王甜甜 王魏 楊翠華 盧斌

摘要 目的：研究大黃酸（RH）對高糖處理的H9c2心肌細胞的保護作用及可能機制。方法：H9c2細胞分為正常葡萄糖濃度組（NG組，葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、高糖組（HG組，葡萄糖濃度為35 mmol/L）、高糖＋大黃酸組（HG＋RH 5組、HG＋RH 10組、HG＋RH 30組，大黃酸濃度分別為5、10、30 μmol/L）。細胞增殖/凋亡檢測（CCK-8）法檢測各組細胞活力，蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）、線粒體轉錄因子A（TFAM）蛋白表達。H9c2細胞分為正常葡萄糖濃度組（NG 組）、高糖組（HG組）、高糖＋大黃酸組（HG＋RH10組，RH為10 μmol/L）、高糖＋大黃酸＋EX527組（HG＋RH＋EX527組，EX527為10 μmol/L）。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測Sirt1、PGC-1α、TFAM、核呼吸因子1（NRF-1）、解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）mRNA水平；Western Blot檢測Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白表達。結果：與NG組比較，HG組細胞活力下降（P＜0.05）；不同濃度的大黃酸干預組細胞活力有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NG組比較，HG組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白水平明顯下降（P＜0.05）；與HG組比較，濃度為10 μmol/L的大黃酸干預組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白水平均升高（P＜0.05）；與NG組比較，HG組Sirt1、PGC-1α、TFAM、NRF-1、UCP2 mRNA表達水平降低（P＜0.05），與HG組比較，HG＋RH10組Sirt1、PGC-1α、TFAM、NRF-1、UCP2 mRNA表達水平升高，而EX527處理組各指標表達較HG＋RH10組降低（P＜0.05）。結論：大黃酸對高糖誘導的心肌細胞損傷具有保護作用，其機制可能是通過激活Sirt1/PGC-1α通路實現(xiàn)的

關鍵詞 糖尿病心肌病；大黃酸；心肌細胞損傷；保護作用；沉默信息調(diào)節(jié)因子1；過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.010

Protective Effect and Mechanism of Rhein on H9c2 Cardiomyocytes Injury Induced by High Glucose

WANG Tiantian， WANG Wei， YANG Cuihua， LU Bin

Jinling Clinical Medical School of Nanjing Medical University， General Hospital of Eastern Theater Command， People′s Liberation Army of China， Nanjing 210002， Jiangsu， China

Corresponding Author LU Bin， E-mail： lubin@nju.edu.cn

Abstract Objective：To observe the protective effect of rhein（RH） on H9c2 cardiomyocytes injury induced by high glucose and its possible mechanism.Methods：H9c2 cells were divided into normal glucose group（NG group，glucose concentration was 5.5 mmol/L），high glucose group（HG group，glucose concentration was 35 mmol/L），high glucose＋rhein group（HG＋RH 5 group，HG＋RH 10 group，HG＋RH 30 group）.The concentration of rhein was 5 μmol/L，10 μmol/L，and 30 μmol/L，respectively.Cell viability was detected by cell counting kit-8（CCK-8）.Protein expression of silencing information regulator 1（Sirt1），peroxisome proliferator-activated receptor-γ-coactivator-1α（PGC-1α） and mitochondrial transcription factor A（TFAM） were detected by Western Blot.H9c2 cells were divided into normal glucose group（NG group），high glucose group（HG group），high glucose＋rhein group（HG＋RH10 group，rhein 10 μmol/L），high glucose＋rhein ＋EX527 group（HG＋RH10＋EX527 group，EX527 10 μmol/L）.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR） was used to detect mRNA levels of Sirt1，PGC-1α，TFAM，nuclear respiratory factor 1（NRF-1） and uncoupling protein 2（UCP2）.The expressions of Sirt1，PGC-1α and TFAM were detected by Western Blot.Results：Compared with NG group，the cell viability of HG group decreased（P＜0.05）.The cell viability of different concentrations of rhein group increased to a certain extent，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with NG group，the protein levels of Sirt1，PGC-1α and TFAM in HG group significantly decreased（P＜0.05）.Compared with HG group，the protein levels of Sirt1，PGC-1α and TFAM in RH 10 μmol/L group increased（P＜0.05）.Compared with NG group，mRNA levels of Sirt1，PGC-1α，TFAM，NRF-1 and UCP2 in HG group decreased（P＜0.05）.Compared with HG group，the above mRNA levels in HG＋RH10 group increased，and EX527 inhibited the increase of rhein（P＜0.05）.Conclusion：Rhein showed some aprotective effect on cardiomyocytes injury induced by high glucose，which might be achieved by activating of Sirt1/PGC-1α pathway

Keywords diabetic cardiomyopathy; rhein; cardiomyocytes injury; protective effect; Silencing information regulator 1， Sirt1， peroxisome proliferator activator receptor γ coactivator 1α， PGC-1α; experimental study

基金項目 國家自然科學基金項目（No.81873174）

作者單位 南京醫(yī)科大學金陵臨床醫(yī)學院/中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（南京210002）

通訊作者 盧斌，E-mail：lubin@nju.edu.cn

引用信息 王甜甜，王魏，楊翠華，等.大黃酸對高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用及機制［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（3）：459-463；469.

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指糖尿病引起的以心臟結構和心室舒縮功能改變?yōu)樘攸c的一種心臟病變，臨床表現(xiàn)主要有充血性心力衰竭、心絞痛和心律失常，是臨床較常見的一種糖尿病并發(fā)癥。已有研究表明，糖脂代謝異常、炎癥反應、氧化應激、線粒體功能紊亂、心肌纖維化、細胞凋亡、自噬等均參與DCM的發(fā)生發(fā)展^［1-2］。心臟的能量消耗約占人體三磷酸腺苷（ATP）總消耗量的8%，線粒體占心肌細胞體積的30%～40%^［3］，線粒體功能穩(wěn)定對于心臟正常生理功能具有重要作用。糖尿病存在的糖脂代謝紊亂、氧化應激、糖基化修飾等均會損害心肌線粒體的結構和功能^［1］。多項研究顯示線粒體損傷在DCM發(fā)病的多個環(huán)節(jié)中起重要調(diào)控作用，可導致或者加快DCM的發(fā)生，而改善線粒體功能可減少糖尿病對心臟的損害^［4-6］。

大黃酸（Rhein，RH）是一種從中藥大黃中分離出來的蒽醌化合物，有改善糖脂代謝、抗炎、抗氧化應激等作用。研究表明大黃酸能夠延緩糖尿病腎病進展，改善胰島功能，治療脂肪肝等^［7-9］。本研究采用高糖培養(yǎng)H9c2心肌細胞模擬DCM模型，探討大黃酸對H9c2心肌細胞的保護作用及可能機制，為大黃酸制劑用于DCM的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

H9c2心肌細胞系、低糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（上海中喬新舟公司）；胎牛血清（NEWZERUM）；雙抗、0.25%胰蛋白酶（Gibco）；大黃酸（南京景竹生物科技有限公司）；EX527（Sigma公司）；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）抗體（Millipore）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator，PGC-1α）抗體（Abcam公司）、線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）抗體、 β-tubulin抗體（ABclonal）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）引物包括Sirt1、PGC-1α、TFAM、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor-1，NRF-1）、解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2），細胞增殖/凋亡檢測（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法試劑盒（南京普諾恩生物技術有限公司）；Trizol、RNA反轉錄和擴增試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及不同濃度大黃酸干預分組

將H9c2細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗生素的低糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO₂的條件下培養(yǎng)，每天或2 d進行換液，3～4 d傳代。待細胞貼壁匯合成80%～90%狀態(tài)時，用胰酶37 ℃消化1 mim，離心重懸后分為5組：正常葡萄糖濃度組（NG 組，葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、高糖組（HG組，葡萄糖濃度為35 mmol/L）、高糖＋大黃酸組（HG＋RH5組、HG＋RH10組、HG＋RH30組，大黃酸濃度分別為5、10、30 μmol/L）。

1.3 CCK8法檢測細胞活力

當H9c2細胞生長至90%密度時，常規(guī)消化細胞，接種于96孔板中，每孔2 000個細胞。按照實驗分組，待細胞融合度達80%～90%時，每孔加入10 μL CCK8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀450 nm波長處檢測吸光值。

1.4 蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白表達水平

將H9c2細胞接種于6孔板中，細胞融合至90%時，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入RIPA裂解液，收集細胞離心留取上清，二喹啉甲酸法（BCA）測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離、濕轉至二氨基聯(lián)苯胺（PVDF）膜，并用5%牛血清白蛋白（BSA）的酸性磷酸酶抗體（TBST）封閉1 h，之后分別用Sirt1、PGC-1α（1∶1 000）、TFAM（1∶2 000）、β-tublin（1∶5 000）抗體4 ℃孵育過夜，然后用TBST洗滌4次，在室溫下孵育相應的山羊抗兔、抗鼠IgG二抗（1∶5 000）1.5 h，再次TBST洗滌4次，用超敏增強型化學發(fā)光（ECL）試劑顯影曝光拍照。利用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 EX527干預分組

將H9c2細胞分為正常葡萄糖組（NG 組）、高糖組（HG組）、高糖＋大黃酸組（HG＋RH10組，大黃酸為10 μmol/L）、高糖＋大黃酸＋EX527組（HG＋RH10＋EX527組，EX527為10 μmol/L）。

1.6 PCR檢測Sirt1、PGC-1α、TFAM、NRF-1和UCP2 mRNA水平

將H9c2細胞接種于6孔板中，細胞融合至90%時，棄去培養(yǎng)液，進一步PBS洗滌2次，應用Trizol法提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。詳細PCR引物序列如下，Sirt1正向引物：CAGGTAGTTCCTCGGTGTCC，Sirt1反向引物：TGAAGGCAGAGGTTCCCTATT；PGC-1α正向引物：CCGATCACCATATTCCAGGT，PGC-1α反向引物：TTCAGACTCCCGCTTCTCAT；TFAM正向引物：GAGCCATAGTGCCCATCAGT，TFAM反向引物：ATCAAGACTGTGCGTGCATC；NRF-1正向引物：ATGGAGGAACACGGAGTGAC，NRF-1反向引物：GCTGCCGTGGAGTTGAGTAT；UCP2正向引物：TTGAAGAACGGGACACCTTT，UCP2反向引物：CTGCAATACAGGCTGCTGTC。根據(jù)實時定量PCR擴增試劑盒說明，反應程序：第一步預變性：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)：第二步PCR反應：95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；第三步，熔解曲線分析。使用2^－△△Ct法計算各樣本中相對mRNA量，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x^-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗，組間差異比較采用Tukey′s多重比較檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度大黃酸對高糖處理后的H9c2心肌細胞活力的影響

與NG組相比，HG組細胞活力下降（P＜0.05）。與HG組相比，HG＋RH5組、HG＋RH10組、HG＋RH30組細胞活力有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖1。

2.2 不同濃度大黃酸對高糖處理的H9c2心肌細胞蛋白表達的影響

與NG組相比，HG組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。與HG組相比，HG＋RH5組、HG＋RH10組、HG＋RH30組Sirt1蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），其中以HG＋RH10組升高最為明顯。與HG組相比，HG＋RH5組、HG＋RH10組PGC-1α蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），HG＋RH30組PGC-1α蛋白表達升高，差異無統(tǒng)計學意義。與HG組相比，HG＋RH10組的TFAM蛋白表達明顯升高（P＜0.05），HG＋RH5組、HG＋RH30組的TFAM蛋白表達有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義。詳見圖2。最終選擇大黃酸10 μmol/L作為干預濃度。

2.3 Sirt1抑制劑EX527對大黃酸干預的H9c2心肌細胞mRNA表達的影響

與NG組相比，HG組Sirt1、PGC-1α、TFAM、NRF-1、UCP2 mRNA表達水平均降低（P＜0.05），HG＋RH10組各指標mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與HG＋RH10組相比，HG＋RH10＋EX527組各指標mRNA水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3。

2.4 Sirt1抑制劑EX527對大黃酸干預的H9c2心肌細胞蛋白表達的影響

與NG組相比，HG組Sirt1、TFAM、PGC-1α蛋白表達均明顯減少（P＜0.05）。與HG組相比，HG＋RH10組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白表達均明顯增加（P＜0.05）。與HG＋RH10組相比，HG＋RH10＋EX527組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4。

3 討 論

DCM的主要病理變化包括心肌肥大、壞死、凋亡、間質纖維化、微小血管硬化，其前期以舒張功能障礙為主，逐步進展至心力衰竭^［1］。目前除了鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（SGLT-2）抑制劑、胰高糖素肽-1（GLP-1）受體激動劑類的降糖藥物具有心血管益處外，大多數(shù)降糖藥物并無心臟保護作用。

線粒體功能障礙是DCM發(fā)病機制之一，目前已有以線粒體為靶點的DCM的治療藥物，如MnTBAP^［10］、MitoQ^［11］、BH4^［12］等有助于改善線粒體氧化應激；曲美他嗪^［13］、雷諾嗪^［14］、哌克昔林^［15］可調(diào)節(jié)線粒體底物利用，提高左室射血分數(shù)。線粒體生物合成對維持線粒體質量至關重要，PGC-1α在調(diào)控線粒體生成和呼吸功能的轉錄控制中起到核心作用，可激活下游多種轉錄因子，包括TFAM、NRF-1、UCP2、雌激素相關受體-α（oestrogen-related receptor-α，ERR-α）等。TFAM是一種編碼線粒體轉錄因子α的核基因，能夠穩(wěn)定線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）并啟動線粒體DNA復制。大量研究表明TFAM的缺失可導致mtDNA的突變及其拷貝數(shù)減少，導致線粒體功能紊亂。NRF-1可作用于TFAM基因的啟動子，調(diào)控線粒體生成，還參與調(diào)節(jié)心肌能量代謝^［16-17］。UCP2過表達可減少氧化應激引起的心肌細胞凋亡，對糖尿病心肌有保護作用^［18-19］。故本實驗采用在線粒體功能中起重要作用的PGC-1α、TFAM、NRF-1、UCP2等作為研究指標。

Sirt1是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）依賴的組蛋白去乙酰化酶，大多分布在哺乳動物的心臟、腦、胰腺、肝臟和脂肪組織中，可通過去乙酰化作用調(diào)控PGC-1α，影響線粒體生成。白藜蘆醇^［20］、Exendin-4已被證實可激活Sirt1/PGC-1α通路改善線粒體功能，起到保護心肌作用^［21］。本研究用濃度為35 mmol/L的葡萄糖處理H9c2細胞。細胞活力檢測結果顯示，與5.5 mmol/L葡萄糖組細胞相比，35 mmol/L組細胞活力明顯下降，可以作為體外模擬糖尿病心肌損傷的細胞模型。為探究大黃酸在體外是否可以保護H9c2心肌細胞，用不同濃度（5、10、30 μmol/L）的大黃酸干預高糖處理心肌細胞，結果顯示，與HG組相比，HG＋RH5組、HG＋RH10組、HG＋RH30組細胞活力均有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義。蛋白表達的研究結果顯示高糖可導致H9c2心肌細胞Sirt1、PGC-1α、TFAM水平降低，而大黃酸均可增加上述蛋白的表達。其中10 μmol/L濃度的大黃酸組升高最為明顯，最終選擇10 μmol/L作為大黃酸的干預濃度。

為進一步證實大黃酸是否通過激活Sirt1/PGC-1α通路從而保護心肌細胞，本研究使用EX527來抑制Sirt1。EX527是一種特異性的Sirt1抑制劑，已應用于多項研究^［22-23］。EX527作用于大黃酸干預后的高糖H9c2心肌細胞，實驗結果顯示大黃酸上調(diào)了高糖處理后H9c2細胞Sirt1、PGC-1α、TFAM、NRF-1和UCP2 mRNA水平。與大黃酸處理組相比，EX527處理組上述指標mRNA水平均明顯降低。在蛋白表達水平，與大黃酸組相比，EX527處理組Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白表達均明顯降低，提示EX527可抑制大黃酸引起的Sirt1、PGC-1α、TFAM蛋白的升高。

綜上所述，大黃酸通過激活Sirt1/PGC-1α通路，改善線粒體功能，從而保護心肌細胞，為臨床治療DCM提供了新思路。

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（收稿日期：2022-11-03）

（本文編輯 王雅潔）