葛彤 齊開杰 謝智華 岳冬 王亞茹 王鵬 毛海艷 張巖 張紹鈴 吳巨友

摘要：以105個梨品種為試驗材料，調(diào)查單花花藥量和單花藥花粉量，對散粉效果較好的77個品種進行花粉活力檢測。結(jié)果表明，不同梨品種花粉量及花粉活力存在差異，花粉數(shù)量性狀變異系數(shù)大，花粉變異程度高。其中，單花花藥量變幅為13～36粒，單花藥花粉量變幅為0～15 440粒，除花粉萌發(fā)率為0%的品種外，其余品種花粉萌發(fā)率變幅為1.76%～82.74%，花粉管長度變幅為102.49～400.29 μm。經(jīng)系統(tǒng)聚類分析，供試品種被分為六大類群，其中第Ⅰ、第Ⅱ類群的15個品種花粉量多、花粉萌發(fā)率高且花粉管生長速率較快。經(jīng)正態(tài)性檢驗發(fā)現(xiàn)，單花花藥量、單花藥花粉量和花粉萌發(fā)率符合正態(tài)分布規(guī)律，將符合正態(tài)分布的花粉數(shù)量性狀用4個分點分為5級，明確了每級花粉數(shù)量性狀的頻率分布。初步篩選出15個花粉育性較好的品種以及9個花粉敗育品種，為梨園授粉樹配置和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

關(guān)鍵詞：梨；花藥量；花粉量；花粉活力；聚類分析；花粉敗育

中圖分類號：S661.203? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0142-08

收稿日期：2023-05-24

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2022YFD1200503）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項（編號：CARS-28）。

作者簡介：葛彤（1998—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，從事梨園花果管理研究。E-mail：1413230543@qq.com。

通信作者：吳巨友，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事梨種質(zhì)資源創(chuàng)新、成花受精機理與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用研究。E-mail：juyouwu@njau.edu.cn。

梨是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus）植物，我國是梨的起源中心，栽培歷史悠久、種植范圍廣泛，具有豐富的梨種質(zhì)資源^[1]?；ǚ凼茄芯恐参镞z傳、育種、生殖和進化的重要材料，明確不同品種的花粉育性和授粉特性是開展高效栽培和良種繁育工作的基礎(chǔ)^[2-3]。梨作為典型的配子體自交不親和果樹，多數(shù)品種自花授粉不能結(jié)實，為保證果園豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，花期通常采用配置授粉樹或人工輔助授粉等方法來提高花粉授粉效果^[4]。不同梨品種之間親緣關(guān)系復(fù)雜，花粉育性和交配親和性差異顯著，部分品種存在雄性不育現(xiàn)象^[5-6]。有研究顯示，梨的花粉萌發(fā)率和花粉量呈現(xiàn)出越靠近梨屬植物起源地越高的趨勢^[7]。因此，探究不同梨品種花粉量和花粉育性，對充分利用梨特異種質(zhì)、合理配置授粉樹以及雜交育種具有重要研究意義。目前，關(guān)于梨花粉量和花粉萌發(fā)率差異的研究已有較多報道，但主要集中在花粉萌發(fā)水平和授粉特性上，而有關(guān)花粉育性分類和數(shù)量性狀分級的報道較少^[8-10]。

因此，本研究通過調(diào)查不同梨品種的花粉量與花粉活力，對其花粉數(shù)量性狀進行概率分級，同時結(jié)合系統(tǒng)聚類分析，明確各品種花粉育性，篩選出花粉敗育品種，以期為生產(chǎn)實踐中授粉品種的選用和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料及取樣

試驗于2022年2月底至4月初進行，105個梨品種的花蕾材料采自南京農(nóng)業(yè)大學梨種質(zhì)資源圃和江蘇省睢寧縣示范基地。每個品種隨機采集處于大蕾期的鈴鐺狀大花蕾約100朵，剝下花藥，取50粒飽滿、未開裂的花藥用于單個花藥花粉量測定，其余花藥用硫酸紙包好后置于硅膠中陰干，待花粉全部散出后，加干燥劑，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2? 單花花藥量與單花藥花粉量檢測

隨機采集各品種處于大蕾期的鈴鐺狀大花蕾約100朵，揉開花蕾，記錄不同品種單朵花蕾的花藥數(shù)量并計算每個品種單花花藥量的平均值，統(tǒng)計花藥量后及時剝下花藥，隨機取50粒形狀飽滿、尚未開裂的花藥放入2 mL離心管中^[10]，將離心管放入35 ℃烘箱中干燥，待花粉完全散出后加入2 mL濃度為200 g/L的六偏磷酸鈉溶液，在漩渦振蕩器上振蕩成懸浮液。分別取400 μL懸浮液和1 600 μL六偏磷酸鈉溶液置于新的2 mL離心管中，搖勻，吸取5 μL混合后的溶液滴在載玻片上，在Olympus IX 73顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，統(tǒng)計單花藥花粉量（粒）。

單花藥花粉量（花粉量/花藥）=每個載玻片上總花粉數(shù)×40。

1.3? 花粉萌發(fā)率與花粉管長度檢測

將花粉從-20 ℃冰箱中取出，在4 ℃條件下放置2 h，再移至室溫下放置2 h，使花粉逐漸解凍。刮取適量花粉置于2 mL離心管中，加入400 μL液體培養(yǎng)基[其配方為10%蔗糖+0.01%硼酸+0.03% Ca（NO₃）₂·H₂O+30 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES），pH值為6.2]，混勻后放入25 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)3 h，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率和花粉管長度。每個處理觀察3個視野，以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)，隨機選取50根花粉管拍照，并使用Image J軟件測量花粉管長度。

花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

1.4? 花藥橫切面石蠟切片觀察

將適量花藥放入50%甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液中固定后，送至武漢賽維爾生物科技有限公司制作石蠟切片。將切片放置在倒置顯微鏡下觀察藥室內(nèi)花粉數(shù)量。

1.5? ?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和IBM SPSS Statistics 24軟件進行分析，分別統(tǒng)計平均值、標準差等。利用Kolmogorov-Smirnov檢驗法對花粉數(shù)量性狀進行正態(tài)分布檢驗。將符合正態(tài)分布的數(shù)量性狀劃分為5個等級，4個分點依次為x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，1～5級分布的概率依次為10%、20%、40%、20%、10%，其中：x為各性狀的平均值，s為各性狀的標準差^[11]。利用GraphPad Prism 8.0.2軟件對單花藥花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長度進行變異系數(shù)統(tǒng)計與相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同梨品種花粉量及花粉活力調(diào)查

調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，單花花藥量變幅為13～36粒，平均花藥量為23粒；單花藥花粉量變幅為 0～15 440 粒，大多品種單花藥花粉量分布在907～8 627粒范圍內(nèi)，占供試品種總數(shù)的72.38%。其中，龍香、綠安久和六棱梨花粉量極少，夏露、夏清和黃金梨等11個品種沒有檢測到花粉。

花粉萌發(fā)率和花粉管生長速率可反映花粉活力，本試驗中花粉管長度為花粉培養(yǎng)3 h后的生長量，可用花粉管長度反映花粉管的生長速率。對77個散粉效果好的梨品種進行花粉萌發(fā)率和花粉管長度檢測，結(jié)果表明，除建始早古、水洞瓜和海棠酥這3個品種的花粉萌發(fā)率為0外，其余品種花粉萌發(fā)率變幅為1.76%～82.74%，花粉管長度變幅為102.49～400.29 μm。其中，28個供試品種花粉萌發(fā)率在50%以上，占供試品種總數(shù)的36.36%。

2.2? 花藥橫切面觀察

在花粉量檢測過程中發(fā)現(xiàn)，有14個品種花粉量極少或無花粉，為驗證調(diào)查結(jié)果，對其花藥橫切面進行切片觀察（圖1）。梨花藥由4個花粉囊和藥隔組成，正常成熟花藥橫切面一般呈蝶形，花粉均勻布滿藥室。以花粉量較多的陽信大鴨梨為對照（CK），其藥室內(nèi)均勻布滿花粉粒；而夏露（圖1-A）、黃金（圖1-B）、新高芽變（圖1-C）、八里香（圖1-D）、云南黃酸梨（圖1-G）、寧霞（圖1-H）、夏清（圖1-I）、天皇（圖1-J）和新梨7號（圖2-K）這9個品種的藥室內(nèi)無花粉，花藥呈空囊狀，石蠟切片與花粉量檢測結(jié)果基本一致，判斷為花粉敗育品種。綿梨（圖1-E）和酒泉長把（圖1-F）花藥較小，呈皺縮狀態(tài)，發(fā)育不完全；綠安久（圖1-L）花藥皺縮未開裂；龍香（圖1-M）和六棱梨（圖1-N）花藥開裂，但藥室內(nèi)花粉含量少，花粉量異常機理有待進一步研究。

2.3? 花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管生長速率聚類分析

以花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長度為變量，對花粉可萌發(fā)的品種進行系統(tǒng)聚類分析，74個梨品種被分為6個類群（表2）。第Ⅰ類群包括花粉量大、萌發(fā)率高且花粉管生長速率快的3個品種，分別為連城石頭梨、龍都大鴨梨和大洋木梨（莆田），其平均花粉量為14 107粒，平均萌發(fā)率為54.58%，平均花粉管長度255.20 μm。第Ⅱ類群包括12個品種，其花粉量較大，花粉萌發(fā)率較高，花粉管生長速率較快。第Ⅲ類群包括15個品種，為花粉量較高，花粉萌發(fā)率和花粉管長度處于中等水平的品種。第Ⅳ類群包括18個花粉量和花粉萌發(fā)率中等，但花粉管長度較短的品種。第Ⅴ類群包括10個品種，為花粉量較少、花粉萌發(fā)率較低，但花粉管生長速率較快的品種。第Ⅵ類群包括16個品種，其花粉量、萌發(fā)率和花粉管生長速率均表現(xiàn)較差。綜合比較之下，第Ⅰ、第Ⅱ類群品種的花粉育性最好，第Ⅲ、第Ⅵ類群品種的花粉育性中等，第Ⅴ、第Ⅳ類群品種的花粉育性最差。

2.4? 花粉數(shù)量性狀的正態(tài)性檢驗及頻率分布

經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗，除花粉管長度的P值為0.023，不符合正態(tài)分布規(guī)律外，單花花藥量、單花藥花粉量及花粉萌發(fā)率的P值均大于0.1，符合正態(tài)分布規(guī)律。將符合正態(tài)分布規(guī)律的3個數(shù)量性狀依據(jù)分級標準（表3）劃分為5個等級，4個分點依次為x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，其分布頻次如圖2所示。根據(jù)分點值確定取值范圍并計算分布頻率，通過變異系數(shù)將數(shù)據(jù)多樣性進行量化。

單花花藥量的變幅為13～36粒，平均單花花藥量為23粒，變異系數(shù)為16.81%。單花花藥量概率分級的頻率分布：1級（＜18粒）占4.8%，2級（18～21粒）占20.0%，3級（>21～25粒）占41.9%，4級（>25～28粒）占19.0%，5級（>28粒）占14.3%。

單花藥花粉量的變幅為0～15 440粒，平均花粉量為5 411粒，變異系數(shù)為64.58%。單花藥花粉量概率分級的頻率分布：1級（＜932粒）占14.29%，2級（932～3 578粒）占19.05%，3級（>3 578～7 244粒）占36.19%，4級（>7 244～9 890粒）占20%，5級（>9 890粒）占10.48%。

花粉萌發(fā)率的變幅為0～82.74%，平均花粉萌發(fā)率為39.69%，變異系數(shù)為57.58%?；ǚ勖劝l(fā)率概率分級的頻率分布：1級（＜10.40%）占10.38%，2級（10.40%～27.70%）占24.68%，3級（>27.70%～51.68%）占31.29%，4級（>51.68%～68.98%）占18.18%，5級（>68.98%）占15.58%。

2.5? 花粉性狀相關(guān)性分析

結(jié)合皮爾遜相關(guān)系數(shù)及散點圖對單花藥花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長度進行相關(guān)性分析。結(jié)果（圖3）表明，單花藥花粉量與花粉萌發(fā)率、花粉管長度之間均呈弱相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.360和0.252；花粉萌發(fā)率與花粉管長度之間呈顯著正相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.662。

3? 討論

3.1? 不同梨品種花粉量及花粉活力的差異

花粉質(zhì)量是保證授粉效果的關(guān)鍵，直接影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)，花粉量主要取決于品種本身的遺傳特性、樹體營養(yǎng)水平及生存環(huán)境^[12]。在對棗、桃、葡萄和蘋果等果樹的花粉研究中發(fā)現(xiàn)，不同果樹或同一果樹的不同品種間花粉量及花粉活力存在差異^[13-17]。在本研究中，不同梨品種花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管生長速率差異明顯，與其他果樹花粉研究結(jié)果類似?；ǚ刍盍Σ粌H與花粉自身遺傳特性有關(guān)，而且受外界環(huán)境如溫度、相對濕度、貯藏介質(zhì)、輻射、光照、空氣質(zhì)量等多重因素影響^[18-19]。因此，在本研究中導(dǎo)致建始早谷、水洞瓜和海棠酥花粉萌發(fā)率為0的因素較多，花粉未萌發(fā)的具體原因有待進一步探究。通過對梨花粉數(shù)量性狀特征進行概率分級，明確每級花粉數(shù)量性狀的頻率分布，更加客觀統(tǒng)一地描述、評價梨花粉性狀，也證實花粉數(shù)量性狀具有變異系數(shù)大、變異程度高、多樣性豐富的特點^[11]。單花花藥量、單花藥花粉量和花粉萌發(fā)率符合正態(tài)分布規(guī)律，而花粉管長度不符合正態(tài)分布規(guī)律，與李芳芳等研究中“花粉量與花粉萌發(fā)率均不符合正態(tài)分布規(guī)律”的結(jié)論^[10]有所不同。

3.2? 花粉量大且活力強的品種篩選

多數(shù)梨品種自花不結(jié)實或自花結(jié)實率低、低溫陰雨天氣和品種花期不遇等問題均可影響花粉正常發(fā)育，需配置授粉樹或人工輔助授粉，以保證豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)^[4]。依據(jù)花粉特性對品種進行分類的結(jié)果，可為雜交親本的選擇和授粉樹的配置提供參考。本研究通過聚類分析，將供試梨品種劃分為育性不同的六大類群，篩選出白梨系統(tǒng)中的夏半伏梨、陽信大鴨梨、龍都大鴨梨、泊頭大鴨梨、新鴨梨、金墜、金花1號、漢源白梨，砂梨系統(tǒng)中的金水酥、蒼溪六月雪、大洋木梨（莆田）、玉冠，秋子梨系統(tǒng)中的遼陽大香水以及地方品種長泰臺灣梨、連城石頭梨等15個花粉量大、花粉萌發(fā)率高且花粉管生長速率快的品種?；ǚ圪|(zhì)量是保證授粉效果的關(guān)鍵，選擇花粉量大、花粉活力強的品種用于授粉，能夠有效解決生產(chǎn)中授粉不良、產(chǎn)量不高等問題。由于多數(shù)梨品種自花授粉不結(jié)實，品種間是否親和、花期是否相近成為梨園配置授粉樹時必須考慮的因素，另外，種間遠緣關(guān)系也會造成無法相互授粉或受精率很低。因此，授粉前應(yīng)進行S基因型比較，依據(jù)親緣關(guān)系，選擇與主栽品種親和并且花期相近的品種作為授粉樹，以保證較好的授粉質(zhì)量。

3.3? 雄性不育品種的驗證

植物雄性不育現(xiàn)象主要表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育異常、不能產(chǎn)生有正常功能的花粉，但雌蕊可正常發(fā)育并能接受花粉而受精結(jié)實^[20]。雄性不育現(xiàn)象廣泛存在于自然界開花植物中，桃、杏、葡萄、柑橘等許多果樹具有不育品種^[21-24]。部分梨品種也存在雄性不育現(xiàn)象，并推斷為細胞質(zhì)雄性不育，主要是由絨氈層發(fā)育異?；蚨嘀匾蛩毓餐绊懚鴮?dǎo)致花粉敗育，且敗育時期集中在單核小孢子晚期。先前有報道指出，黃金、八里香、夏露、夏清、天皇和新梨7號花粉敗育^{[5，25-27]}，與本研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，新高芽變、云南黃酸梨和寧霞存在花粉敗育現(xiàn)象，而綿梨、酒泉長把、綠安久、龍香和六棱梨花粉量極少或無花粉，花粉是否敗育還有待驗證。綿梨、酒泉長把和綠安久可能由于花器官發(fā)育不完全、花藥較小才未檢測出花粉；通過花藥橫截面顯微觀察，發(fā)現(xiàn)龍香和六棱梨的花藥已經(jīng)開裂，但散粉少，導(dǎo)致無法進一步檢測其花粉萌發(fā)率。因此，這些品種不能完全確定是否花粉敗育。雄性不育品種是種質(zhì)創(chuàng)新的重要材料，在育種過程中可有效簡化育種程序、提高育種效率，具有較高的利用價值。目前，關(guān)于梨樹雄性不育的報道主要集中在細胞學和生理機制層面，在分子生物學方面研究較少，未來應(yīng)深入探究梨樹雄性不育機制，為合理利用梨種質(zhì)資源提供參考。

4? 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同梨品種花粉量與花粉活力差異明顯，花粉數(shù)量性狀變異系數(shù)大，花粉變異程度高，具有豐富的遺傳多樣性。篩選出連城石頭梨、龍都大鴨梨和大洋木梨（莆田）等15個單花藥花粉量大且花粉活力較好的品種，以及新高芽變和云南黃酸梨等9個存在花粉敗育現(xiàn)象的品種，為梨園授粉樹配置和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

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