮類(lèi)化合物和3 種酚酸類(lèi)化合物。李帆等[8]采用代謝組學(xué)技術(shù)從鐵皮石斛樣品中分析出202 種黃酮類(lèi)化合物?；ń分泻胸S富的多酚類(lèi)化合物,孟憲華等[2]通過(guò)分離純化鑒定手段,鑒定出青花椒中12 種多酚糖苷類(lèi)化合物,并發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化活性。

本文以河北石家莊、江蘇徐州、陜西安康、陜西韓城、四川汶川、四川儀隴、湖北宜昌、云南昭通六省八地的大紅袍花椒為原料,采用超高壓液相色譜串聯(lián)高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ultra high performance liquid chromatography tandem triple TOF high resolution mass spectrometry,UPLC-Triple TOF MS/MS）方法,鑒定多酚類(lèi)物質(zhì)并進(jìn)行定量分析。此外,通過(guò)主成分分析法對(duì)8 個(gè)產(chǎn)地花椒進(jìn)行分類(lèi)描述,進(jìn)而從多酚含量角度,闡述不同產(chǎn)地花椒之間的差異性,以期為花椒加工綜合利用,如花椒精油提取等企業(yè)的加工廢棄物多層次開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大紅袍花椒:江蘇金椒鴻香料科技研究院有限公司,來(lái)源于石家莊、徐州、安康、韓城、汶川、儀隴、宜昌、昭通8 個(gè)基地。

金絲桃苷、綠原酸、槲皮苷、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品:上海麥克林生化科技有限公司；咖啡酸、7-羥基香豆素、山奈酚、秦皮乙素、原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司；表兒茶素、阿魏酸、兒茶素、槲皮素、香草酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品:阿拉丁試劑（上海）有限公司；原兒茶酸、石吊蘭素標(biāo)準(zhǔn)品:北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）:美國(guó)Sigma 公司。除特殊標(biāo)注外,所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Eksigent ekspert ultraLC 110-XL 超高效液相色譜儀、Triple TOFTM5600+電噴霧飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀:美國(guó)SCIEX 公司；CPA225D 電子分析天平:德國(guó)賽多利斯公司；HAS-2000 型超聲波清洗機(jī):深圳市好順超聲設(shè)備有限公司；MJ-BL25B3 研磨機(jī):九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

干花椒去梗、去籽,研磨粉碎后過(guò)40 目篩。稱(chēng)取5 g 花椒粉末置于250 mL 具塞三角瓶中,加入50 mL 80%乙醇,超聲輔助提取60 min,反復(fù)提取3 次。合并濾液并抽濾,60 ℃真空濃縮至5 mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱(chēng)取綠原酸、咖啡酸、香草酸等17 種標(biāo)準(zhǔn)品各0.2 mg,用2 mL 50%甲醇溶液溶解。繼續(xù)使用50%甲醇溶液對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋至適當(dāng)檢測(cè)濃度。

1.3.3 液質(zhì)聯(lián)用分析

色譜條件:ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm）；流動(dòng)相:100% 乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B）,梯度洗脫:0～3 min,5%～12%A；3～33 min,12%～20% A；33～48 min,20%～35% A；48～50 min,35%～80%A。采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,進(jìn)樣量為5μL,柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件:通過(guò)全掃描獲得一級(jí)譜圖,并通過(guò)數(shù)據(jù)采集模式獲得二級(jí)譜圖。電噴霧離子源:負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；離子源霧化氣:55 psi（1 psi=6 894.757 Pa）；輔助加熱氣:55 psi；氣簾氣:40 psi；輔助加熱溫度:550 ℃；噴霧電壓:-4 500 V；去簇電壓:-80 V；碰撞能一級(jí)-10 V,二級(jí)-35 eV；擴(kuò)展碰撞能量:15 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采取3 次平行試驗(yàn),Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析；質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peak ViewTM2.0 譜圖數(shù)據(jù)分析處理工作站進(jìn)行處理,采用Multi QuantTM3.0 工作站進(jìn)行標(biāo)曲繪制及定量分析；采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性及主成分分析；采用ChemDraw 繪制質(zhì)譜裂解圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地花椒的UPLC-Triple TOF MS/MS檢測(cè),并經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)文獻(xiàn)等比對(duì)分析后,在8 個(gè)產(chǎn)地花椒中共檢測(cè)出35 種多酚類(lèi)物質(zhì),其中酚酸類(lèi)物質(zhì)10 種、黃酮類(lèi)物質(zhì)20 種、苯丙素類(lèi)（香豆素類(lèi)）物質(zhì)4 種和1 種酚醛類(lèi)物質(zhì),具體裂解規(guī)律如表1 所示。

表1 花椒中多酚類(lèi)化合物的鑒定Table 1 Identification of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表1 可知,花椒中發(fā)現(xiàn)的酚酸類(lèi)化合物主要為羥基苯甲酸類(lèi)和苯丙酸類(lèi)兩類(lèi)化合物。以化合物3 為例,其分子離子峰為m/z 315[M-H]-,其主要碎片離子有m/z 153[M-H-Glu]-、m/z 109[M-H-Glu-CO2]-、m/z 91[M-H-Glu-CO2-H2O]-,結(jié)合Zhong 等[9]研究結(jié)果,鑒定其為原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷,其裂解途徑如圖1 所示。

圖1 原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷裂解途徑Fig.1 Mass fragmentation pathways of protocatechuic acid 4-O-glucoside

花椒中20 種黃酮類(lèi)化合物多以槲皮素和山奈酚衍生物為主,如化合物16,比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品被鑒定為槲皮苷。分子離子峰m/z 447 經(jīng)斷裂而失去一分子鼠李糖形成苷元碎片m/z 301。苷元碎片C 環(huán)的RDA 裂解可丟失中性片段—C7H2O4形成m/z 151 碎片；或在電離過(guò)程中失去CO,形成m/z 271[M-H-Rha-2H-CO]和255[MH-Rha-CO-OH]兩個(gè)片段。

4 種香豆素類(lèi)化合物（化合物31～34）秦皮乙素、7-羥基香豆素、6-羥基-7-甲氧基香豆素和8-羥基-6,7-二甲氧基香豆素,其分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似,主體化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 香豆素類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of coumarins

質(zhì)譜碎裂方式也類(lèi)似。以秦皮乙素為例,具有最高豐度（100%）的分子離子峰m/z 177 [M-H]-片段,在連續(xù)脫離一分子CO,一分子CO2后形成碎片m/z 149和m/z 105?；蛘?分子離子峰m/z 177 連續(xù)斷裂2 分子CO2而形成m/z 133 和m/z 89 片段,秦皮乙素裂解途徑如圖3 所示。

圖3 秦皮乙素裂解途徑Fig.3 Mass fragmentation pathways of esculetin

2.2 多酚類(lèi)化合物的定量分析

花椒中多酚類(lèi)化合物的定量分析見(jiàn)表2。

表2 花椒中多酚類(lèi)化合物的定量分析Table 2 Quantitative analysis of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表2 可以看出,綠原酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮苷、金絲桃苷、原花青素B2等多酚類(lèi)化合物含量較高,其中綠原酸、槲皮苷和金絲桃苷含量最高,這與Yang等[20]的結(jié)果一致。

金絲桃苷是黃酮類(lèi)物質(zhì)中含量最為豐富的一類(lèi),在8 個(gè)產(chǎn)地花椒中均有較高分布,其中宜昌產(chǎn)花椒金絲桃苷量高達(dá)（3 787.8±8.7）μg/g。槲皮素、異鼠李素在結(jié)構(gòu)上僅相差一個(gè)—OCH3,而在含量分布上,兩者也比較相似,徐州、石家莊、韓城、宜昌四地樣品中均檢出。兒茶素和表兒茶素是一對(duì)同分異構(gòu)體,是構(gòu)成原花青素類(lèi)物質(zhì)的基本組成單位,在不同產(chǎn)地中均有較高分布,較高的兒茶素含量與原花青素含量具有正相關(guān)。在所有產(chǎn)地的花椒中,兒茶素的含量整體高于表兒茶素,并且基本維持在2∶1 的比例關(guān)系。

秦皮乙素和7-羥基香豆素是香豆素類(lèi)衍生物。7-羥基香豆素也是唯一一種存在于所有8 個(gè)產(chǎn)地的香豆素類(lèi)物質(zhì),其中徐州產(chǎn)地花椒含量最多,為（137.0±2.0）μg/g,秦皮乙素在石家莊和韓城兩地樣品中沒(méi)有檢出,與石吊蘭素似乎有一種不相容的現(xiàn)象。在所有6 個(gè)產(chǎn)地中,秦皮乙素的含量分布差異最大,安康花椒幾乎是昭通的15 倍,是含量汶川樣品的2.7 倍。

綜上,安康樣品的多酚含量較高,在被定量的17 種物質(zhì)中,原兒茶酸（212.9±10.4）μg/g、沒(méi)食子酸（5.4±0.1）μg/g、秦皮乙素（1 208.0±35.7）μg/g、兒茶素（2 782.7±17.3）μg/g、表兒茶素（1 449.9±6.3）μg/g、槲皮苷（3 099.0±33.4）μg/g 和原花青素B2（2 432.5±37.3）μg/g 7 種物質(zhì)含量最高。

2.3 花椒多酚相關(guān)性分析

將不同產(chǎn)地來(lái)源花椒的17 種多酚物質(zhì)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 花椒多酚間的皮爾遜相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis of polyphenols in Zanthoxylum bungeanum

由表3 可知,原兒茶酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、秦皮乙素、原花青素6 種物質(zhì)相互之間存在極顯著正相關(guān)（P<0.01）,與異鼠李素、槲皮素呈負(fù)相關(guān)。而咖啡酸、香草酸、羥基香豆素、金絲桃苷呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）,與異鼠李素和槲皮素呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。阿魏酸與其它16 種酚類(lèi)物質(zhì)無(wú)論在正向還是負(fù)向上均沒(méi)有顯著相關(guān)性,石吊蘭素由于僅在韓城和石家莊樣品中有所發(fā)現(xiàn),因此與其它酚類(lèi)物質(zhì)相關(guān)性也不大。此外,綠原酸、山奈酚、槲皮苷3 種物質(zhì)與其它酚類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)性較小,這些物質(zhì)對(duì)后續(xù)的主成分分析均有很大影響,因此沒(méi)有被作為變量進(jìn)行后續(xù)的主成分分析。

2.4 主成分分析及綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)多酚物質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果,將12 種相關(guān)性多酚物質(zhì)作為指標(biāo),采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣、特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 4 Rotated component matrix，eigenvalue and variance contribution rate

由表4 可知,特征值大于1 的主成分共有3 個(gè),累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為92.696%,能夠代替原有的12 個(gè)指標(biāo),達(dá)到降維目的。

表4 反映了各個(gè)指標(biāo)作用,第一主成分代表槲皮素、異鼠李素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素5 種黃酮類(lèi)物質(zhì),其方差貢獻(xiàn)率為36.419%,其中槲皮素和異鼠李素與其它3 種化合物呈負(fù)相關(guān)；第二主成分主要代表沒(méi)食子酸、秦皮乙素和原兒茶酸3 種物質(zhì),是以酚酸類(lèi)物質(zhì)為主導(dǎo)的多酚化合物,其方差貢獻(xiàn)率為28.579%；第三主成分主要代表咖啡酸、香草酸和7-羥基香豆素,是以苯丙素為主體的多酚化合物,其方差貢獻(xiàn)率為27.698%。根據(jù)得分系數(shù)矩陣中各個(gè)成分對(duì)應(yīng)的得分系數(shù)為特征向量,構(gòu)建主成分得分表達(dá)式如下。

F1=0.088X1-0.314X2-0.078X3-0.146X4-0.230X5-0.394X6+0.036X7+0.211X8+0.207X9-0.114X10+0.236X11。

F2=-0.043X1+0.195X2+0.157X3+0.398X4+0.468X5+0.225X6-0.044X7-0.016X8-0.012X9+0.355X10-0.046X11。

F3=0.338X1+0.113X2+0.314X3+0.067X4-0.007X5-0.063X6+0.308X7+0.024X8-0.005X9+0.007X10+0.035X11。

以方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重,構(gòu)建花椒綜合評(píng)價(jià)模型:Dn=36.419%F1+28.579%F2+27.698%F3,并計(jì)算綜合得分,結(jié)果如表5 所示。

表5 各主成分綜合得分Table 5 Comprehensive score of each principal component

3 結(jié)論

我國(guó)花椒產(chǎn)地較多,尤其以西南地區(qū)品質(zhì)較佳。儀隴、韓城的大紅袍等優(yōu)質(zhì)紅椒產(chǎn)區(qū)均是建立在以香氣濃郁、麻味醇厚的基礎(chǔ)上,更符合調(diào)味品的分類(lèi)方式。本文選取六省八地大紅袍花椒,以多酚類(lèi)活性物質(zhì)為指標(biāo),對(duì)不同產(chǎn)地花椒進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),安康、宜昌、徐州的花椒多酚類(lèi)物質(zhì)總體含量較高,處于前三位置。盡管花椒生長(zhǎng)并不需要大量水分,但三地優(yōu)越的水文條件很有可能是酚類(lèi)物質(zhì)聚集的原因。而傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)四川儀隴及汶川地區(qū),花椒多酚產(chǎn)量居中,優(yōu)于昭通、韓城、石家莊三地。

通過(guò)UPLC-Triple TOF MS/MS 定性定量分析發(fā)現(xiàn),8 個(gè)產(chǎn)地花椒不僅在多酚種類(lèi)分布上存在特異性,在含量上也有顯著差別。被鑒定的35 種多酚類(lèi)物質(zhì)中,僅有18 種多酚分布在全部樣品中,并且其中7 種為酚酸類(lèi)物質(zhì)。酚酸類(lèi)物質(zhì)在植物體內(nèi)是構(gòu)成木質(zhì)素、細(xì)胞壁基本成分,因此在各種植物體內(nèi)均有分布。在定量分析中發(fā)現(xiàn),含量越高的物質(zhì),越傾向于更廣的分布。槲皮苷和金絲桃苷是花椒中含量最為豐富的兩種黃酮類(lèi)化合物,在8 個(gè)產(chǎn)地中的分布較為均衡。而石吊蘭素、異鼠李素、槲皮素等含量較低的酚類(lèi)物質(zhì),分布較少,且集中分布在石家莊和韓城。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),兒茶素和表兒茶素的含量,存在一個(gè)穩(wěn)定的關(guān)系,這需要進(jìn)一步的代謝機(jī)制分析。本文首次對(duì)大紅袍花椒中的多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,并對(duì)其分布差異和含量差異做了總結(jié)分析,并以含量差異為指標(biāo),對(duì)花椒物質(zhì)做了評(píng)價(jià)分析,為花椒產(chǎn)業(yè)深加工、提質(zhì)增效提供數(shù)據(jù)支撐。