解晨曦 畢波

摘要? 目的：探討脂蛋白相關(guān)lncRNA H19（H19）參與炎癥反應(yīng)導(dǎo)致冠心病的分子機(jī)制。方法：選取2019年1月—2022年1月100例冠狀動(dòng)脈造影后新診斷為冠心病的病人和100例因不明原因的胸痛或疑似冠心病癥狀而接受冠狀動(dòng)脈造影但最終被確定患有冠心病以外疾病的受試者（對(duì)照組）。收集血漿樣本，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)H19和miR-212-5p，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定炎性細(xì)胞因子。結(jié)果：冠心病組H19表達(dá)明顯高于對(duì)照組［2.27（1.68，3.39）和1.00（0.60，1.41），P＜0.001］；H19診斷冠心病的受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）為0.903［95%CI（0.847，0.958）］。lncRNASNP2、Starbase和LncBook數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-212-5p與H19結(jié)合。冠心病組miR-212-5p表達(dá)低于對(duì)照組［0.44（0.32，0.70）和1.00（0.78，1.37），P＜0.001］；miR-212-5p診斷冠心病的AUC為0.839［95%CI（0.760，0.918）］。冠心病組H19和miR-212-5p呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.436，P＜0.001）。H19表達(dá)與

Gensini評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.430，P＜0.001）；miR-212-5p表達(dá)與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.315，P＝0.006）。冠心病病人H19表達(dá)與TNF-α（r＝0.273，P＝0.008）和IL-17（r＝0.310，P＝0.003）呈正相關(guān)。miR-212-5p表達(dá)與TNF-α（r＝－0.272，P＝0.001）、IL-1β（r＝－0.223，P＝0.030）、IL-6（r＝－0.295，P＝0.004）和IL-17（r＝－0.348，P＜0.001）呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：循環(huán)H19及其靶標(biāo)miR-212-5p與冠心病疾病的嚴(yán)重程度和炎癥水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞? 冠心?。婚L(zhǎng)鏈非編碼RNA H19；miR-212-5p；炎癥反應(yīng)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.022

基金項(xiàng)目? 2020年度省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.SKL-HIDCA-2020-WF4）

作者單位? 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830011），E-mail：41200630@qq.com

引用信息? 解晨曦，畢波.脂蛋白相關(guān)lncRNA參與炎癥反應(yīng)致冠心病的分子機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（2）：326-330.

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種常見(jiàn)的疾病，每年死亡人數(shù)超過(guò)1 700萬(wàn)例，是全球人類(lèi)疾病死亡的主要原因［1］。冠心病的早期發(fā)現(xiàn)和治療（即藥物、介入或手術(shù)治療）與隨后的冠心病結(jié)局相關(guān)。近年來(lái)，許多研究報(bào)告了多種類(lèi)型的生物標(biāo)志物，例如心肌肌鈣蛋白-I、脂蛋白A、纖維蛋白原和胱抑素C，用于預(yù)測(cè)冠心病風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。盡管發(fā)現(xiàn)了這些生物標(biāo)志物，但冠心病的早期識(shí)別和管理仍然存在不足。因此，有必要不斷識(shí)別冠心病的生物標(biāo)志物。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。生物體內(nèi)的lncRNA種類(lèi)繁多，數(shù)量巨大，并參與多種疾病的病理進(jìn)程［4］。其中，脂蛋白相關(guān)lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在冠心病病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。lncRNA H19（H19）作為脂蛋白相關(guān)lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)H19通過(guò)抑制264.7細(xì)胞中的Caspase-1減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［6］。此外，還有研究證實(shí)，H19下調(diào)通過(guò)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡來(lái)緩解冠心?。?］。然而，H19在冠心病過(guò)程中對(duì)炎癥反應(yīng)的作用尚不清楚，仍需要進(jìn)一步研究其作為冠心病生物標(biāo)志物的潛在作用。因此，本研究旨在探討H19與冠心病病人冠狀動(dòng)脈狹窄程度、常見(jiàn)生化指標(biāo)和炎性細(xì)胞因子的關(guān)系。

1? 資料與方法

1.1? 臨床資料

納入2019年1月—2022年1月因不明原因胸痛或疑似冠心病癥狀而在冠狀動(dòng)脈造影后新診斷為冠心病的病人100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈造影顯示冠心病，年齡≥18歲，并且至少有1條主要的心外膜血管狹窄＞50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）除冠心病以外的其他心臟??；2）患有自身免疫性疾病、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重的肝臟或腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；3）孕婦或哺乳期婦女。

招募100例因不明原因的胸痛或疑似冠心病癥狀而接受冠狀動(dòng)脈造影但最終被確定患有冠心病以外疾病的受試者作為對(duì)照組。在對(duì)照組的招募中，年齡限制在50～80歲，男性與女性比例限制在4∶1，旨在匹配冠心病病人和對(duì)照組的年齡和性別。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：1）伴有自身免疫性疾病、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重的肝臟或腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；2）孕婦或哺乳期婦女。所有受試者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2? 數(shù)據(jù)記錄

入組后記錄所有受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)、病史、合并癥和生化指標(biāo)。通過(guò)冠狀動(dòng)脈造影計(jì)算Gensini評(píng)分，定量分析冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度。

1.3? 樣本采集

在冠狀動(dòng)脈造影之前從所有登記的受試者中采集外周血。采血后，在4 ℃下以2 500×g離心15 min，將血漿樣品與外周血樣品分離。血漿樣本用于檢測(cè)H19和miR-212-5p的表達(dá)。測(cè)量冠心病病人血漿樣品中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-17水平。

1.4? H19和miR-212-5p表達(dá)檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)血漿樣品中H19和miR-212-5p的表達(dá)。使用RNeasy Protect Mini Kit （德國(guó)Qiagen公司）從血漿樣品中提取總RNA，然后使用帶有隨機(jī)引物的iScriptTMcDNA Synthesis Kit，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)（25 ℃ 5 min，46 ℃ 20 min，95 ℃ 1 min）。隨后，使用THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix（日本Osaka公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）以量化H19和miR-212-5p表達(dá)（95 ℃ 60 s，然后40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 15 s和60 ℃持續(xù)60 s），均使用 2－ΔΔCt方法計(jì)算，分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6作為內(nèi)部參考。用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的引物見(jiàn)表1。

1.5? 炎性細(xì)胞因子測(cè)定

使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)變量分布和正態(tài)性的特點(diǎn)，使用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)（M）、四分位間距（IQR）、百分比（%）進(jìn)行描述性分析。使用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。使用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)估計(jì)兩個(gè)連續(xù)變量之間的關(guān)聯(lián)。受試者工作特征（ROC）曲線用于估計(jì)變量在區(qū)分冠心病病人和對(duì)照組方面的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 冠心病組與對(duì)照組臨床特征比較

與對(duì)照組相比，冠心病組糖尿病比例、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平、Gensini評(píng)分明顯增加（P＜0.05），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.2? 兩組H19表達(dá)比較及H19診斷冠心病的效能

冠心病組H19表達(dá)明顯高于對(duì)照組［2.27（1.68，3.39）與1.00 （0.60，1.41），P＜0.001］，詳見(jiàn)圖1A。H19診斷冠心病的ROC曲線下面積（AUC）為0.903［95%CI（0.847，0.958）］，詳見(jiàn)圖1B。

2.3? H19作為miR-212-5p ceRNA發(fā)揮作用

作為ceRNA，H19競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA并調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中的靶mRNA。miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)生物信息學(xué)（lncRNASNP2：http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP＃！/，Starbase：http：//www.starbase.sysu.edu.cn/，LncBook：https：//bigd.big.ac.cn/lncbook/index）用于尋找與H19相互作用的miRNA，共確定12種候選miRNA（見(jiàn)圖2A）。其中，有研究報(bào)道m(xù)iR-212-5p抑制心臟成纖維，具有保護(hù)心臟的作用［8］。因此，研究選擇miR-212-5p進(jìn)行進(jìn)一步分析。冠心病組miR-212-5p表達(dá)低于對(duì)照組［0.44（0.32，0.70）與1.00（0.78，1.37），P＜0.001］。詳見(jiàn)圖2B。miR-212-5p對(duì)冠心病具有良好的鑒別價(jià)值［AUC＝0.839，95%CI（0.760，0.918）］。詳見(jiàn)圖2C。

2.4? 冠心病病人H19、miR-212-5p、Gensini評(píng)分及生化指標(biāo)之間的相關(guān)性

在對(duì)照組中，未發(fā)現(xiàn)H19和miR-212-5p之間存在相關(guān)性（r＝－0.128，P＝0.204）；在冠心病組中，H19和miR-212-5p呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.436，P＜0.001）；H19表達(dá)與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.430，P＜0.001）；miR-212-5p表達(dá)與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.315，P＝0.006）。詳見(jiàn)圖3。此外，H19表達(dá)與冠心病病人HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.271，P＝0.009），與CRP水平呈正相關(guān)（r＝0.460，P＜0.001）；miR-212-5p表達(dá)與冠心病病人TC （r＝－0.232，P＝0.023）和CRP（r＝－0.423，P＜0.001）水平呈負(fù)相關(guān)。詳見(jiàn)表3。

2.5? 冠心病病人H19和miR-212-5p與炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性

在冠心病病人中，H19表達(dá)與TNF-α（r＝0.273，P＝0.008）和IL-17（r＝0.310，P＝0.003）水平呈正相關(guān)。miR-212-5p表達(dá)與TNF-α（r＝－0.272，P＝0.001）、IL-1β（r＝－0.223，P＝0.030）、IL-6（r＝－0.295，P＝0.004）和IL-17（r＝－0.348，P＜0.001）水平呈負(fù)相關(guān)。詳見(jiàn)表4。

3? 討? 論

有研究表明，幾種非編碼RNA具有作為冠心病生物標(biāo)志物的潛力，例如lncRNA-FA2H-2、lncRNA GAS5及其潛在靶標(biāo)miR-21和miR-194-3p［9-10］。本研究擴(kuò)展了先前發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)H19和miR-212-5p作為炎癥調(diào)節(jié)因子在心血管系統(tǒng)的多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，冠心病病人中H19高表達(dá)，而miR-212-5p在心血管系統(tǒng)中表達(dá)不足。ROC曲線顯示，H19和miR-212-5p均能夠診斷冠心病，并且AUC值均超過(guò)0.8。同時(shí)，H19表達(dá)與冠心病病人的miR-212-5p呈負(fù)相關(guān)，原因可能是：1）H19調(diào)節(jié)系統(tǒng)性炎癥［miR-22-3p/NOD樣受體蛋白3（NLRP3）通路［11］］和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)（通過(guò)miR-194-3p-靶向硫氧還蛋白相互作用蛋白軸［12］），而miR-212-5p調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子［通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）］通路［13］。因此，H19和miR-212-5p的失調(diào)增加了冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。2）H19與miR-212-5p之間的負(fù)相關(guān)可能是由于H19作為miR-212-5p的負(fù)調(diào)節(jié)因子［14］。本研究中，所有冠心病受試者均首次診斷為冠心病，且在當(dāng)前研究之前沒(méi)有接受任何針對(duì)冠心病的治療。因此，可基本排除治療對(duì)H19和miR-212-5p表達(dá)的影響。

Gensini評(píng)分是衡量冠心病冠狀動(dòng)脈狹窄一般嚴(yán)重程度的有意義的評(píng)分系統(tǒng)［15］。本研究表明，H19與冠心病病人Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，而miR-212-5p與冠心病病人Gensini得分呈負(fù)相關(guān)?？赡茉?yàn)椋?）H19通過(guò)促進(jìn)miR-21-5p介導(dǎo)的Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥，導(dǎo)致更嚴(yán)重的血管狹窄，從而加重糖尿病心血管疾?。?6］；2）miR-212-5p通過(guò)PAFAH1B2信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，介導(dǎo)冠心病的嚴(yán)重程度［17］。此外，本研究還表明H19與HDL-C呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)，miR-212-5p與TC呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于它們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中膽固醇和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的調(diào)節(jié)［6］。有報(bào)道指出HDL-C和TC是冠心病的潛在危險(xiǎn)因素［3］。因此，可以推斷H19和miR-212-5p調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝間接促進(jìn)冠心病進(jìn)展。

H19和miR-212-5p與心血管疾病病人的炎癥水平相關(guān)。一項(xiàng)研究報(bào)道，H19在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中通過(guò)海綿狀miR-221加重人髓系白血病單核細(xì)胞（THP）-1巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［18］。另一項(xiàng)研究報(bào)告稱(chēng)，巨噬細(xì)胞中miR-212-5p的缺失會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的血管炎癥［19］。本研究表明，冠心病病人的H19表達(dá)與CRP、TNF-α和IL-17水平呈正相關(guān)，而miR-212-5p表達(dá)與CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平呈負(fù)相關(guān)?？赡茉颍?）H19通過(guò)多種途徑增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如miR-22-3p/NLRP3信號(hào)通路，觸發(fā)CRP、TNF-α和IL-17水平升高［11］；2）miR-212-5p通過(guò)c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路和PI3K/AKT通路下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和CRP水平降低［13］。同時(shí)，H19和miR-212-5p與IL-17具有相關(guān)性，這可以通過(guò)H19和miR-212-5p對(duì)T輔助17平衡和分化的調(diào)節(jié)來(lái)解釋。

4? 小? 結(jié)

本研究結(jié)果表明，H19和miR-212-5p與冠心病疾病的嚴(yán)重程度和炎癥水平相關(guān)。基于這些發(fā)現(xiàn)，對(duì)H19和miR-212-5p的強(qiáng)化監(jiān)測(cè)可能可以反映冠心病病人的疾病嚴(yán)重程度和炎癥水平，從而對(duì)不同疾病嚴(yán)重程度或炎癥水平的冠心病病人進(jìn)行適當(dāng)管理。

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（收稿日期：2022-07-21）

（本文編輯王麗）