王凱迪 高晨旭 裴文鋒 楊書賢 張文慶 宋吉坤 馬建江 王莉 于霽雯 陳全家

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.001

摘? 要：【目的】鑒定陸地棉TRM基因家族序列及理化性質(zhì)，分析與棉纖維品質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異單倍型基因差異。

【方法】利用生物信息學(xué)分析陸地棉TRM基因家族進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)和聚類表達(dá)；利用基因單倍型效應(yīng)分析篩選調(diào)控纖維品質(zhì)性狀（纖維長度、比強(qiáng)度、馬克隆值）的候選基因。

【結(jié)果】陸地棉TRM基因家族編碼的氨基酸為376～1 093，等電點(diǎn)為4.64～9.56。亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)多達(dá)60個(gè)陸地棉TRM基因家族定位于細(xì)胞核中。TRM基因家族含有較多的光響應(yīng)、激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育相關(guān)的元件。60個(gè)TRM基因家族在纖維發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢表達(dá)，調(diào)控棉花纖維發(fā)育。每個(gè)基因的單倍型個(gè)數(shù)為1～8，并篩選到纖維長度、強(qiáng)度以及馬克隆值相關(guān)的優(yōu)異單倍型TRM基因分別有14、18和15個(gè)，其中有11個(gè)基因同時(shí)具有長度、強(qiáng)度、馬克隆值3種改良纖維品質(zhì)的優(yōu)異單倍型。GH_D09G0775的Hap_4單倍型和GH_D03G1434的Hap_3單倍型在增加纖維長度、強(qiáng)度的同時(shí)降低了馬克隆值。

【結(jié)論】在陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中鑒定出75個(gè)TRM基因家族成員分布在24條染色體上，系統(tǒng)進(jìn)化將其分為Cluster Ⅰ～Ⅲ 3個(gè)亞族。

關(guān)鍵詞：陸地棉；基因家族；基因表達(dá)；纖維品質(zhì)；單倍型

中圖分類號(hào)：S562??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號(hào)：1001-4330（2024）03-0521-16

收稿日期（Received）：

2023-07-11

基金項(xiàng)目：

河南省農(nóng)業(yè)良種聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（2022010301）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021D01B113）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610162022013）

作者簡介：

王凱迪（1998-），男，陜西延安人，碩士研究生，研究方向?yàn)槊藁ǚ肿佑N，（E-mail）424416709@qq.com

通訊作者：

于霽雯（1978-），女，河南安陽人，研究員，博士，碩士生/博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊藁ǚ肿佑N，（E-mail）yujw666@hotmail.com

陳全家（1972-），男，新疆烏魯木齊人，教授，博士，碩士生/博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊藁ㄟz傳育種，（E-mail）chqjia@126.com

0? 引 言

【研究意義】棉纖維是紡織工業(yè)的主要原料［1］。棉纖維品質(zhì)的優(yōu)劣關(guān)系到棉紡織品的質(zhì)量，因此改良棉纖維品質(zhì)是棉花育種的主要目標(biāo)。常見的異源四倍體棉種陸地棉由A和D兩個(gè)二倍體亞組組成［2］，其基因組已經(jīng)公布［3-4］。GRAND（http：//grand.cricaas.com.cn/home）數(shù)據(jù)庫公布的棉屬表達(dá)數(shù)據(jù)為開展基因家族的全基因組鑒定與生物信息學(xué)分析提供了基礎(chǔ)信息［5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TRM（TON1 Recruiting Motif）基因家族對(duì)于植物生長發(fā)育起著重要作用，其基因家族分析在多種植物中已完成［6］。在擬南芥中鑒定到34個(gè)TRM蛋白，所有TRM中擁有6個(gè)短保守基序，其中一個(gè)是與TON1相互作用的基序。TRM1能夠與微管蛋白結(jié)合，并通過與TON1的相互作用將其招募到微管蛋白［7］。TRM5是TRM 基因家族的一個(gè)重要成員，AtTRM5對(duì)擬南芥的生長發(fā)育起著重要作用，AtTRM5突變體具有明顯的發(fā)育缺陷表型如葉片生長變慢、花發(fā)育遲緩、根變短等［8］。TRM4與擬南芥種子粘液質(zhì)的分泌相關(guān)［9］。TRM7與TRM8突變體損害有絲分裂前期的早前期帶（preprophase band，PPB）的形成，但不影響間期微管［10］。Tang 等［11］的研究將擬南芥中AtTRM6突變后會(huì)導(dǎo)致胚胎致死和種子敗育?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】生物信息學(xué)方法在全基因組分析中發(fā)揮著重要作用，棉花的多個(gè)重要基因家族已經(jīng)通過生物信息學(xué)的全基因組分析取得了相應(yīng)成果［12-13］。作物種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著豐富遺傳優(yōu)異等位基因，可以鑒別與表型性狀相關(guān)的候選基因核苷酸變異，還可以評(píng)估新的單倍型等［14］。TRM基因在植物的生長發(fā)育中起著重要作用，而陸地棉TRM基因家族鑒定及纖維品質(zhì)相關(guān)優(yōu)異單倍型分析仍未見報(bào)道。需研究鑒定陸地棉TRM基因家族的序列及分析纖維品質(zhì)相關(guān)優(yōu)異單倍型?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集已公布的陸地棉基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析棉花TRM基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)變異﹑共線性關(guān)系和基因表達(dá)模式以及單體型，為研究TRM基因在陸地棉中的相關(guān)功能提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

陸地棉TRM基因家族下載陸地棉（http：//www.cottonfgd.org/）［15］的基因組序列與注釋數(shù)據(jù)。根據(jù)擬南芥TRM家族蛋白序列，依據(jù)BLASTP［16］（E值設(shè)為1e-5）及TRM家族的隱馬爾科夫模型文件PF14383、PF14309，HMMER程序［17］陸地棉TRM基因家族同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。通過在線工具NCBICD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和Search Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）進(jìn)行驗(yàn)證，過濾掉保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列，得到TRM家族成員序列。借助TBtools［18］（Protein Paramter Calc）計(jì)算棉花TRM家族成員的分子量和等電點(diǎn)。利用亞細(xì)胞定位工具 WoLF PSORT（https：/l/wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測陸地棉TRM基因家族的亞細(xì)胞定位。

1.2? 方 法

1.2.1? 陸地棉TRM基因家族的進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域

利用MEGA11［19］內(nèi)置的Clustal W［20］對(duì)陸地棉TRM蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法（Neibour-joining method），Bootstrap重復(fù)1 000次構(gòu)建進(jìn)化樹。利用TBtools［18］分析陸地棉TRM基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)。利用在線工具 MEME（http：//meme-suite.org/）分析TRM蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，最大基序設(shè)置為10，其他參數(shù)為默認(rèn)值，同時(shí)利用NCBI Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析TRM蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，用TBtools［18］進(jìn)行可視化。

1.2.2? 陸地棉TRM基因家族的染色體定位與順式作用元件

利用TBtools陸地棉TRM基因家族成員在染色體上的位置圖。TBtools［18］從基因組序列中提取TRM基因家族上游2 000 bp作為啟動(dòng)子序列，運(yùn)用在線工具 PlantCARE［21］分析啟動(dòng)子順式作用元件。

1.2.3? 陸地棉TRM基因家族成員的共線性

利用TBtools［18］軟件分析TRM家族在陸地棉中成員的共線性關(guān)系，最小模塊設(shè)置為5個(gè)基因。

1.2.4? 陸地棉TRM基因家族的表達(dá)

從三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到TRM基因家族在不同組織中的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)［22］，使用TBtools［18］軟件將數(shù)據(jù)制作熱圖進(jìn)行可視化。

1.2.5? 陸地棉TRM基因家族成員單倍型

使用cottonMD（http：//yanglab.hzau.edu.cn/cott/PublicFun/total_jump target=vir/search&gene）所提供的基因型和表型數(shù)據(jù)［23］，以及基因內(nèi)snp和Indel作為分型依據(jù)，進(jìn)行基因分型，結(jié)合群體纖維品質(zhì)表型數(shù)據(jù)，對(duì)各單倍型的效應(yīng)進(jìn)行分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 陸地棉TRM基因家族數(shù)量及其理化性質(zhì)

研究表明，陸地棉TRM基因家族 CDS 長度在1 131（GH_A08G1551.1與GH_D08G1569.1）～3 282（GH_A07G0755.1）bp，氨基酸數(shù)在376～1 093，分子量在42.82（GH_D08G1569.1）～120.99（GH_A07G0755.1）kD，理論等電點(diǎn)為4.64～9.56，其中40個(gè)基因編碼蛋白呈酸性，其余為堿性。有2個(gè)蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，分別為GH_A01G2363.1、GH_D01G2442.1，2個(gè)蛋白定位在液泡中，分別為GH_A09G1944.1、GH_D09G1898.1，8個(gè)蛋白定位在葉綠體中，分別為GH_A08G2091.1、GH_A09G2222.1、GH_A11G1709.1、GH_A11G3723.1、GH_D08G2107.1、GH_D10G2421.1、GH_D11G1747.1、GH_D11G3750.1，3個(gè)蛋白定位在線粒體中，分別為GH_A12G2487.1、GH_D02G0253.1、GH_D12G2500.1，其60個(gè)蛋白全部定位在細(xì)胞核內(nèi)。表1

2.2? 陸地棉TRM基因家族的進(jìn)化與結(jié)構(gòu)

研究表明，擬南芥中34個(gè)TRM基因家族與陸地棉中的75個(gè)TRM基因家族能聚類為3個(gè)亞組。其中Cluster Ш中成員最多，TRM基因家族數(shù)量最多，包含52個(gè)（36個(gè)陸地棉TRM基因和16個(gè)擬南芥TRM基因），家族成員占總數(shù)的48%。圖1

TRM基因家族的外顯子個(gè)數(shù)在2～7個(gè)，并

從中共鑒定出10個(gè)保守基序依次命名為Motif 1 ～ Motif 10。所有TRM基因家族成員均含有相同的保守基序Motif 4，另外有47個(gè)具有N端的Motif 5 ，其余28個(gè)缺失 N端的Motif 5。保守結(jié)構(gòu)域除了GH_D12G2464.1、GH_A12G2452.1、GH_D01G1490.1以外，其余都含有DUF4378結(jié)構(gòu)域。圖2，圖3

2.3? 陸地棉TRM基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件

研究表明，TRM基因家族含有較多的光響應(yīng)相關(guān)元件、激素反應(yīng)相關(guān)元件、脅迫響應(yīng)相關(guān)元件和生長發(fā)育相關(guān)元件。其中光反應(yīng)元件的數(shù)量較多且種類豐富。在激素響應(yīng)元件中，生長素響應(yīng)元件含量較多。圖4

2.4? 陸地棉TRM基因家族的染色體分布與共線性

研究表明，陸地棉TRM基因家族在染色體上的分布比較廣泛，且數(shù)量有較大差異。其中A08、A09、A11、D07、D08、D09和D11共7條染色體均有多達(dá)5個(gè)基因，在A07染色體分布有4個(gè)基因，在A01、A12、D01、D02、D12 5條染色體分布有3個(gè)基因，在A02、A03、A05、A10、D03、D04、D05、D10 8條染色體上分布有2個(gè)基因，在A04、A13、D13三條染色體上分布有1個(gè)基因。圖5

160個(gè)共線性基因?qū)ζ渲蠥亞族有29對(duì)，D亞族有30對(duì)，AD亞族有101對(duì)，陸地棉TRM基因家族為種間協(xié)同進(jìn)化。圖6

2.5? 陸地棉TRM基因家族的表達(dá)

研究表明，75個(gè)陸地棉TRM基因家族成員分為3個(gè)亞家族，其中第Ⅰ亞家族共有17個(gè)成員，普遍在纖維中優(yōu)勢表達(dá)，第Ⅱ亞家族有35個(gè)成員，普遍在0 d的胚珠與早期纖維中優(yōu)勢表達(dá)。第Ⅲ共有共23個(gè)成員，在植物的各個(gè)組織中都有表達(dá)。圖7

2.6? 陸地棉TRM基因家族的單倍型

研究表明，全部陸地棉TRM基因家族成員在1 245陸地棉材料中基因的單倍型個(gè)數(shù)在1～8個(gè)。其中在46個(gè)基因中鑒定出與棉花纖維的長度、強(qiáng)度、馬克隆值相關(guān)的優(yōu)異單倍型。表2

與纖維長度相關(guān)單倍型的基因有41個(gè)，其中有14個(gè)基因攜帶顯著增長纖維長度的優(yōu)異單倍型。與纖維強(qiáng)度相關(guān)單倍型的基因有38個(gè)，其中18個(gè)基因攜帶顯著增強(qiáng)纖維強(qiáng)度的優(yōu)異單倍型。與馬克隆值相關(guān)單倍型的基因有35個(gè)，其中15個(gè)基因攜帶顯著降低馬克隆值的優(yōu)異單倍型。由于其中一些優(yōu)異單倍型存在一因多效，29個(gè)基因同時(shí)擁有與纖維長度、強(qiáng)度、馬克隆值均具有顯著差異的單倍型，其中11個(gè)基因的攜帶一因多效的優(yōu)異單倍型。其中GH_D09G0775的Hap_4單倍型顯著增長纖維長度，增強(qiáng)纖維強(qiáng)度，顯著降馬克隆值；GH_D03G1434的Hap_3單倍型同樣顯著增長纖維長度，增強(qiáng)纖維強(qiáng)度，顯著降低馬克隆值。圖8

3? 討 論

有報(bào)道顯示TRM1能夠與微管蛋白結(jié)合，并通過與TON1的相互作用將其招募到微管蛋白［7］。AtTRM5對(duì)擬南芥的生長發(fā)育起著重要作用，AtTRM5突變體具有明顯的發(fā)育缺陷表型如葉片生長變慢、花發(fā)育遲緩、根變短等［8］。AtTRM4參與纖維素的合成從而調(diào)控?cái)M南芥種子粘液質(zhì)的沉積［9］。

基因組質(zhì)量的完整性是全基因組水平分析基因家族的基礎(chǔ)。隨著基因組測序技術(shù)的不斷深入，棉花基因組從二倍體棉到四倍體陸地棉不斷更新［24，25，26］。研究通過生物信息學(xué)方法，以擬南芥中的34個(gè)TRM家族蛋白為參考從陸地棉全基因組中鑒定出75個(gè)TRM基因家族成員，依據(jù)進(jìn)化可以將其與75個(gè)陸地棉TRM基因家族成員分為3個(gè)亞族，所編碼的氨基酸數(shù)量在376～1 093，都含有相同的保守結(jié)構(gòu)域MOTIF4（是TON1的互作元件）。陸地棉TRM基因家族成員在除了A06與D06兩條染色體以外的24條染色體上均有分布，共線性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其家族為種間協(xié)同進(jìn)化。Ma等在群體中定位到的mqFL-lg15-3區(qū)間中出現(xiàn)TRM基因家族［27］，TRM基因家族成員普遍在纖維發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢表達(dá)，其可能與纖維發(fā)育相關(guān)。

4? 結(jié) 論

陸地棉TRM基因家族具有豐富的序列及理化性質(zhì)變異，該基因家族在棉花中可能參與不同發(fā)育過程。陸地棉TRM家族成員可能與棉花纖維發(fā)育相關(guān)。共有50個(gè)陸地棉TRM基因在纖維中較高表達(dá)，陸地棉TRM基因潛在調(diào)控棉花纖維發(fā)育。

46個(gè)基因的不同單倍型在纖維品質(zhì)性狀有表型差異，均在纖維中優(yōu)勢表達(dá)，同時(shí)存在一因多效，與纖維長度相關(guān)擁有優(yōu)異單倍型的基因是14個(gè)；與纖維強(qiáng)度相關(guān)擁有優(yōu)異單倍型的基因是18個(gè)；與纖維馬克隆值相關(guān)擁有優(yōu)異單倍型的基因是15個(gè)。同時(shí)擁有與纖維長度、強(qiáng)度、馬克隆值相關(guān)優(yōu)異單倍型的基因是11個(gè)。

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Identification of TRM gene family and fiber quality related excellent haplotype analysis in Gossypium hirsutum L.

WANG Kaidi1，GAO Chenxu2，PEI Wenfeng1，2，YANG Shuxian2，ZHANG Wenqing2，SONG Jikun1，2，MA Jianjiang2，WANG Li2，YU Jiwen1，2，CHEN Quanjia1

（1.Cotton Engineering Research Center，Ministry of Education / College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Anyang Henan 455000，China）

Abstract：【Objective】 Identification of TRM gene family and fiber quality related excellent haplotype analysis in Gossypium hirsutum L.

【Methods】 Bioinformatics was used to analyze the evolutionary relationship，physicochemical properties and cluster expression of TRM gene families.Candidate genes regulating fiber quality traits（fiber length，strength，and Macron value） were screened by gene haplotype analysis.

【Results】 The analysis of physicochemical properties showed that the amino acids encoded by this family gene ranged from 376-1，093，with isoelectric points ranging from 4.64-9.56.Subcellular localization predicted that up to 60 TRM family genes were localized in the nucleus.The results of cis-acting element analysis showed that TRM gene family contained more elements related to light response，hormone response，stress response and growth and development.Transcriptome data showed that 60 TRM family genes were expressed preferentially during fiber development，which might regulate cotton fiber development.Furthermore，1，245 upland cotton materials were used to genotype TRM，and the number of haplotypes of each gene was found to be 1-8，and 14，18 and 15 excellent haplotype TRM genes related to fiber length，strength and Macron value were screened，respectively.Among them，11 genes had excellent haplotypes of length，strength and micronotype.The Hap_4 haplotype of GH_D09G0775 and the Hap_3 haplotype of GH_D03G1434 increased fiber length and strength while decreasing the Macron value.

【Conclusion】 In this study，75 TRM family members were identified on 24 chromosomes in upland cotton（Gossypium hirsutum L.），which were systematically divided into cluster evolution Ⅰ-Ⅲ3 subtribe.

Key words：Gossypium hirsutum L.; gene family; gene expression; fiber quality; haploidgenotype

Fund projects：Henan Province Agricultural Improved Seed Joint Research Project（2022010301）; Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region（2021D01B113）; Basic Research Funds for Public Welfare Research Institutes of the Central Government（1610162022013）

Correspondence author：YU Jiwen（1978-），female，Anyang，from Henan，researcher，doctors，research direction： cotton molecular breeding，（E-mail） yujw666@hotmail.com

CHEN Quanjia（1972-），male，from Urumqi， Xinjiang，professor，doctors，research direction： cotton genetic breeding，（E-mail）chqjia@126.com