成桂紅，杜天奇，李惠敏，吳惠華，王馥新，孟慶霞

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心,蘇州 215002)

卵巢組織冷凍與移植作為保存女性生育能力的一種新興技術(shù),可為年輕女性惡性腫瘤、卵巢早衰及嚴(yán)重的子宮內(nèi)膜異位癥的患者保留生育能力。目前我國(guó)已有第一例卵巢組織冷凍移植后的寶寶在北京誕生,該女?huà)肽赣H凍存了6 塊卵巢皮質(zhì)組織,移植后27 個(gè)月自然妊娠[1-2]。卵巢組織移植過(guò)程中的缺血性損傷是影響移植物存活及加速卵泡閉鎖致卵泡耗竭的主要原因,因此如何減少缺血性卵泡損傷成為需解決的一大難題。目前,有研究報(bào)道應(yīng)用抗氧化劑[3]、抗凋亡劑[4]、干細(xì)胞[5]、3D卵巢[6]及激素[7-8]等可以提高卵巢組織冷凍與移植后的卵泡存活率。近年來(lái),研究者們開(kāi)展了關(guān)于干細(xì)胞的研究,我們將在本綜述著重介紹不同組織來(lái)源的干細(xì)胞改善卵巢組織冷凍與移植后卵泡存活的研究進(jìn)展及其機(jī)制,并展望在生育力保存尤其是卵巢組織冷凍移植中的臨床應(yīng)用前景。

一、干細(xì)胞改善卵泡存活的機(jī)制及研究進(jìn)展

1.間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs):間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為三個(gè)胚層,具有參與組織損傷修復(fù)的功能及抗炎、抗氧化、抗凋亡等特性。

(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC):近年相關(guān)研究顯示,BMSC可以通過(guò)自分泌或旁分泌的機(jī)制促進(jìn)凍融卵巢組織自體移植的卵泡發(fā)育及卵巢功能恢復(fù)。Xia等[9]將MSCs與卵巢皮質(zhì)組織移植,推測(cè)MSCs可能通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)生長(zhǎng)因子2(FGF2)、血管生成素(ANG)等血管生成因子,促進(jìn)凍融卵巢組織移植物中新生血管持久生成,增加血液灌注進(jìn)而減少原始卵泡凋亡。Zhang等[10]進(jìn)一步使用細(xì)胞因子微陣列技術(shù)明確人卵巢組織共移植MSCs中與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵特異性分泌因子--ANG,首次表明MSCs通過(guò)ANG介導(dǎo)異種移植人類(lèi)卵巢組織中的血管生成和卵泡存活。此外,MSCs分泌血管生成因子還可誘導(dǎo)卵泡發(fā)育基因上調(diào),Hosseini等[11]將凍融人卵巢皮片組織片段與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)8 d,發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育相關(guān)基因生殖系a因子(FIGLA)、生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)、卵泡生成素受體(FSHR)及雌二醇(E2)的表達(dá)改善早期卵泡發(fā)育及存活,進(jìn)而改善卵巢功能可改善人卵泡原位激活和冷凍卵巢組織的早期發(fā)育。

(2)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC):UCMSC是一種對(duì)卵巢冷凍移植有顯著治療潛力的干細(xì)胞。Jia等[12]使用人UCMSC條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人凍融卵巢組織,發(fā)現(xiàn)早期卵泡發(fā)育、細(xì)胞增殖和E2分泌得到改善,凋亡細(xì)胞減少,并促進(jìn)微血管生成,表明UCMSC具有細(xì)胞保護(hù)作用和較高的抗凋亡特性,首次發(fā)現(xiàn)MSCs促進(jìn)體外培養(yǎng)系統(tǒng)中凍融卵巢的恢復(fù),參與保護(hù)過(guò)程可能與其旁分泌活性有關(guān)。Xu等[5]使用Matrigel的簡(jiǎn)單體外三維卵巢培養(yǎng)系統(tǒng)將凍融卵巢與干細(xì)胞共培養(yǎng),進(jìn)一步表明UCMSC在體外卵巢培養(yǎng)系統(tǒng)中通過(guò)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)凍融卵巢血管生成;缺氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞可以增強(qiáng)血管生成的潛力,Cheng等[13]將UCMSC置于缺氧培養(yǎng)箱(3%O2,37℃)中培養(yǎng)48 h進(jìn)行缺氧預(yù)處理后與卵巢組織異種移植,通過(guò)PI3K/Akt/HIF 1a/VEGF/Akt信號(hào)通路途徑增加CD34、CD1和VEGFA的高表達(dá)促進(jìn)早期血管生成,進(jìn)而改善卵泡存活率;并顯著降低細(xì)胞凋亡,進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡死亡,保護(hù)靜息的原始卵泡池,可能與HIF-1/VEGFA信號(hào)通路有關(guān)。以上MSCs對(duì)凍融卵巢的保護(hù)機(jī)制可能成為提高冷凍卵巢組織移植的治療策略。

(3)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCS):ASCS具有多譜系分化潛力、促血管生成特性以及增強(qiáng)異種移植人卵巢組織中血管形成的能力的作用[14],受到研究者的廣泛關(guān)注。Damous等[15]將ASCS注射到成年雌性Wistar大鼠新鮮移植的卵巢,發(fā)現(xiàn)較早恢復(fù)發(fā)情期和增加卵巢組織中血管數(shù)量,不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞增殖,因此ASCS治療自體新鮮卵巢移植物可行且安全。邢彥彥等[16]研究也表明,大鼠卵巢自體移植過(guò)程中應(yīng)用ASCS可改善大鼠卵巢自體移植效果,提高移植效率。然而直接注射ASCS至凍融移植物會(huì)造成細(xì)胞損失,并可能損害已脆弱的組織。近年來(lái),細(xì)胞治療已與組織工程技術(shù)相關(guān)聯(lián),以增強(qiáng)細(xì)胞在靶組織中的釋放和保留。Damous等[17]將明膠凝膠泡沫海綿作為大鼠凍融卵巢自體移植物中ASCS治療的支架,發(fā)現(xiàn)體外與干細(xì)胞共培養(yǎng)可保持干細(xì)胞活力長(zhǎng)達(dá)5 d,使促血管生成因子的緩慢持續(xù)釋放達(dá)到治療水平;體內(nèi)可以促進(jìn)大鼠雌孕激素恢復(fù),且不干擾卵巢卵泡、纖維化、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞增殖的數(shù)量和活力,提出凝膠泡沫支架作為細(xì)胞支架可能是治療凍融卵巢自體移植物的ASC遞送的一種可行且安全的非侵入性技術(shù)。干細(xì)胞分泌組包含許多分子和生長(zhǎng)因子,分泌組的使用可能是一種新的細(xì)胞治療方法[18]。Damous等[19]將大鼠ASCS分泌組注射至雙側(cè)自體移植凍融卵巢中,發(fā)現(xiàn)移植物形態(tài)學(xué)受損、卵泡數(shù)量減少和細(xì)胞凋亡增加,表明ASCS分泌組的無(wú)細(xì)胞治療加重了對(duì)缺氧的卵巢移植物缺血損傷,提示在卵巢移植中應(yīng)用分泌組要謹(jǐn)慎,未來(lái)需要更多的研究來(lái)評(píng)估所涉及的因素以及將分泌組應(yīng)用于支架中以?xún)?yōu)化其使用的可能性。近年來(lái),研究者們逐漸開(kāi)展ASCS對(duì)異種凍融卵巢移植的研究。Manavella 等[20]將裝載ASC的纖維蛋白植入物與人卵巢組織異種共移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠腹膜,發(fā)現(xiàn)ASC可分化為人內(nèi)皮細(xì)胞譜系,并增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá),進(jìn)而改善卵巢組織血流灌注;Cacciottola等[21]發(fā)現(xiàn)使用異種凍融卵巢移植前14 d,將裝載ASCs的纖維蛋白支架移植到移植部位,可加快卵巢移植物再灌注以減輕缺氧相關(guān)反應(yīng),組織中的卵泡顯示出較低水平的HIF1信號(hào)通路的激活,并通過(guò)移植后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)期增加來(lái)維持;無(wú)論采用何種移植策略,氧化應(yīng)激相關(guān)的核因子紅系相關(guān)因子2及提示卵母細(xì)胞DNA損傷的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷均無(wú)顯著升高,未發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)損傷的證據(jù)。Cacciottola 等[22]將ASCS預(yù)處理的凍融人卵巢組織移植入裸鼠,發(fā)現(xiàn)ASCS通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑減少原始卵泡活化,并抑制Hippo通路抑制卵泡生長(zhǎng),最終保護(hù)原始卵泡池,對(duì)卵巢儲(chǔ)備產(chǎn)生積極影響。Damous 等[23]將凍融大鼠卵巢自體移植物經(jīng)ASC治療后,發(fā)現(xiàn)ASC在短時(shí)間內(nèi)不影響卵巢移植物形態(tài)和活力的情況下,促進(jìn)了與細(xì)胞凋亡Capsase14和炎性細(xì)胞因子Cxcl6家族相關(guān)的基因的過(guò)度表達(dá),但細(xì)胞凋亡和炎癥對(duì)移植物的長(zhǎng)期影響有待進(jìn)一步研究。因此,脂肪干細(xì)胞療法對(duì)于卵巢移植物的影響有可能是雙面性的,需進(jìn)行長(zhǎng)期評(píng)估獲得更全面的認(rèn)知。

2.其他源性干細(xì)胞:除了MSCs在卵巢冷凍移植應(yīng)用較多以外,其他源性干細(xì)胞等也可改善移植后卵泡存活。Dalman等[24]將人冷凍保存的碎片卵巢組織與源自膜腔干細(xì)胞的人膜祖細(xì)胞(hTPCs)共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)卵泡顯著生長(zhǎng),卵母細(xì)胞中卵泡生成相關(guān)基因如透明帶糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)和GDF9的表達(dá)、顆粒細(xì)胞中的AMH和膜細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)的表達(dá)均顯著增高,而細(xì)胞凋亡基因(Bax、Casp3和p53)的表達(dá)顯著較低,說(shuō)明hTPCs在人類(lèi)原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中有直接促進(jìn)作用。極小胚胎樣干細(xì)胞(VSELs)在女性生殖系統(tǒng)中在發(fā)育上等同晚期遷移的原始生殖細(xì)胞,存在于成年性腺中,可為正?；蚴軗p的卵巢[25-26]提供間質(zhì)細(xì)胞來(lái)支持其功能,在腫瘤治療中因其靜止性質(zhì)存留下來(lái)并再生非功能性性腺,它的存在也解釋了卵巢皮質(zhì)組織移植后的自然妊娠[26]。Ebrahim等[27]研究表示,對(duì)于經(jīng)環(huán)磷酰胺化學(xué)消融受損的卵巢,骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合促性腺激素治療通過(guò)增強(qiáng)極小胚胎樣干細(xì)胞恢復(fù)大鼠化學(xué)消融卵巢的出生后的卵子發(fā)生,VSELs產(chǎn)生未成熟的卵母細(xì)胞并抵抗化療。然而有研究表明VSEL樣干細(xì)胞作為潛在的原始胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞與精子結(jié)合迅速釋放出透明帶樣結(jié)構(gòu),卻未產(chǎn)生受精現(xiàn)象[28],且部分可自發(fā)形成類(lèi)似腫瘤樣結(jié)構(gòu)細(xì)胞簇并參與卵巢癌表現(xiàn),包括復(fù)發(fā)性卵巢癌伴腹水[29]。因此極小胚胎干細(xì)胞是干細(xì)胞促進(jìn)卵泡新生的一個(gè)可能的新的研究方向,但是否能夠正常受精以及致癌性還是值得進(jìn)一步研究。

二、臨床應(yīng)用與展望

干細(xì)胞通過(guò)各種機(jī)制對(duì)卵巢冷凍移植發(fā)揮治療作用,以上實(shí)驗(yàn)研究共同表明它可促進(jìn)凍融卵巢血管生成、恢復(fù)卵巢功能并激活卵泡,在未來(lái)卵巢冷凍移植中有著巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而,就目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看,干細(xì)胞想要實(shí)現(xiàn)臨床引用,仍有許多待解決的難題。第一,干細(xì)胞具有多分化潛能,有分化成惡性腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn);并且如何檢測(cè)移植組織中腫瘤細(xì)胞的存在及避免卵巢組織移植后癌細(xì)胞復(fù)發(fā)仍是臨床較大的難題。盡管已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明將完全緩解的白血病患者的冷凍保存卵巢皮層移植入裸鼠,20 周后未檢測(cè)到明顯的惡性細(xì)胞[30],但由于有引入疾病的風(fēng)險(xiǎn),該方法的未來(lái)安全性需要開(kāi)發(fā)有效的測(cè)試來(lái)檢測(cè)。第二,用干細(xì)胞改善卵巢組織冷凍與移植后造成的卵泡損傷,目前僅僅評(píng)估了其對(duì)移植物早期血管生成與卵泡恢復(fù)的作用,未來(lái)的研究應(yīng)評(píng)估這種治療對(duì)移植物存活和內(nèi)分泌活性的真正益處。但長(zhǎng)期的效應(yīng)仍需要繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究獲得更科學(xué)全面的認(rèn)知。第三,對(duì)于干細(xì)胞新生卵泡是否可以進(jìn)行正常受精并獲得妊娠,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究確認(rèn)。第四,將卵巢組織移植引入臨床實(shí)踐需要解決許多問(wèn)題,如凍融協(xié)議的標(biāo)準(zhǔn)化、選擇卵巢移植手術(shù)的時(shí)間等。目前2015年報(bào)道了在月經(jīng)初潮前冷凍保存的卵巢組織進(jìn)行卵巢組織自體移植后成功恢復(fù)生育能力,并實(shí)現(xiàn)活產(chǎn),因此兒童期進(jìn)行手術(shù)是可行的[31]。第五,移植技術(shù)的改進(jìn),如移植支架與組織的兼容性得到證實(shí),2016年報(bào)道了有研究用人細(xì)胞外基質(zhì)支架對(duì)先前冷凍保存的卵巢組織使用機(jī)器人輔助微創(chuàng)手術(shù)微創(chuàng)移植移植后的首次妊娠及活產(chǎn)[32]。近年來(lái)有研究者使用無(wú)細(xì)胞支架以接種不同類(lèi)型的干細(xì)胞用于卵巢修復(fù)及更安全地促進(jìn)新生卵泡[33]。因此干細(xì)胞療法對(duì)于卵巢的影響有可能是雙面性的,需要全面提高干細(xì)胞的認(rèn)知并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)冷凍卵巢的安全性及有效性,并在未來(lái)推廣至臨床疾病的治療。

干細(xì)胞療法可以保護(hù)原始卵泡、抗凋亡、激活卵泡,促進(jìn)卵巢血管生成和功能恢復(fù),將來(lái)有可能成為癌癥及卵巢早衰患者生育力保存的新選擇。但該技術(shù)對(duì)卵巢冷凍與移植的安全性以及長(zhǎng)期效應(yīng)仍是未知的,并且干細(xì)胞用于卵巢組織低溫保存和移植尚未在人類(lèi)臨床實(shí)施,將這些方法用于人類(lèi)治療還需要進(jìn)一步的研究。因此探索干細(xì)胞改善卵巢組織冷凍與保存的最佳安全方案及長(zhǎng)期效應(yīng)仍是未來(lái)該領(lǐng)域的研究方向。