張 艷，王圣開，聶青玉，付 勛，馮婷婷，熊春梅，李 翔

（1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，重慶 404155；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）

烤魚營養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮美，是重慶特色美食。在預(yù)制菜高速發(fā)展背景下，預(yù)制烤魚因打破傳統(tǒng)堂食烤魚消費的時效性和地域性，成為烤魚產(chǎn)業(yè)新的經(jīng)濟增長點[1-3]。包裝方式影響肉品品質(zhì)和風(fēng)味[4]。目前，市售預(yù)制烤魚主要以普通托盒和真空包裝為主，烤魚多種包裝方式的研究有利于烤魚產(chǎn)品多樣化發(fā)展。

近年來，不同包裝方式對肉制品保鮮和風(fēng)味的影響研究較多[5-6]，據(jù)文獻報道，水產(chǎn)及制品的包裝方式主要有真空、充氮、氣調(diào)包裝等，用于冰鮮黃顙魚[7]、鱸魚[8]、油炸帶魚[9]、脆肉皖魚[10]及牡蠣肉[11]中，能有效減少脂質(zhì)氧化，維持魚肉鮮度及延緩風(fēng)味劣變。Dang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)真空包裝能更有效地抑制鯰魚片的脂肪氧化，在減少腥味物質(zhì)、保持魚肉風(fēng)味方面表現(xiàn)出了較大優(yōu)勢。氣調(diào)包裝結(jié)合低溫處理方式可控制魚肉不良風(fēng)味產(chǎn)生，實現(xiàn)較好的水產(chǎn)品風(fēng)味保持效果[13-14]。風(fēng)味是魚肉重要的品質(zhì)特征，魚肉的風(fēng)味包括氣味和滋味，魚肉中某些非揮發(fā)性物質(zhì)如氨基酸類、核苷類、有機酸類、脂質(zhì)類等物質(zhì)除具有一定的營養(yǎng)功能外，同時是構(gòu)成熟肉特征風(fēng)味與口感的前體物質(zhì)，這類物質(zhì)的代謝物決定著肉質(zhì)的滋味，影響魚肉品質(zhì)[15-16]。目前，預(yù)制烤魚主要集中在單一真空包裝方式下質(zhì)構(gòu)、水分分布及脂質(zhì)氧化等品質(zhì)方面[17-18]及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析方面[19-20]的研究，而針對不同包裝方式預(yù)制烤魚非揮發(fā)性化合物如脂肪酸、氨基酸、核苷酸等的代謝物研究鮮有報道。

非靶向代謝組學(xué)可分析魚肉中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的代謝及風(fēng)味變化情況，常用于食品研究中[21-23]。目前，運用非靶向代謝組學(xué)探究預(yù)制烤魚代謝產(chǎn)物組成的研究較少。本實驗以托盒包裝（tray packaging，TP）、真空包裝（vacuum packaging，VP）和氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）的預(yù)制烤魚為研究對象，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，基于非靶向代謝組學(xué)分析不同包裝方式下烤魚非揮發(fā)性物質(zhì)的代謝產(chǎn)物組成，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）進行差異代謝物篩選，探究不同包裝方式下烤魚的代謝產(chǎn)物差異，以期為烤魚包裝多樣化發(fā)展及品質(zhì)評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚（Cyprinus carpio） 梁平養(yǎng)殖基地；食鹽、料酒等香辛料 均購于重慶萬州區(qū)家益超市；PA/EVOH/PE 蓋膜 希悅爾（中國）有限公司；PP 包裝托盒、PE 真空袋 福建元晟新材料科技有限公司；甲醇、乙腈、氯仿 色譜純，北京迪科馬科技有限公司；2-氯苯丙氨酸 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PTFE 濾膜（0.22 μm） 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

ACQUITY 型液相色譜儀（色譜柱：Waters,Milford,MA,USA） 美國Waters 公司；Q-Exactive 型質(zhì)譜儀 美國Thermo 公司；YXD-90C 型電烤箱 廣州市賽思達機械設(shè)備有限公司；MAP-430型氣調(diào)真空包裝機 浙江瑞寶包裝機械有限公司；H2050R 型冷凍離心機 湘儀儀器有限公司；SCRC MV54 型混勻儀 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；MB-96S 型組織研磨器 浙江美壁儀器有限公司；XZ-10DTD 型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烤魚樣品制備 鮮活鯉魚（1～1.2 kg）宰殺、清洗，背部剖開，放入6%的食鹽、少許料酒、老姜的腌制液中濕法腌制20 min（魚肉完全浸沒于腌制液），50～60 ℃干燥45 min 后，刷香油，250 ℃電烤箱中烤制20 min[20]。無菌冷卻后，每個包裝中隨機放入1 條烤魚，分別進行氣調(diào)包裝（30% CO2+70% N2）、真空包裝和托盒包裝。樣品于-2 ℃條件貯藏。30 d 后，每組樣品分別于魚體兩側(cè)的背部、腹部和尾部3 個位置6 個點取樣，混勻。每組樣品平行取樣3 份，液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.2.2 樣品制備 稱量適量樣品，加入1 mL 提取液（9:1 甲醇-氯仿:H2O=3:1），加入3 顆鋼珠后放入組織研磨器中研磨（50 Hz，1 min），重復(fù)操作2 次；超聲（功率200 W）30 min，冰上放置30 min，離心10 min（12000 r/min，4 ℃），取上清液濃縮干燥；準(zhǔn)確加入200 μL 2-氯苯丙氨酸（4 ng/mL）復(fù)溶樣品，過膜，用于檢測[24]。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。正離子模式流動相：0.1%甲酸乙腈（B1）和0.1%甲酸水（A1）；梯度洗脫程序：0～1 min，8% B1；1～8 min，8%～98% B1；8～10 min，98% B1；10～10.1 min，98%～8% B1；10.1～12 min，8%B1。負離子模式流動相：乙腈（B2）和 5 mol/L 甲酸銨水（A2），梯度洗脫程序：0～1 min，8% B2；1～8 min，8%～98% B2；8～10 min，98% B2；10～10.1 min，98%～8%B2；10.1～12 min，8% B2[25]。

1.2.4 質(zhì)譜條件 使用電噴霧離子源（ESI），正負離子模式采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓：3.50 kV，負離子噴霧電壓：-2.50 kV；鞘氣40 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度：325 ℃。以分辨率 70000 進行一級全掃描掃描范圍100～1000，并采用HCD 進行二級裂解，碰撞能量為30 eV，二級分辨率為17500，采集信號前3 離子進行碎裂，同時采用動態(tài)排除無必要的MS/MS 信息[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用RXCMS（V3.12.0）軟件包進行峰檢測、過濾、對齊處理，得到代謝物定量列表，通過總峰面積歸一化的方法進行數(shù)據(jù)矯正。通過諾米代謝自建數(shù)據(jù)庫及公共數(shù)據(jù)庫進行檢索比對后定性。使用SIMCA-P14.1 軟件進行PCA 和OPLS-DA 分析，通過VIP 值、P值進行差異物篩選。當(dāng)VIP＞1 和P＜0.05 時，認為代謝物分子具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。通過Origin 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)制烤魚代謝物的鑒定概況

對托盒、真空和氣調(diào)包裝的烤魚樣品中提取的代謝物進行鑒定，正負離子模式下，分別鑒定出1566、1185 個代謝物。將定量列表中含有二級譜圖的代謝物與數(shù)據(jù)庫中每個二級譜圖的碎片離子等信息進行比較、匹配，實現(xiàn)代謝物的二級定性鑒定。在二級質(zhì)譜信息中，3 種包裝的烤魚共鑒定出318 種代謝物。主要包括69 種有機酸及衍生物、48 種氨基酸類及代謝物、35 種脂質(zhì)及類脂質(zhì)分子、33 種核苷酸及衍生物、26 種醇胺類、16 種有機氧化合物、11 種苯及衍生物、8 種生物堿及衍生物、4 種醛酮類化合物和68 種其他物質(zhì)。318 種代謝物的化學(xué)分類及數(shù)量占比如圖1 所示。由此得出，烤魚中代謝物種類較多的物質(zhì)為有機酸、氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸及衍生物類，這與Li 等[15]曾報道的熱加工處理的羅非魚肉中代謝物物質(zhì)種類及數(shù)量占比的結(jié)果較為相似。魚肉中氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸被認為是味覺相關(guān)化合物[23]，對烤魚風(fēng)味有重要影響。

圖1 烤魚中代謝物種類及數(shù)量占比Fig.1 Types and quantity proportion of metabolites in grilled fish

2.2 不同包裝預(yù)制烤魚代謝產(chǎn)物的多元統(tǒng)計分析

2.2.1 主成分分析 PCA 可反映各組樣品間的總體差異和組內(nèi)樣品間的變異程度[27]。對不同包裝方式預(yù)制烤魚代謝物進行PCA 分析，如圖2 所示。正離子和負離子模式下PC1 和PC2 累計貢獻率分別為71.1%和71.5%，能反映樣品大部分信息。得分圖中3 組烤魚樣品代謝物分布在不同象限，可明顯區(qū)分開，說明3 種包裝預(yù)制烤魚代謝產(chǎn)物有一定差異。正負離子模式下，VP 組3 個平行樣代謝物較為聚集，而TP 和MAP 組的3 個平行樣有一定的離散性，這可能是因為組內(nèi)樣品間烤魚個體差異導(dǎo)致。

2.2.2 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 通過設(shè)置預(yù)設(shè)分類變量來剔除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響，能進一步量化各處理組間的差異程度，是一種適用于建立物質(zhì)表達量與樣品類別間關(guān)系模型的有效判別分析方法[28]。TP、VP 和MAP 的烤魚代謝物OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖如圖3、圖4 所示。在圖3 中得出，正負離子模式下，TP、VP 和MAP 組均分布于不同象限，3 種包裝的烤魚代謝物具有較好的聚類效果，說明不同包裝方式對預(yù)制烤魚代謝物存在較大影響。

圖3 不同包裝預(yù)制烤魚代謝產(chǎn)物的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

圖4 不同包裝預(yù)制烤魚代謝產(chǎn)物的置換檢驗圖Fig.4 Permutation test plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

OPLS-DA 模型中R2Y 代表模型對變量Y 的解釋性，Q2代表模型的可預(yù)測性，R2和Q2越接近1，且差值小（差值＜0.3），表明模型準(zhǔn)確性好，有較好的解釋和預(yù)測能力。由圖4 可知，正離子模式下，R2Y=0.968、Q2=0.804，負離子模式下R2Y=1、Q2=0.938，說明模型可很好解釋不同包裝預(yù)制烤魚的代謝物差異。為避免模型出現(xiàn)過度擬合，對模型進行了200次置換檢驗，正負離子模式下，左邊隨機實驗值R2和Q2均低于最右邊的R2和Q2值，即均小于原模型的真實值，并且R2總是大于Q2，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，能較好分析魚肉的代謝物信息。

2.3 不同包裝預(yù)制烤魚差異代謝物篩選

基于OPLS-DA 模型，以VIP＞1、P＜0.05 的代謝物作為3 種包裝烤魚的差異代謝物，結(jié)果見表1。由表1 可知，共篩選出47 種差異代謝物，分別為脂肪酸類代謝物10 種，核苷酸類代謝物10 種，氨基酸類代謝物9 種，有機酸及衍生物類7 種，苯及衍生物類3 種，醇胺類2 種，其他類6 種。脂肪酸類代謝物主要由脂肪降解和氧化產(chǎn)生，對魚肉風(fēng)味有重要影響。3 種不同包裝烤魚樣品中，硬脂酸、棕櫚酸等飽和脂肪酸，亞油酸、9-十四烯酸等不飽和脂肪酸等物質(zhì)在3 個樣品中差異顯著（P＜0.05），可能與包裝方式影響魚肉脂質(zhì)水解及氧化程度不同有關(guān)；氨基酸具有呈味特性，如L-谷氨酸、氨甲酰天冬氨酸呈鮮味，L-蘇氨酸為甜味，L-酪氨酸、組氨酸呈苦味，這些氨基酸對烤魚滋味形成有重要貢獻作用[29]；核苷酸類代謝物參與滋味物質(zhì)形成及脂質(zhì)降解，且AMP、鳥苷酸等為呈味核苷酸，能與谷氨酸等物質(zhì)有協(xié)同增鮮作用，對烤魚風(fēng)味有促進作用；有機酸類具有呈香作用，部分有機酸因肉質(zhì)變質(zhì)而成。脂肪酸、氨基酸、核苷酸及有機酸類代謝物均與魚肉的滋味密切相關(guān)[30-31]。

表1 不同包裝預(yù)制烤魚的差異代謝物Table 1 Differential metabolites of prefabricated grilled fish with different packaging

2.4 預(yù)制烤魚差異代謝物的熱圖分析

對上述47 種差異代謝物定量矩陣數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，進行差異代謝物聚類，繪制聚類熱圖。如圖5 所示，紅色越深代表該代謝物相對含量越高，藍色越深代表該代謝物相對含量越低。MAP 組烤魚中有8 種代謝物相對含量較高，分別為5 種氨基酸類、2 種核苷酸類和1 種其他類小分子物質(zhì)。氨基酸類代謝物主要是蛋白質(zhì)降解生成，具有一定營養(yǎng)價值，也是魚肉重要的滋味物質(zhì)和香味前體物質(zhì)[28]。MAP組中相對含量較高的氨基酸分別為L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、3-甲基-L-酪氨酸和N-乙酰-組氨酸。這5 種氨基酸在3 組樣品中的相對含量存在差異，可能是因為3 種包裝烤魚的氨基酸代謝程度不同導(dǎo)致。據(jù)報道，氣調(diào)包裝能有效抑制肉制品中優(yōu)勢腐敗菌的生長，改變?nèi)馄肪航Y(jié)構(gòu)，從而降低氨基酸代謝速率，因而表現(xiàn)為氨基酸相對含量較高[10,32]。MAP 組中相對含量較高的核苷酸類代謝物為單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）和肌苷。其中，AMP 是重要的呈味核苷酸，是衡量肉品鮮味物質(zhì)指標(biāo)肌苷酸（IMP）的前體物質(zhì)，由魚肉中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在酶的催化下降解而成。據(jù)報道，AMP 對魚肉風(fēng)味有增強作用，可抑制水產(chǎn)品的苦味，從而對提高肉品滋味有重要作用[15]。AMP 在脫胺酶作用下，生成肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）、肌苷等下游物質(zhì)，肌苷具有苦味，對魚肉風(fēng)味亦有重要影響。AMP、肌苷在3 組烤魚樣品中的相對含量存在差異，可能與核苷酸代謝程度有關(guān)。綜上所述，MAP 組樣品中，多種呈味氨基酸及鮮味核苷酸AMP 相對含量較高，說明MAP 對烤魚鮮味的保持有積極作用。

圖5 不同包裝預(yù)制烤魚差異代謝物的聚類熱圖Fig.5 Heat map of different metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

VP 組烤魚中有8 種代謝物相對含量高，分別為4 種脂肪酸類，2 種氨基酸類和2 種核苷酸類。脂肪酸氧化形成的醛、酮類物質(zhì)是形成魚肉風(fēng)味的主要揮發(fā)成分[19]，因此脂肪酸也是烤魚風(fēng)味的前體物質(zhì)。VP 組中硬脂酸、9-十四烯酸、亞油酸和棕櫚酸4 種游離脂肪酸相對含量最高，這可能與VP 組烤魚包裝內(nèi)部缺氧，脂肪氧化程度減緩有關(guān)[12]。其次，VP 組中N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、L-谷氨酸相對含量高，對烤魚鮮味有重要貢獻作用。核苷酸代謝物中，尿苷和鳥苷酸（guanylate，GMP）相對含量較高，尿苷是構(gòu)成動物細胞核酸的有關(guān)成分，是尿嘧啶前體物質(zhì)。GMP 有特殊的香菇鮮味，是重要的呈味核苷酸[33]。

TP 組烤魚的差異代謝物較多，其含量較高的代謝物主要有核苷酸類、有機酸類及醛類等小分子物質(zhì)。核苷酸類代謝物主要有腺苷、腺嘌呤、次黃嘌呤和尿嘧啶，此類代謝物均為AMP 降解的下游物質(zhì)，其含量較高，這可能是因為TP 組烤魚核苷酸代謝進程較快，AMP 脫氨降解生成下游產(chǎn)物，表現(xiàn)為AMP相對含量降低，降解產(chǎn)物增加。相較于VP 和MAP組，TP 組烤魚的鮮味物質(zhì)指標(biāo)AMP、IMP 相對含量低，鮮味和新鮮度下降。有機酸類代謝物中主要有尿刊酸、脲基琥珀酸、喹啉-4-羧酸、2-羥基戊二酸和α-二嗎啉酸等，因為TP 組中氧氣含量高，微生物增長速度快，導(dǎo)致魚肉產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，這與溫冬玲[34]報道的雞肉貯藏中有機酸類物質(zhì)隨微生物活動增加而含量增高的結(jié)果相似。TP 組烤魚中鞘氨醇、3-酮鞘氨醇、硬脂酰胺、谷氨酸半醛、1H-咪唑-4-乙醛相對含量高于VP 和MAP 組，可能是因為TP 組烤魚因包裝內(nèi)的氧氣，加快烤魚中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化進程，產(chǎn)生胺類、酸類和醛類等物質(zhì)，而這些物質(zhì)的積累，可能導(dǎo)致魚肉風(fēng)味劣變[35]。此外，TP 組烤魚中吲哚含量明顯高于VP 和MAP 組，吲哚主要為氨基酸代謝的低級產(chǎn)物，產(chǎn)生腐敗的臭味。

綜上所述，3 種不同包裝烤魚的差異代謝物相對含量存在差異。MAP 組中相對含量較高的差異代謝物主要為游離氨基酸、AMP 和肌苷；VP 組的差異代謝物主要為游離脂肪酸；TP 組烤魚脂質(zhì)氧化、氨基酸代謝及核苷酸代謝程度高，反映出脂質(zhì)氧化產(chǎn)物如醛類、氨基酸代謝產(chǎn)物如吲哚及核苷酸代謝產(chǎn)物嘌呤等物質(zhì)相對含量高。因此，3 種包裝烤魚中，MAP能較好保持烤魚鮮味物質(zhì)，VP 減少了脂質(zhì)氧化程度，VP 和MAP 組烤魚在指示鮮味的代謝物指標(biāo)上優(yōu)于TP 組。

3 結(jié)論

采用非靶向代謝組學(xué)研究不同包裝預(yù)制烤魚的非揮發(fā)性物質(zhì)的代謝物情況。通過多元統(tǒng)計分析，3 種包裝方式烤魚的代謝物具有較大差異，共篩選出47 種差異代謝物，主要有脂肪酸類代謝物10 種，核苷酸類代謝物10 種，氨基酸類代謝物9 種，有機酸及衍生物類7 種，醇胺類2 種，苯及衍生物類3 種，其他類6 種。聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，MAP 組烤魚相對含量較高的代謝物主要為游離氨基酸、鮮味核苷酸AMP 和肌苷；VP 組含量較高的差異代謝物主要為游離脂肪酸；TP 組與MAP、VP 組烤魚相比，氨基酸、脂肪酸和核苷酸代謝程度高，主要表現(xiàn)為其代謝的下游產(chǎn)物含量高。由此得出，相較于傳統(tǒng)的烤魚包裝方式，MAP 能較好保持烤魚的鮮味物質(zhì)。

風(fēng)味影響預(yù)制烤魚的品質(zhì)。目前，預(yù)制烤魚的研究主要集中在真空包裝下不同原料、不同熱制工藝烤魚的揮發(fā)性風(fēng)味成分等方面，本研究以預(yù)制烤魚的不同包裝方式為切入點，進行非揮發(fā)性物質(zhì)代謝物的差異分析，明確了不同包裝預(yù)制烤魚的差異代謝物情況，為預(yù)制烤魚風(fēng)味的研究提供理論依據(jù)，并為拓展預(yù)制烤魚包裝多樣化發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐。后期工作將結(jié)合不同包裝方式下烤魚貯藏過程中理化、感官、安全等品質(zhì)指標(biāo)進行綜合分析，為預(yù)制烤魚包裝優(yōu)化提供指導(dǎo)依據(jù)。

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