姚宇翔 王國強 王可 伊莎 楊欣雅 羅曉霞

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.021

摘? 要：【目的】研究新疆塔里木河上游不同生境細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。

【方法】采用免培養(yǎng)和可培養(yǎng)方法，研究塔里木河上游流域原始生境與人工開發(fā)后生境細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異，同時對分離的1株潛在新種進行多相分類鑒定。

【結(jié)果】原始生境與人工開發(fā)后生境細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異明顯，人工開發(fā)后生境細菌α多樣性低于原始生境，不同生境細菌β多樣性差異較大。變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌群，并獲1株鏈霉菌屬潛在新物種。

【結(jié)論】塔里木河上游不同生境樣品中含有豐富的微生物資源，其細菌群落組成受人為活動的影響較大。

關(guān)鍵詞：不同生境；細菌群落組成；多樣性；多相分類鑒定

中圖分類號：S188??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0708-11

收稿日期（Received）：

2023-07-15

基金項目：

新疆生產(chǎn)建設兵團中青年科技創(chuàng)新領軍人才計劃（1119119）；塔里木放線菌種質(zhì)資源庫建設（TDZKKY202201）；

塔里木大學自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目（TDGRI202204）

作者簡介：

姚宇翔（1999-），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向為微生物資源及其利用，（E-mail）1366307897@qq.com

通訊作者：

羅曉霞（1982-），女，新疆阿拉爾人，教授，博士，碩士生導師，研究方向為微生物資源及其利用，（E-mail）xxluo415@163.com

0? 引 言

【研究意義】塔里木河自然植被、生物多樣性、土壤次生鹽漬化等細菌群落變化已有研究［1-4］。以往微生物群落分析僅使用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，無法檢測環(huán)境中大多數(shù)微生物群落［5-6］，特別是不可培養(yǎng)的微生物群落［7-8］。宏基因組學又叫微生物環(huán)境基因組學、元基因組學［4］。宏基因組學通過與生物信息學的有機結(jié)合，在揭示微生物之間、微生物與環(huán)境之間相互作用的規(guī)律中發(fā)揮了作用，拓展了環(huán)境微生物的研究思路與方法，為從群落水平上全面認識微生物的生態(tài)特征和功能開辟了新的途徑［9］。對塔里木河上游原始生境與開發(fā)后的生境微生物的多樣性進行探究，對于科學管理綠洲生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。【前人研究進展】目前研究較多集中于湖泊、河流、森林濕地、熱泉冷泉、海洋等細菌多樣性的分布組成［10-11］，而對于塔里木河上游微生物群落結(jié)構(gòu)的研究多集中于植物根際，例如檉柳［12］、胡楊［13-16］等?！颈狙芯壳腥朦c】原始生境與人工開發(fā)后生境細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異明顯，需研究塔里木河上游不同生境細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。【擬解決的關(guān)鍵問題】以塔里木河上游流域不同生境的水體和土壤樣品為研究材料，比較分析原始生境和人為開發(fā)后的生境的細菌群落結(jié)構(gòu)，為指導細菌群落多樣性、群落結(jié)構(gòu)差異及群落潛在功能提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

1.1.1? 土樣采集

采集地點位于塔里木河上游（40°32′2″N，81°17′58″E）不同生境的土壤樣品，包括農(nóng)田排堿渠底泥（S1）、阿拉爾人工湖底泥（S3）、東湖底泥（S-Y）、臺蘭河底泥（S-m）、塔里木河底泥（S4）、塔里木河底泥（S-T）、農(nóng)田灌溉水底泥（S2）、農(nóng)田耕作土樣（S-M）。采用等距采樣法，用直徑5 cm的不銹鋼土鉆取0～20 cm的土壤樣品，取5鉆，每鉆點取樣量一致，并均勻混合，保存于滅菌密封。

1.1.2? 水樣采集

采集地點位于塔里木河上游（40°32′2″N，81°17′58″E）不同生境的水體樣品，包括：農(nóng)田灌溉水樣（EG），阿拉爾人工湖水樣（ZF），東湖（BM），塔里木河水樣（TA）。采用等距采樣法：取水深20 cm處，每個樣品25 L放于滅菌密封桶中。

1.2? 方 法

1.2.1? 基因組DNA提取和測序

土樣使用SDS高鹽法手提土壤基因組后再使用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒進行純化。水樣使用0.22 μm的濾膜對10 L水樣樣品進行過濾富集。樣品委托南京派森諾生物科技有限公司基于Illumina MisSeq技術(shù)測序平臺構(gòu)建文庫，進行高通量雙末端測序。根據(jù)相似度，將序列聚類為操作分類單元（OTU），相似度閾值為97%。使用RDP分類器對序列進行系統(tǒng)分類，并在各分類級別上對物種進行統(tǒng)計。

1.2.2? 生物信息學分析

使用QIIME2軟件對獲得的高質(zhì)量序列，按97%的序列相似度進行歸并和OTU（operational taxonomic units，OTU）劃分，細菌基于Silva參考數(shù)據(jù)庫進行比對，得到每個OTU對應的物種分類信息［12］；根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，使用QIIME2軟件，獲得每個樣本在各分類水平的群落組成［13］；使用QIIME2軟件分別對每個樣本計算Ace、Chao1、Shannon，Simpso指數(shù)等4種α多樣性指數(shù)；使用R軟件，基于UniFrac距離算法PcoA（Principal coordinate analysis），進行β多樣性分析。

1.2.3? 菌株篩選

采用IChip技術(shù)分離不同區(qū)域樣品的可培養(yǎng)菌種，選取11種培養(yǎng)基進行菌種分離。菌株分離純化后保存于20%的甘油管中于-20℃低溫保存［18-19］。

1.2.4? 細菌多相分類鑒定

采用《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》對菌株基因特征、形態(tài)特征、生理生化特征、化學特征、全基因組測序、注釋及分析等進行鑒定［17］。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用QIIME2軟件計算樣品的Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于表征其豐富度和多樣性。

Rank-abundance曲線可用來解釋多樣性的兩個方面，即物種豐度和物種均勻度。Rank-abundance在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。以各個樣品的OTU序列數(shù)由大到小等級排序，再以OTU 等級為橫坐標，以每個OTU 中所含的序列數(shù)為縱坐標做圖。

Beta多樣性是指沿著環(huán)境梯度變化的不同群落之間，物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，也被稱為生境間多樣性（between-habitat diversity）。根據(jù)不同樣本的OTU豐度計算Bray curtis，加權(quán)Unifrac和未加權(quán)Unifrac距離，評估不同樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。Beta多樣性分析通過PcoA（主坐標分析）解析各個樣本之間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異和不同分類對樣本差異的影響。研究采用QIIME2軟件分析塔里木河上游不同生境樣品微生物Beta分析，包括PCoA分析及樣本間物種組成的遺傳距離。

使用層次聚類方法，使用R語言stat包的uclust函數(shù)，對Bray-Curtis距離矩陣采用UPGMA算法進行聚類分析，計算土樣和水樣各樣品間距離。

借助ASVs（Amplification Sequence Variants）豐度表制作韋恩圖進行分析。

使用熱圖進行反映各樣品間微生物群落中物種組成相似性、差異性、物種聚類關(guān)系物種組成分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 塔河流域上游不同生境16SrRNA基因序列多樣性

研究表明，水樣樣品共得到336 046條高質(zhì)量序列，其中TA、ZF、EG、BM樣品分別為130 988、106 818、102 301、113 829條，土壤樣品共得到696 234條高質(zhì)量序列，其中S-T、S4、S-M、S-Y、S-m、S3、S2、S1樣品分別為58 271、77 641、90 095、94 229、71 627、113 845、78 668、111 858條。按97%的序列相似度進行歸并和OUT聚類，水樣獲得了2 468個可分類的操作單元，土樣獲得了3 721個可分類的操作單元。水樣可劃分為88門、294綱、436目、601科、861屬、287種，土樣可劃分為212門、504綱、836目、1 020科、830屬、220種。原始生境樣品可劃分為133門、327綱、552目、694科、630屬、47種，人工改造的生境樣品可劃分為167門、372綱、720目、927科、1061屬、341種。表1

2.2? 塔河流域上游不同生境微生物群落組成

研究表明，土樣經(jīng)鑒定得到212門、504綱、836目、1 020科、830屬的細菌物種信息，水樣經(jīng)鑒定得到88門、294綱、436目、601科、861屬的細菌物種信息。在門水平上，土樣均以變形菌門（Proteobacteria）（38.45%）、未分類細菌門（unclassified_Bacteria）（17.81%）、放線菌門（Actinobacteria）（17.12%）為主，其中農(nóng)田排堿渠底泥以變形菌門（Proteobacteria）（41.06%）、厚壁菌門（Firmicutes）（23.81%）、未分類細菌門（unclassified_Bacteria）（14.37%）為主（圖1-A）。水樣細菌群落菌門主要屬于4個類群，分別是變形菌門（Proteobacteria）（65.25%）、放線菌門（Actinobacteria）（12.15%）、擬桿菌門為主（Bacteroidetes）（9.91%）和浮霉菌門（Planctomycetes）（6.20%）。農(nóng)田灌溉水樣和塔里木河水樣以變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門為主（Bacteroidetes）（圖1-B）。人工湖水樣以變形菌門和浮霉菌門為主，東湖水樣以變形菌門為主。在屬水平上，土樣中共存在830個屬，包括芽孢桿菌（Bacillus）（20.93%）、γ變形菌屬（γ-proteobacteria）（8.12%）、伯克氏菌屬（Burkholderiaceae），（8.05%）、根瘤菌屬（Rhizobiales）（5.64%）、動球菌屬（Planococcaceae）（9.02%）、紅桿菌屬（Rhodobacteraceae）（6.32%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderiaceae）（5.41%）等8個主要的細菌群落菌屬類群，其中未分類細菌屬占36.12%（1-C）。農(nóng)田灌溉水底泥樣品共注釋到114個屬，阿拉爾人工湖底泥樣品共注釋到91個屬，塔里木河底泥樣品共注釋到117個屬，農(nóng)田耕作土樣品共注釋到78個屬，臺蘭河底泥樣品共注釋到102個屬，塔里木河底泥樣品共注釋到112個屬，東湖底泥樣品共注釋到95個屬，結(jié)果表明原始生境的土壤樣品細菌群落組成更為豐富。水樣細菌群落菌屬主要有8個類群，包括生絲單胞菌屬（Hyphomonas）（16.56%）、微桿菌屬（Microbacteriaceae）（7.24%）、出芽菌屬（Gemmataceae）（21.42%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（12.00%）、氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga） （10.95%）、極胞菌屬（Polaromonas）（8.40%）、黃桿菌屬（Flavobacterium）（8.07%）、水棲菌屬（Enhydrobacter）（45.59%）等 。農(nóng)田灌溉水樣共注釋到236個屬，人工湖水樣共注釋到226個屬，東湖水樣共注釋到221個屬，塔里木河水樣共注釋到178個屬。圖1

2.3? 微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.3.1? 微生物組成alpha多樣性

研究表明，

所有樣品共獲得的細菌有效序列總數(shù)為1 032 580。其中水樣中獲得的細菌平均有效序列總數(shù)高于土樣，且塔里木河水樣獲得的細菌有效序列總數(shù)最多。阿拉爾人工湖底泥樣品中的Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)最低，土樣中臺蘭河底泥和塔里木河底泥中的Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)最高，水樣中農(nóng)田灌溉水、東湖樣本中的Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)最高。水樣中東湖、農(nóng)田灌溉水樣和阿拉爾人工湖水樣Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)較高，而塔里木河水樣Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)較低，結(jié)果表明開發(fā)后生境水樣樣品比原始生境水樣樣本群落的豐富度高，物種親緣關(guān)系較遠。表2

在土樣中的原始生境與人工改造后生境土樣相比，原始生境群落豐富度要高、物種親緣關(guān)系更遠、均勻度高，在水樣中人工改造后生境豐富度要高、物種親緣關(guān)系更遠、均勻度高。塔里木河上游的水樣與人工改造后的生境群落結(jié)構(gòu)α多樣性表現(xiàn)則相反。圖2

2.3.2? Beta多樣性分析

研究表明，水樣中塔里木河水樣與其他水樣相比，微生物群落結(jié)構(gòu)差異最大，土樣中塔里木河底泥和臺蘭河底泥微生物群落結(jié)構(gòu)相比較其他土樣有明顯差異。塔里木河底泥、臺蘭河底泥及塔里木河水樣細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，進化關(guān)系較遠。圖3

土樣樣本在距離為 0.035 處聚成3 組，水樣樣本在距離為 0.032 處聚成2組。在土樣中8個土樣樣本共聚為3大分支，塔里木河底泥細菌群落結(jié)構(gòu)相似度最高，與農(nóng)田耕作土樣關(guān)系較近，農(nóng)田灌溉水底泥、農(nóng)田耕作土樣、農(nóng)田排堿渠底泥與阿拉爾人工湖底泥細菌群落相似度較高，東湖底泥細菌群落單獨成一個分支。在水樣中4個水樣樣本共聚為2大分支，東湖水樣與阿拉爾人工湖水樣細菌群落結(jié)構(gòu)相似度最高，農(nóng)田灌溉水單獨成一個分支。圖4，圖5

2.3.3? 不同樣品間物種差異

研究表明，在土樣中，塔里木河底泥的ASVs數(shù)目最多，阿拉爾人工湖底泥的ASVs數(shù)目最少；8個土樣樣品中共有12個相同的ASVs，占ASVs總數(shù)的0.053%。由于塔里木河床土樣長期處于裸露狀態(tài)，因此塔里木河底泥（S4）與塔里木河床土樣（S-T）相同ASVs非常少，而塔里木河河床土樣特有ASVs非常豐富。在水樣中，阿拉爾人工湖水樣樣品細菌豐富度最高，含4 808個ASVs。豐富度最低的是塔里木河水樣樣品，ASVs數(shù)為912。4個水樣樣品中有11個相同的ASVs，占總樣本數(shù)ASVs數(shù)的0.09%，4個樣本中細菌組成基本不相似。東湖水樣特有的ASVs為3 467，農(nóng)田灌溉水樣特有的ASVs為3 006，塔里木河水樣特有的ASVs為729，阿拉爾人工湖特有的ASVs為4 808。圖5，圖6

在土樣中，原始生境在物種組成上較為相似，均含有一些黃桿菌屬（Flavobacterium）、粘細菌屬（Phaselicystis）、地上桿菌屬（Pedobacter）等。塔里木河底泥與臺蘭河底泥都含有拉氏噬冷菌屬（Algoriphagus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。塔里木河河床土樣與塔里木河底泥均含有Wstewater metagenome、CL500-29 marine group、ADurb.BinO63-1等，其余的人工改造生境土樣均各自含有特殊的菌屬，差異性較大。在水樣中，阿拉爾人工湖水樣與東湖水樣在物種組成上較為相似，都含有ngcl 群、假單胞菌屬（Pseudomonas）、噬甲基菌屬（Methylophilus）、厭氧繩菌屬（Reyranella）等。塔里木河水樣與農(nóng)田灌溉水樣均具有獨特菌屬。原始生境細菌群落較為相似，有較多共同的菌屬，而原始生境與人工改造生境細菌群落差異明顯。圖6

2.4? 可培養(yǎng)法揭示塔里木河上游細菌的多樣性

研究表明，采用甘油精氨酸培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基和P4培養(yǎng)基對8個土樣和1個水樣進行細菌分離培養(yǎng)。共分離到270株菌。從土樣和水樣中共分離到58個物種，252株放線菌，18株變形菌，分為3個屬：鏈霉菌屬（Streptomyeces）、北里孢菌屬（Kitasatosporia）、諾卡氏菌屬（Nocardia）。從塔里木河底泥樣品分離到的放線菌，在種屬和數(shù)量水平上以鏈霉菌屬為優(yōu)勢屬，占比97.76%。分離的252株放線菌中，有17株菌株相似性小于98.65%，為潛在新物種。圖7

2.5? TRM49032菌株的多相分類鑒定

研究表明，從塔里木河底泥中分離得到的菌株TRM 49032為1株鏈霉菌，該菌株基內(nèi)菌絲為棕色，氣生菌絲為白色，且菌絲體伴有桿狀分生孢子（直徑1.5～2.0 μm）；菌株TRM 49032與其最相似菌株相似性為97.64%，經(jīng)系統(tǒng)進化分析成獨立的分支，為1株潛在新物種。該菌株基因組DNA的G+C含量為70.4%。菌株在ISP1、ISP2、ISP4、ISP6及高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上生長良好，且在上述除ISP1培養(yǎng)基外的四種培養(yǎng)基上均會產(chǎn)生棕色可溶性色素；菌株生長溫度耐受溫度為16～51℃，最適生長溫度為31℃，pH耐受范圍為5.0～12.0，最適pH為8.0，耐受NaCl濃度為0%～8%，最適NaCl濃度為2%～3%；菌株能夠以葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖作為唯一碳源利用，其中最適碳源為葡萄糖；菌株明膠液化反應和硝酸鹽還原反應、氧化酶和過氧化氫酶反應、脂肪酶產(chǎn)生與纖維素分解為陽性，牛奶胨化、硫化氫產(chǎn)生、黑色素產(chǎn)生為陰性；菌株TRM 49032全細胞壁糖組分由核糖、甘露糖和葡萄糖組成，主要醌類型為MK-9（H2），MK-9（H4），MK-9（H6）和MK-9（H8） ，極性脂類型為雙磷脂酰甘油（DPG），磷脂酰甲基乙醇胺（PME），磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰膽堿（PC），磷脂酰肌醇（PI）；主要脂肪酸類型為iso-C16∶0，anteiso-C17∶0，anteiso-C15∶0和iso-C16∶1?；诰闠RM 49032基因型特征、形態(tài)學特征、生理生化特征、化學分類特征，確定TRM 49032為鏈霉菌屬的一株新物種。圖8

3? 討 論

3.1

農(nóng)田排堿渠底泥、農(nóng)田灌溉水底泥、農(nóng)田耕作土和臺蘭河底泥均含有大量的γ-變形菌，在農(nóng)田灌溉水樣、塔里木河水樣和東湖水樣中含有大量的α-變形菌。γ-變形細菌在沿海沉積物中的暗碳固著中占主導地位。α-變形菌在分解和同化有機沉積物中有顯著作用，γ-變形菌、α-變形菌和Deltaproteobacteria是大多數(shù)烴類污染海洋沉淀物的主要優(yōu)勢菌，且通常具有降解石油、石油烴、芳烴等碳氫化合物的功能［18-22］。農(nóng)田灌溉水樣中的主要菌屬為生絲單胞菌屬（Halobacillus）（16.56%）、變形菌屬（Deltaproteobacteria）（9.39%）、未培養(yǎng)生絲單胞菌屬（8.62%）、未分類微桿菌屬（7.24%）；Deltaproteobacteria在天然有機鹵化物循環(huán)中起重要作用，生絲單胞菌屬是一種發(fā)芽的假肢細菌，主要存在于海洋環(huán)境中，大多數(shù)是從石油降解微生物群落中分離出來的［23-24］。

3.2

塔里木河上游水樣中氫噬胞菌屬（10.95%）、極胞菌屬（8.40%）和黃桿菌屬（8.07%）為優(yōu)勢菌屬。黃桿菌生活在溫帶和極地地區(qū)的各種環(huán)境中，包括陸地、湖泊、海洋、冰川、植物、動物等［25］，目前共發(fā)現(xiàn)7種耐冷黃桿菌屬物種，均從冰川中收集到［26］，極胞菌屬是冰川微生物群系的重要組成部分，目前共發(fā)現(xiàn)9種極孢菌屬物種［27-28］，塔里木河上游水溫較冷，主要水源來自冰川，塔里木河上游水樣中豐度較高的極胞菌屬和黃桿菌屬可能來自該冰川融水。黃桿菌可除氮和磷及有機物的降解［27］，氫噬胞菌屬能夠脫氮并降解多種有機物［29］。后期可設計特異性培養(yǎng)基針對黃桿菌屬和氫噬孢菌屬特殊功能菌株進行分離，豐富和完善塔里木河上游極端環(huán)境微生物菌種庫。

4? 結(jié) 論

在人為因素影響下的生境與原始生境細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，細菌α多樣性低于原始生境，細菌β差異性明顯減弱。人工開發(fā)生境細菌結(jié)構(gòu)相互之間差異性減小。8個土樣1個水樣分離并測序得到3屬，58種，270株菌株。并得到了1株鏈霉菌潛在新物種，并對其進行了新種多相分類鑒定。

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Analysis of the bacterial communities structure and diversty of the Tarim River in different habitats

YAO Yuxiang1，2，WANG Guoqiang2，WANG Ke2，YI Sha2，YANG Xinya2，LUO Xioaxia1，2

（1.Key Laboratory Biological Resources Conservation and Utilization in Tarim Basin，Xinjiang Production and Construction Corps，Tarim University，Aral Xinjiang 843300，China; 2 School of Life Science and Technology，Tarim University，Aral Xinjiang 843300，China）

Abstract：【Objective】 Analysis of the bacterial communities structure and diversty of the Tarim River in different habitats.

【Methods】 The culture-free and cultivable methods were used in this study to explore the bacterial community structure and diversity of Tarim River，and also identified a potential new species by using the polyphasic taxonomy method.

【Results】 There were significantly difference of bacterial community between the original habitat and the artificially developed habitat.There was lower alpha diversity of the artificially developed habitat than the original habitat，and it had multiple difference of the beta diversity among the different habits.Based on the cultivable methods，the Proteobacteria and Actinomycota were dominant bacterial groups in these habitats.According to the polyphasic taxonomy method，a potential new species was identified.

【Conclusion】? There are multiple microbial resources in different habitats of the Tarim River.The bacterial community structure has been affected by human activities.

Key words：different habitats; bacterial community structure; diversity;the polyphasic taxonomy

Fund projects： Young and middle-aged scientific and technological innovation leader program of XPCC（1119119）; Construction of the Germplasm Resource Bank of Actinomyces tarimus（TDZKKY202201）; Tarim University Autonomous Region Postgraduate Research Innovation Project（TDGRI202204）

Correspondence author： LUO Xiaoxia（1982-），female，from Aral，Xinjiang，professor，research interests：microbial resources and their utilization，（E-mail） xxluo415@163.com