賈偉娟，王海鋒，付明山，趙心悅，包雨鑫*，張強(qiáng)

1.內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古通遼 028000；

2.內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，內(nèi)蒙古通遼 028000

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrh，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrh virus，BVDV）感染牛而引起病牛出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、腹瀉、發(fā)育遲緩以及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎為主要特征的1 種急性、高度接觸性傳染病[1-2]。該病的易感動(dòng)物以牛為主，其中，幼犢最易感且死亡率較高；此外，其還可感染豬、羊、駱駝等動(dòng)物[3-4]。

目前，該病被我國(guó)認(rèn)定為三類(lèi)傳染病，感染后發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，除了導(dǎo)致呼吸道和消化道損傷、生殖障礙及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩?fù)?，還可引起繼發(fā)性感染與持續(xù)感染，嚴(yán)重危害我國(guó)肉牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，也給肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

臨床上常用的檢測(cè)方法主要包括病毒的分離鑒定、核酸檢測(cè)技術(shù)、血清學(xué)檢測(cè)方法，不同檢測(cè)方法的特異性、敏感性、適用的場(chǎng)景及所需的時(shí)間也不同，本文綜述了BVDV 常用的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為BVDV的檢測(cè)、診斷及防控提供思路。

1 BVDV病原特性

BVDV是隸屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），有外膜、有纖突、形狀為球形的單股正鏈RNA 病毒，長(zhǎng)12.3～12.8 kb；包括3 種不同的基因型，即BVDV-1、BVDV-2 和BVDV-3，每種基因型也被分成了不同的亞型，在我國(guó)主要流行的是BVDV-1 型的1 m～1 v[6-8]。一般，BVDV 病毒粒子的直徑為40～60 nm，極少部分的病毒粒子直徑超過(guò)65 nm，由擬核、核衣殼及脂雙層構(gòu)成[9]。BVDV 入侵宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和生存依靠的是宿主細(xì)胞的細(xì)胞組成成分和生物多樣性，因此，當(dāng)BVDV 侵入宿主機(jī)體后，其基因組會(huì)與宿主蛋白之間發(fā)生相互作用，從而使宿主細(xì)胞無(wú)法維持原有的活性和正常的生物學(xué)功能，由此使細(xì)胞發(fā)生病變死亡并引起機(jī)體持續(xù)性感染和繼發(fā)感染[10]。

BVDV 可以在胎牛腎細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、胎羊睪丸細(xì)胞等原代細(xì)胞中進(jìn)行傳代，與豬瘟病毒抗原關(guān)系密切，為同屬病毒；對(duì)氯仿、乙醚、胰酶等敏感，高溫條件下可殺滅該病毒，50 ℃ 60 min或100 ℃ 2 min可被完全滅活[11]。

2 檢測(cè)方法

目前，防控BVDV 最主要的方法是檢測(cè)持續(xù)感染（persistently infected，PI）動(dòng)物，消滅并防止PI 動(dòng)物在動(dòng)物種群中傳播至關(guān)重要，在初期階段尤其是在動(dòng)物出生不久后就對(duì)PI 動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于實(shí)施BVDV 的防控計(jì)劃來(lái)說(shuō)意義重大。現(xiàn)如今，針對(duì)BVDV 可用的檢測(cè)方法有很多，總體分為病毒分離法、核酸檢測(cè)法和血清學(xué)檢測(cè)法。每種檢測(cè)方法都有其各自的優(yōu)勢(shì)及弊端，需依據(jù)不同的診斷情況與動(dòng)物的年齡來(lái)選擇適合的檢測(cè)方法。

2.1 病毒分離鑒定

取患病動(dòng)物的組織樣本進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定BVDV 是實(shí)驗(yàn)室最基礎(chǔ)的鑒別診斷方法，同時(shí)也一直是診斷技術(shù)中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于多種不同的病毒以及新發(fā)流行病毒的鑒別診斷[12]?？刹杉臉颖景ú⌒蟮难骸⑴K器及淋巴組織等，將樣本進(jìn)行研磨、反復(fù)凍融、離心的方式處理，之后使用原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待病毒在細(xì)胞中進(jìn)行增殖后進(jìn)行鑒定和定量檢測(cè)[13]。王勤等[14]將采集的新鮮樣本經(jīng)反復(fù)凍融、研磨、離心處理后，接種于單層MDBK細(xì)胞盲傳10 代，之后利用RT-PCR 與間接免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)。盲傳10 代后，MDBK 細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮和拉網(wǎng)脫落等明顯的典型細(xì)胞病變，同時(shí)，RT-PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性、間接免疫熒光為特異性綠色熒光。王妍瑾等[15]通過(guò)將臨床樣品進(jìn)行破碎、離心處理后，將其接種于MDBK 細(xì)胞中盲傳5 代，隨后經(jīng)RT-PCR檢測(cè)并使用透射電鏡進(jìn)行觀察。盲傳5 代后，MDBK 細(xì)胞雖未明顯出現(xiàn)細(xì)胞病變，但RT-PCR 結(jié)果顯示陽(yáng)性，同時(shí)在透射電鏡下也觀察到呈球形、有外膜、直徑40～60 nm 的病毒顆粒。趙輝等[16]從寧夏地區(qū)采集牛全血，處理后接種至MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖，盲傳7 代后用寇氏法（Karber）公式來(lái)計(jì)算所分離病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50值），同時(shí)用透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。結(jié)果顯示，盲傳3代后，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡、聚集、形成空斑，之后不斷圓縮、死亡并脫落，傳至7代時(shí)，病變依舊明顯。電鏡下可見(jiàn)直徑40～60 nm的病毒粒子，測(cè)得病毒滴度為107.0TCID50/0.1 mL。王慧慧等[17]將牦牛血清中分離的病毒接種至MDBK細(xì)胞進(jìn)行傳代，觀察細(xì)胞病變，同時(shí)測(cè)定TCID50值。接種病毒后5 d，MDBK 細(xì)胞出現(xiàn)變圓、間隙增大、胞漿出現(xiàn)空泡，最后出現(xiàn)“蛛網(wǎng)”現(xiàn)象，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞病變。Kar‐ber 法測(cè)定的TCID50值為5.0×106.5/mL。雖然，病毒分離鑒定法重復(fù)性強(qiáng)，比較容易控制，但由于病毒分離法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高且屬于勞動(dòng)密集型，往往需要幾天時(shí)間才能完成，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，因此，該方法不適用于大規(guī)模的樣本監(jiān)測(cè)。

2.2 BVDV核酸檢測(cè)

隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)BVDV 的核酸方法除了常規(guī)PCR 之外，RT-PCR、微滴式數(shù)字RT-PCR（dd-PCR）、納米PCR、二溫式PCR 等檢測(cè)方法相繼出現(xiàn)。

鮑顯偉等[18]根據(jù)GenBank 中已經(jīng)公布的BVDV 5'-UTR 基因序列和牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV）的gB基因序列分別合成了特異性的引物，通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，最終建立了可以同時(shí)檢測(cè)BVDV 和IBRV 的雙重PCR 檢測(cè)方法，同時(shí)也測(cè)試了該方法的特異性、重復(fù)性及靈敏性。結(jié)果顯示，該方法對(duì)BVDV、IBRV、IBRV/BVDV 分別擴(kuò)增出198、500、500/198 bp 的特異性目的條帶，對(duì)其他牛病病毒和牛支原體的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；BVDV+IBRV 混合液中的BVDV 和IBRV 的最低檢測(cè)限分別為103、104copies/μL；經(jīng)3 次重復(fù)性試驗(yàn)后結(jié)果均無(wú)變化。而采用該方法檢測(cè)的79 份臨床可疑樣本中，BVDV、IBRV、IBRV+BVDV 的檢出率分別是12.66%、17.72%和8.86%，與BVDV 和IBRV 的單重PCR 的結(jié)果符合率分別為90.00%和93.33%，混合感染符合率達(dá)到100%。表明該研究所建立的BVDV 和IBRV 雙重PCR 檢測(cè)方法特異性、重復(fù)性、敏感性良好。為了能夠快速檢測(cè)BVDV 通用型及BVDV-1 型、BVDV-2 型的檢測(cè)方法，趙成瑩等[19]根據(jù)GenBank 中BVDV 5'-UTR 基因序列分別設(shè)計(jì)了BVDV 通用引物和BVDV-1 型、BDVD-2 型特異性引物，建立了BVDV 通用型RT-PCR 和BVDV-1 型、BVDV-2型分型RT-PCR并檢測(cè)了該方法的重復(fù)性、符合性和特異性。結(jié)果顯示，用這3 種檢測(cè)方法檢測(cè)其他病毒均為陰性，靈敏度分別為6.84、1.08、3.03 ng；BVDV 通用型RT-PCR 與BVDV-1 型分型RT-PCR、BVDV-2 型分型RT-PCR 檢測(cè)方法的符合率達(dá)100%。說(shuō)明建立的BVDV 通用型RT-PCR 與BVDV-1 型分型RT-PCR、BVDV-2 型分型RT-PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏性。梁洪等[20]根據(jù)GenBank 中豬源BVDV 和豬瘟病毒（clssical swine fever virus，CSFV）5'-UTR 基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，建立了既可檢測(cè)豬源BVDV又可檢測(cè)CSFV 的一步法雙重RT-PCR 方法。該方法分別對(duì)豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV 混合物擴(kuò)增出185、342、185、342 bp 的特異性條帶；對(duì)豬源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV 混合物的檢出靈敏度分別達(dá)0.95、0.85、8.0 ng；與豬源BVDV、CSFV一步法RT-PCR 檢測(cè)方法的符合率均為100%。在對(duì)94 份疑似CSFV 感染臨床病例樣品的檢測(cè)應(yīng)用中，豬源BVDV 陽(yáng)性率為14.89%，CSFV 陽(yáng)性率為24.47%，二者的混合感染率是5.32%。說(shuō)明該雙重RT-PCR 檢測(cè)方法的敏感性、重復(fù)性、特異性及臨床應(yīng)用性均良好，能夠作為快速鑒別檢測(cè)BVDV 和CSFV的檢測(cè)方法。

葉京飛等[21]設(shè)計(jì)了BVDV 的特異性引物和探針，在一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)法的基礎(chǔ)上，將RT-ddPCR 試驗(yàn)中的反轉(zhuǎn)錄酶、引物、退火溫度、探針濃度以及該方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，商品化數(shù)字PCR 試劑盒的配套試劑為該RT-ddPCR 方法的最佳反轉(zhuǎn)錄體系，引物和探針終濃度分別為900、250 nmol/L，最佳退火溫度為57 ℃；該方法對(duì)常規(guī)疫病的檢測(cè)結(jié)果為陰性，3.2 copies/μL 為最低檢測(cè)限，重復(fù)性好，且變異系數(shù)小于5%。表明葉京飛等[21]所建立的RT-ddPCR 方法的敏感性較高、對(duì)BVDV 的特異性較強(qiáng)、可重復(fù)性較好，可以作為BVDV 早期檢測(cè)的快速診斷技術(shù)。為了能夠同時(shí)檢測(cè)BVDV 和牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）2 種病原，魏宇等[22]建立了雙重納米R(shí)T-PCR 方法。該方法與牛其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好，使用該方法檢測(cè)33 份腹瀉牛的臨床樣品和25 份腹瀉鹿的臨床樣品，得出BVDV、BCoV 和2 種病原混合感染的牛樣品檢出率分別為15.15%、36.36%和6.06%；而鹿樣品感染BVDV、BCoV 和2 種病原混合感染的陽(yáng)性率分別為28%、8%和8%。敏感性試驗(yàn)的最低檢出限為1 fg，是常規(guī)RT-PCR 的10 倍。表明所建立的方法快速、靈敏且簡(jiǎn)捷，同時(shí)能夠適用于檢測(cè)大批量臨床樣品。范晴等[23]為了建立BVDV 的二溫式PCR 快速檢測(cè)方法，根據(jù)BVDV的5/端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物。結(jié)果顯示，該方法只擴(kuò)增BVDV 模板，檢測(cè)其他牛病病毒均為陰性；對(duì)BVDV 的RNA 最低可檢測(cè)到1 pg。

除上述方法外，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）作為新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無(wú)需特殊設(shè)備，不僅操作簡(jiǎn)單而且具有反應(yīng)時(shí)間較短、敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且特別適宜應(yīng)用于地方基層的檢測(cè)。雷麗霞[24]參考了已有檢測(cè)方法、在分析BVDV 基因組的基礎(chǔ)上建立了RPA 和LAMP 檢測(cè)方法。該LAMP 檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化后，最終確定了其反應(yīng)體系，最適反應(yīng)時(shí)間為50 min，最適反應(yīng)溫度為62 ℃；特異性結(jié)果表明，可以區(qū)分BVDV 毒株與腹瀉相關(guān)的其他毒株，具有良好的特異性；敏感性結(jié)果表明，1.9×102copies/nL是LAMP 的最低檢測(cè)限，靈敏度是普通PCR 的10倍。隨后，雷麗霞[24]根據(jù)BVDV基因組的5'-UTR基因序列，建立了BVDV 基礎(chǔ)RPA 檢測(cè)方法，確定其最適反應(yīng)時(shí)間為15 min，最適反應(yīng)溫度為37 ℃。以陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)_定基礎(chǔ)RPA的最低檢測(cè)限為1.9×102copies/nL，與LAMP的最低檢測(cè)限一致。最后，雷麗霞[24]在基礎(chǔ)RPA 的基礎(chǔ)上又建立了BVDV 的LFD-RPA 檢測(cè)方法，確定其最適反應(yīng)時(shí)間為15 min，最適反應(yīng)溫度為35 ℃。以cDNA 為模板梯度稀釋?zhuān)渥畹蜋z出量為5.8×10–2ng/L；以陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)_定其最低檢測(cè)限為1.9×102copies/nL，靈敏度與基礎(chǔ)RPA和LAMP的一致。

核酸檢測(cè)因具有特異性高、反應(yīng)快速的特點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用非常廣泛，細(xì)菌、真菌、病毒以及寄生蟲(chóng)等均可使用核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行病原的快速檢測(cè)。雖然PCR 檢測(cè)方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、操作不便等不足，但LAMP 和RPA 檢測(cè)技術(shù)不僅特異性高、反應(yīng)快速、靈敏性強(qiáng)、便于操作，而且對(duì)儀器設(shè)備要求低，為在野外環(huán)境的檢測(cè)與現(xiàn)場(chǎng)診斷提供了極大的便利。

2.3 BVDV血清學(xué)檢測(cè)

在BVDV 的血清學(xué)檢測(cè)中，最常使用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），不僅可以在短時(shí)間內(nèi)取得準(zhǔn)確的結(jié)果，而且操作便捷。葛玉鳳等[25]通過(guò)原核表達(dá)的方式，取得了BVDV 重組E2 蛋白，并利用其作為包被抗原建立了可以檢測(cè)BVDV 的間接ELISA 方法。結(jié)果顯示，通過(guò)此方法檢測(cè)其他病毒血清，結(jié)果均為陰性，BVDV 的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1:12 800；在組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)中，變異系數(shù)分別小于5%和10%，與中和試驗(yàn)的符合率為94.44%。魏偉[26]將BVDV NS3蛋白中1段具有免疫反應(yīng)型的重組片段作為包被抗原，建立了檢測(cè)BVDV 抗體的間接ELISA 方法。此方法與市場(chǎng)內(nèi)同類(lèi)試劑盒的符合率高達(dá)91.3%，與8 種臨床上常見(jiàn)牛病的血清無(wú)交叉反應(yīng)，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%。以上數(shù)據(jù)表明，該方法有較好的特異性和重復(fù)性。李倬等[27]制備了牛抗BVDV 及兔抗BVDV，通過(guò)超免疫血清的方式建立了檢測(cè)BVDV 的雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法。結(jié)果表明，100 μg/mL 為?？笲VDV IgG 的抗體包被質(zhì)量濃度，50 μg/mL 為兔抗BVDV IgG 抗體的最佳工作質(zhì)量濃度，反應(yīng)時(shí)間90 min，酶標(biāo)抗體的工作濃度是1:8 000，陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為OD490nm≥0.177，重復(fù)性小于10%，最低檢出限為1.87 μg/mL，與其他病原無(wú)交叉反應(yīng)。

ELISA 作為臨床上常規(guī)的檢測(cè)方法之一，一直被廣泛應(yīng)用，該方法既可以檢測(cè)組織及臟器培養(yǎng)物中的BVDV，又能夠用來(lái)監(jiān)測(cè)大規(guī)模牛群的BVDV抗體水平。但是由于該方法所需的特異性抗原制備比較困難，且易檢出假陽(yáng)性，也有一定的局限性。

3 展 望

一直以來(lái)，BVDV 嚴(yán)重危害我國(guó)乃至整個(gè)世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，給畜牧業(yè)帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)損失的原因主要是對(duì)其檢測(cè)不嚴(yán)格及活牛的流動(dòng)量變大。因此，加強(qiáng)對(duì)BVDV 的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)對(duì)制定BVDV 防控和凈化策略意義重大。研發(fā)快速、高效的檢測(cè)技術(shù)可以及時(shí)檢出畜群中存在或潛在的BVDV，能夠減少該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。由此可見(jiàn)，研發(fā)新型、高效的檢測(cè)方法至關(guān)重要。除上述提到的一些檢測(cè)方法外，很多新型的檢測(cè)技術(shù)也正在研發(fā)過(guò)程中，如金納米顆粒結(jié)合PCR 技術(shù)、基因芯片技術(shù)和交聯(lián)與非交聯(lián)探針金納米顆粒雜交技術(shù)等[28-30]。這些方法檢測(cè)準(zhǔn)確、快速、敏感、耗時(shí)較短，一定程度上避免了假陽(yáng)性出現(xiàn)的問(wèn)題，但是部分方法依舊不適用于基層的檢測(cè)。因此，研發(fā)出不需大量人力及復(fù)雜儀器且適用于基層檢測(cè)的方法依舊是今后BVDV 檢測(cè)技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新的重中之重。如今臨床上所使用的檢測(cè)方法均存在缺陷與優(yōu)勢(shì)，不同的應(yīng)用場(chǎng)景使用的方法也各不相同，還是需根據(jù)實(shí)際情形選擇最適宜的方法，在提高效率的同時(shí)也可以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確率。隨著科技的不斷進(jìn)步，檢測(cè)方法也在飛速優(yōu)化、更新、完善，為我國(guó)的BVDV防控提供支撐。