鄔丹丹 潘力 周哲 付威威? 朱海龍 董月芳?

1) (中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所,醫(yī)學(xué)影像技術(shù)研究室,蘇州 215163)

2) (蘇州國(guó)科視清醫(yī)療科技有限公司,蘇州 215163)

近年來(lái),小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像研究.但是,現(xiàn)有的熒光成像系統(tǒng)存在穿透深度有限、圖像信噪比低等缺點(diǎn).因此,利用近紅外二區(qū)(near-infrared-II,NIR-II,900—1880 nm)熒光成像技術(shù)在生物組織中具有的低吸收、低散射和穿透深度深等優(yōu)點(diǎn),研制出一套NIR-II 小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng),提出了一種熒光圖像增強(qiáng)校正方法,并設(shè)計(jì)生物組織模擬實(shí)驗(yàn)和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試該系統(tǒng)的性能和成像效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有穿透深度深、信噪比高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn).結(jié)合商用的吲哚菁綠試劑和聚集誘導(dǎo)發(fā)光染料,該系統(tǒng)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)的血管分布情況,并對(duì)深層組織器官進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè),實(shí)現(xiàn)活體小鼠清醒狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)研究,有助于推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的腫瘤研究和藥物開(kāi)發(fā)研究等進(jìn)入一個(gè)新階段.

1 引言

光學(xué)成像技術(shù)通過(guò)利用光線在生物組織內(nèi)的傳播特性,實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),具有無(wú)電離輻射、安全性高、可視化等優(yōu)勢(shì).活體光學(xué)成像主要包括生物發(fā)光成像和熒光成像,其中生物發(fā)光是通過(guò)熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或活體動(dòng)物,利用其產(chǎn)生的蛋白酶與底物熒光素發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生光學(xué)信號(hào);熒光成像是通過(guò)熒光蛋白、熒光染料、量子點(diǎn)及稀土納米粒子等進(jìn)行標(biāo)記,利用外界光源激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào).相比生物發(fā)光成像,熒光成像技術(shù)的標(biāo)記能力和光學(xué)信號(hào)更強(qiáng),可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)的基因和細(xì)胞變化,具有高分辨率、非侵入、操作簡(jiǎn)單、成像直觀、無(wú)創(chuàng)等顯著優(yōu)點(diǎn)[1,2],廣泛應(yīng)用于腫瘤研究、基因表達(dá)研究、藥物開(kāi)發(fā)研究等.

傳統(tǒng)的熒光成像位于可見(jiàn)光波段(400—760 nm),此波段內(nèi)生物組織存在嚴(yán)重的自身熒光,并且對(duì)光子的吸收和散射作用較強(qiáng),導(dǎo)致熒光成像的信噪比和穿透深度較低(1—2 mm),難以獲取活體動(dòng)物體內(nèi)深層組織的生物信息[3].當(dāng)熒光成像窗口擴(kuò)展到近紅外一區(qū)(near-infrared-I,NIR-I,760—900 nm),生物組織對(duì)光的吸收和散射作用以及生物組織的自身熒光有所降低,提高了NIR-I 熒光成像的穿透深度,但是仍未滿足臨床應(yīng)用需求[4].2009 年,Welsher 等[5]通過(guò)檢測(cè)“交換”單壁碳納米管的固有近紅外光致發(fā)光,首次實(shí)現(xiàn)了大于1000 nm的近紅外活體熒光成像.從此,近紅外二區(qū)(nearinfrared-II,NIR-II,900—1880 nm)活體熒光成像成為研究的一大熱點(diǎn)[6-8].與可見(jiàn)光和NIR-I 熒光成像相比,NIR-II 熒光成像由于光子波長(zhǎng)更長(zhǎng),進(jìn)一步抑制了光在生物組織內(nèi)傳播時(shí)的吸收和散射作用,并且生物組織的自身熒光也隨著波長(zhǎng)的增大顯著下降[9],因此NIR-II 熒光成像的深度大大提高、分辨率和信噪比也較高,更利于活體動(dòng)物體內(nèi)深層組織的生物信息監(jiān)測(cè)[10].

近年來(lái),隨著熒光探針和成像儀器的不斷開(kāi)發(fā)和改進(jìn),研究者們圍繞NIR-II 活體熒光成像在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域進(jìn)行了豐富的科學(xué)探索和應(yīng)用研究,如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院陳小元教授團(tuán)隊(duì)[11]開(kāi)發(fā)了一種多重NIR-II 活體成像系統(tǒng),利用具有顯著抑制的光子散射和零自發(fā)熒光的NIR-II 探針實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的可視化;浙江大學(xué)錢(qián)駿教授團(tuán)隊(duì)與舜宇光學(xué)公司合作開(kāi)發(fā)了一種正置NIR-II 熒光顯微成像系統(tǒng),已應(yīng)用于宮頸癌治療[12]等領(lǐng)域.本文基于NIR-II 熒光成像的原理機(jī)制,自主研制了一套NIR-II 熒光成像系統(tǒng).利用商用的吲哚菁綠(indocyanine green,ICG) 試劑和聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE) 染料,通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)實(shí)際驗(yàn)證該系統(tǒng)的熒光成像效果.結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有穿透深度深、信噪比高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)分布,對(duì)小鼠的深層組織器官進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè),實(shí)現(xiàn)活體小鼠清醒狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)研究.

2 NIR-II 活體熒光成像

2.1 熒光成像的原理機(jī)制

熒光是一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象,如圖1 所示,熒光物質(zhì)受到外界光源激發(fā),當(dāng)光子的能量為分子中某兩個(gè)能級(jí)間的能量差時(shí),熒光物質(zhì)的核外電子會(huì)吸收能量,從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到能量較高的高能級(jí)(第一或第二激發(fā)單重態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)),此時(shí)電子處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài),會(huì)通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫等非輻射躍遷的方式快速降落至激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí),隨后通過(guò)輻射躍遷的方式從最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài),以光子形式釋放能量,發(fā)射出熒光信號(hào).熒光信號(hào)在生物組織內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收和散射作用后,被光學(xué)探測(cè)器捕獲,經(jīng)過(guò)放大處理后傳輸?shù)诫娔X中,得到熒光圖像,這就是熒光成像的原理.

圖1 熒光成像示意圖Fig.1.Schematic diagram of fluorescence imaging.

顯然,熒光成像的關(guān)鍵點(diǎn)在于熒光物質(zhì)和熒光信號(hào)的采集及處理.通常,利用光學(xué)探測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為便于存儲(chǔ)和處理的電信號(hào),實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的采集及處理.傳統(tǒng)的光學(xué)探測(cè)器是硅基探測(cè)器,具有制造工藝成熟和可靠性高等優(yōu)點(diǎn)[13],但是靈敏度較差,并且硅的帶隙能量(1.124 eV)導(dǎo)致硅基探測(cè)器的響應(yīng)波長(zhǎng)通常不高于1100 nm,局限在可見(jiàn)光和NIR-I 波段.為了擴(kuò)展光學(xué)探測(cè)器的響應(yīng)波長(zhǎng),近年來(lái)出現(xiàn)了使用飛秒激光等技術(shù)制備的黑硅探測(cè)器[14-16]、窄帶隙半導(dǎo)體合金碲鎘汞(mercury cadmium telluride,HgCdTe)探測(cè)器[17]以及短波紅外銦鎵砷(indium gallium arsenide,InGaAs)探測(cè)器.其中,黑硅探測(cè)器在紅外波段的響應(yīng)度仍然未能滿足應(yīng)用需求,HgCdTe 探測(cè)器的制造成本高,需要工作在低溫條件下[18],并且HgCdTe 材料對(duì)人體的毒性很大,因此應(yīng)用局限性較大;InGaAs探測(cè)器的響應(yīng)波長(zhǎng)范圍為900—1700 nm,具有工藝成熟、高量子效率、低功耗、低成本等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像、空間遙感、天文等領(lǐng)域[19,20],可以實(shí)現(xiàn)高分辨率、高靈敏度的NIR-II 熒光成像.

2.2 NIR-II 熒光成像的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

生物組織是一種混濁介質(zhì),光子在其中傳播時(shí)同時(shí)存在著吸收和散射作用,如圖2 所示.光在生物組織內(nèi)的吸收和散射作用會(huì)導(dǎo)致能量損耗,衰減熒光信號(hào),其中,光的吸收決定了熒光信號(hào)的強(qiáng)度能否被探測(cè)到,而光的散射會(huì)降低熒光圖像的清晰度[21];同時(shí),生物組織的自身熒光也會(huì)影響到熒光圖像的信噪比和分辨率.因此,為了獲取高質(zhì)量的熒光成像效果,應(yīng)盡可能降低激發(fā)光在生物組織內(nèi)的吸收和散射作用,以及可忽略生物組織的自身熒光.

圖2 生物組織的吸收和散射作用Fig.2.Absorption and scattering of biological tissues.

生物組織中光的吸收主要是由于水、血液中的脫氧血紅蛋白(deoxyhemoglobin,Hb)和氧合血紅蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)、黑色素[22]等導(dǎo)致.在NIR-II 波段,除1400—1500 nm 處存在的吸收峰外,其他波段內(nèi)的吸收均較小,對(duì)熒光信號(hào)的衰減小.血紅蛋白在可見(jiàn)光區(qū)域存在較高的吸收峰,在NIR-II 波段內(nèi)的光吸收較小,更利于熒光信號(hào)在生物組織內(nèi)的傳播[1].在400—1700 nm 范圍內(nèi),隨著波長(zhǎng)的增大,不同生物組織(如腦組織、皮下組織、肌肉)的散射系數(shù)呈現(xiàn)出指數(shù)性降低的趨勢(shì)[1],因此生物組織在在NIR-II 波段內(nèi)的散射作用普遍較小,幾乎可以忽略不計(jì).此外,生物組織的自身熒光主要集中在可見(jiàn)光區(qū)域和NIR-I 波段,在NIR-II 波段,生物組織的自身熒光較小,可以忽略不計(jì)[9].綜上,相比可見(jiàn)光區(qū)域和NIR-I 波段,生物組織在NIR-II 波段的吸收和散射作用較小,并且可以忽略自身熒光,因此NIR-II 熒光成像具有更大的穿透深度、更高的圖像信噪比,更利于生物組織的深度成像檢測(cè).

3 NIR-II 熒光成像系統(tǒng)

3.1 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)搭建

基于熒光成像的原理機(jī)制,采用反射型成像方式搭建NIR-II 熒光成像系統(tǒng),其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3(a)所示,活體小動(dòng)物被固定在恒溫臺(tái)(維持小動(dòng)物生命體征)上,通過(guò)麻醉面罩對(duì)其進(jìn)行持續(xù)麻醉,小動(dòng)物體內(nèi)已注射熒光試劑或染料,受到外界激發(fā)光源照射后發(fā)射出熒光信號(hào).熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)生物組織的吸收和散射作用后到達(dá)組織表面,再經(jīng)過(guò)發(fā)射濾光片和鏡頭后被探測(cè)器接收,最后傳入電腦,處理得到熒光圖像.

圖3 NIR-II 熒光成像系統(tǒng) (a) 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖;(b) 系統(tǒng)三維效果圖Fig.3.NIR-II fluorescence imaging system: (a) Schematic diagram of system;(b) 3D design of system.

本系統(tǒng)采用InGaAs 探測(cè)器采集熒光信號(hào),該探測(cè)器為Raptor Photonics 公司生產(chǎn)的深度制冷近紅外探測(cè)器,光譜響應(yīng)范圍為900—1700 nm,制冷溫度可達(dá)-80 ℃,圖像像素?cái)?shù)量為640×512 pixel,像元尺寸為15 μm,成像速度最快可達(dá)97 frames/s.激發(fā)光源采用808 nm 高功率半導(dǎo)體激光器(功率0—15 W 可調(diào),功率穩(wěn)定性rms ＜3 %),為了使激光器出射的光斑尺寸可以覆蓋小鼠,通過(guò)勻化鏡頭對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)束和均勻處理,處理后的均勻光斑直徑超過(guò)10 cm,可滿足小鼠成像尺寸要求.成像鏡頭采用優(yōu)質(zhì)低畸變短波紅外鏡頭,其焦距為40 mm,光圈范圍為F2.8—F16,在900—1400 nm 波段內(nèi)透射率超過(guò)94%.發(fā)射濾光片采用進(jìn)口優(yōu)質(zhì)長(zhǎng)波通濾光片,截止深度OD 值大于5,用于消除激發(fā)光源對(duì)發(fā)射熒光信號(hào)的干擾.最終設(shè)計(jì)搭建的NIR-II熒光成像系統(tǒng)的三維效果圖如圖3(b)所示.

熒光探針作為熒光成像的關(guān)鍵要素,以熒光物質(zhì)作為指示劑,通常由識(shí)別基團(tuán)、熒光基團(tuán)及連接臂組成.目前,NIR-II 熒光探針可以分為無(wú)機(jī)和有機(jī)兩大類(lèi),與無(wú)機(jī)熒光探針相比,有機(jī)熒光探針具有生物相容性高、毒性小、光學(xué)特性可調(diào)等優(yōu)點(diǎn).有機(jī)熒光探針主要包括小分子熒光探針、聚集誘導(dǎo)發(fā)光納米顆粒和共軛聚合物,其中小分子熒光探針具有高靈敏度、低毒性、較高的臨床轉(zhuǎn)化潛力等顯著優(yōu)點(diǎn)[23].比如,NIR-I 小分子熒光探針I(yè)CG 已經(jīng)通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的認(rèn)證,被廣泛應(yīng)用于臨床研究.近年來(lái),研究者們發(fā)現(xiàn)ICG 具有較強(qiáng)的NIR-II 拖尾熒光發(fā)射,為NIR-II 熒光成像的臨床應(yīng)用提供了新的研究方向[24].此外,為解決有機(jī)熒光團(tuán)常發(fā)生的聚集熒光猝滅(aggregation-caused quenching,ACQ)問(wèn)題,2001 年,唐本忠院士團(tuán)隊(duì)[25]提出了AIE 的概念,此后AIE 分子的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)成為研究的一大熱點(diǎn).相比傳統(tǒng)的熒光染料,AIE 熒光染料具有高亮度、光穩(wěn)定性強(qiáng)、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn).近年來(lái),可用于NIR-II 熒光成像的AIE 染料也逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)[26].因此,本系統(tǒng)采用具有代表性的商用的ICG 試劑(USP 標(biāo)準(zhǔn)品,CAS NO.3599-32-4)和AIE 染料(AIE1010 熒光納米顆粒)進(jìn)行成像研究(對(duì)其他染料同樣適用,如稀土材料、金屬納米團(tuán)簇探針等,已于系統(tǒng)前期研制過(guò)程中進(jìn)行相關(guān)成像研究).

3.2 熒光信號(hào)采集與處理

熒光成像系統(tǒng)采集的原始熒光圖像的對(duì)比度往往不高,并且由于光源照射不均勻、熱效應(yīng)、探測(cè)器暗電流噪聲和讀出噪聲等可能存在霧狀噪聲及背景噪聲,這些噪聲會(huì)影響熒光圖像的成像質(zhì)量并干擾熒光信號(hào)的觀測(cè)效果.為了增強(qiáng)灰度圖像顯示效果,去除圖像噪聲并盡可能保留有效熒光信號(hào),提出了一種熒光圖像增強(qiáng)和校正方法,具體流程如圖4(a)所示.實(shí)際應(yīng)用中,通常采用自動(dòng)色階算法對(duì)熒光圖像進(jìn)行對(duì)比度拉伸,增強(qiáng)灰度圖像中的微弱熒光信號(hào),但是圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號(hào)時(shí),采用同一比例拉伸圖像可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)度增強(qiáng)現(xiàn)象,損失部分有效熒光信號(hào).因此,基于自動(dòng)色階算法提出自適應(yīng)對(duì)比度拉伸算法,其簡(jiǎn)要步驟如下.

2.1 患者一般情況及手術(shù)方式 兩組患者一般情況及合并手術(shù)方式如表1所示。骶骨固定術(shù)組年齡、絕經(jīng)概率及術(shù)前SUI概率顯著低于改良全盆底重建組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骶骨固定術(shù)組手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)有性生活概率顯著高于改良全盆底重建組，骶骨固定術(shù)組中71例患者合并有陰道前及(或)后壁脫垂，改良全盆底重建組中72例合并有陰道前及(或)后壁脫垂，均給予相應(yīng)的修補(bǔ)手術(shù)治療。骶骨固定組中，41例SUI患者中36例接受了TVT-O手術(shù)；改良全盆底重建組中，53例SUI患者中37例接受了TVT-O手術(shù)。見(jiàn)表1。

圖4 熒光圖像處理 (a) 流程圖;(b) 原始低熒光圖像;(c) 原始高熒光圖像;(d) 圖(b)的增強(qiáng)圖像;(e) 圖(c)的增強(qiáng)圖像Fig.4.Fluorescence image processing: (a) Flow chart;(b) original low fluorescence image;(c) original high fluorescence image;(d) enhanced image of Fig.(b);(e) enhanced image of Fig.(c).

1)對(duì)原始熒光圖像進(jìn)行直方圖統(tǒng)計(jì),計(jì)算得到各灰度級(jí)的像素個(gè)數(shù)及累積分布函數(shù);通過(guò)預(yù)設(shè)的截?cái)啾壤龑?duì)直方圖進(jìn)行左右截?cái)?剔除相應(yīng)的圖像像素;統(tǒng)計(jì)截?cái)嗪髨D像數(shù)據(jù)中的最小和最大灰度值,分別作為黑場(chǎng)閾值Gmin和白場(chǎng)閾值Gmax.

2)當(dāng)熒光圖像中不存在較高灰度值的有效熒光信號(hào)時(shí)(圖像最大灰度值Max 不超過(guò)灰度級(jí)×0.6 時(shí)認(rèn)為不存在),將不超過(guò)Gmin的像素灰度值置為0,其他像素灰度值拉伸至[0,M]范圍,M為圖像灰度級(jí).

3)當(dāng)熒光圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號(hào)時(shí)(圖像最大灰度值Max 大于灰度級(jí)×0.6 時(shí)認(rèn)為存在),通過(guò)迭代閾值法計(jì)算得到原始熒光圖像的最優(yōu)閾值Gt,將其與白場(chǎng)閾值Gmax的均值設(shè)為C1,并定義C2=Gt×1.5,C2在(Gmin,Gmax)范圍內(nèi)時(shí)將C2作為中間閾值Gmid;反之,Gt在(Gmin,Gmax)范圍內(nèi)時(shí)將C1作為Gmid,Gt未在(Gmin,Gmax)范圍內(nèi)時(shí)將Gmin與Gmax的均值作為Gmid.定義Vmid=M×(Gmid-Gmin)/(Gmax-Gmin),適當(dāng)放大Vmid后作為Gmid的映射灰度值Gpoint,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將放大系數(shù)定為1.2.將不超過(guò)Gmin的像素灰度值置為0,(Gmin,Gmid]范圍內(nèi)的像素灰度值拉伸至(0,Gpoint]范圍,(Gmid,Gmax)范圍內(nèi)的像素灰度值拉伸至(Gpoint,M)范圍,不小于Gmax的像素灰度值設(shè)置為M.

針對(duì)不同灰度分布的熒光圖像進(jìn)行自適應(yīng)對(duì)比度拉伸,可以較好地增強(qiáng)灰度圖像中的微弱熒光信號(hào),提升灰度圖像中熒光信號(hào)的整體亮度,并避免由于過(guò)度拉伸導(dǎo)致部分熒光信號(hào)過(guò)度增強(qiáng)的情況,優(yōu)化熒光信號(hào)觀測(cè)效果.此外,為了去除熒光圖像中的背景噪聲,通常在當(dāng)前曝光時(shí)間下采集暗背景圖像,將原始熒光圖像與之相減實(shí)現(xiàn)暗背景快速扣除.實(shí)際應(yīng)用中,為了提高圖像處理效率,取最優(yōu)閾值Gt的一半作為背景值dark,以扣除圖像背景,并保留低熒光信號(hào).

當(dāng)熒光圖像中不存在較高灰度值的有效熒光信號(hào)時(shí),將背景值dark 融入拉伸算法模型,此時(shí)圖像處理的數(shù)學(xué)模型如(1)式所示,其中max(Gmin,dark)是Gmin和dark 中的較大值:

當(dāng)熒光圖像中存在較高灰度值的有效熒光信號(hào)時(shí),將背景值dark 融入拉伸算法模型,此時(shí)圖像處理的數(shù)學(xué)模型如(2)式所示:

銳化度s的取值需合理,以免圖像輪廓產(chǎn)生過(guò)沖或者圖像銳化效果不明顯.其中,二維函數(shù)g(x,y)的拉普拉斯算子表示為

采用上述熒光增強(qiáng)和校正方法分別對(duì)如圖4(b),(c)所示的原始熒光圖像進(jìn)行處理,獲得如圖4(d),(e)所示的熒光增強(qiáng)圖像.可以明顯看出,處理后的圖像更有利于熒光信號(hào)觀測(cè),背景更為干凈,并去除了霧狀噪聲.對(duì)處理前后的熒光圖像進(jìn)行量化評(píng)價(jià)指標(biāo)分析,結(jié)果見(jiàn)表1.不難得出,本文提出的熒光增強(qiáng)和校正方法可以大幅提高熒光圖像的清晰度,突出熒光信號(hào),提供更優(yōu)的顯示效果.

表1 圖像量化評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)比Table 1.Comparison of image quantitative evaluation indicators.

3.3 系統(tǒng)的性能測(cè)試

3.3.1 系統(tǒng)的穿透深度

為了測(cè)試本系統(tǒng)的穿透深度,設(shè)計(jì)了生物組織模擬實(shí)驗(yàn).因?yàn)镮ntralipid 與生物組織具有相似的吸收和散射特性,所以采用Intralipid 溶液制備凝膠,用于模擬生物組織,具體制備方法如下: 利用Intralipid 溶液(體積比0.6%)和瓊脂糖粉末(質(zhì)量比0.4%)配制出混合溶液,持續(xù)加熱使之充分混合,然后倒入定制的圓柱形玻璃器皿中,等待其冷卻凝固成凝膠.如圖5(a)所示,一根毛細(xì)玻璃管(內(nèi)徑1 mm)傾斜固定于玻璃器皿中,傾斜角度固定時(shí),通過(guò)統(tǒng)計(jì)熒光圖像中水平方向上可觀測(cè)的像素?cái)?shù)量,結(jié)合定制孔位高度差和玻璃器皿的內(nèi)徑及像素?cái)?shù)量,可計(jì)算得到穿透深度.實(shí)物圖如圖5(b)所示,玻璃管兩端連接軟管,通過(guò)蠕動(dòng)泵控制軟管內(nèi)液體流動(dòng),管內(nèi)液體采用濃度1 mg/mL 的商用ICG 試劑.使用本系統(tǒng)拍攝Intralipid 凝膠,拍攝過(guò)程中可采用黑色啞光膠布遮擋玻璃器皿反光面,以避免影響熒光成像結(jié)果.采集得到的熒光圖像經(jīng)過(guò)偽彩處理后如圖5(c)所示,此時(shí),相機(jī)曝光時(shí)間300 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長(zhǎng)為1000 nm,激光器功率為8 W.通過(guò)統(tǒng)計(jì)可觀測(cè)的像素?cái)?shù)量,計(jì)算得到穿透深度約10.88 mm.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本系統(tǒng)的穿透深度可以達(dá)到10 mm以上,可滿足小動(dòng)物活體熒光成像的應(yīng)用需求.

圖5 系統(tǒng)的穿透深度測(cè)試 (a) 示意圖;(b) 實(shí)物圖;(c)偽彩圖像Fig.5.Penetration depth testing of the system: (a) Schematic diagram;(b) physical diagram;(c) pseudo color image.

3.3.2 系統(tǒng)的信噪比

通過(guò)計(jì)算信噪比(signal to noise ratio,SNR)來(lái)評(píng)價(jià)系統(tǒng)的性能,SNR 定義為目標(biāo)信號(hào)均值與背景標(biāo)準(zhǔn)差的比值,計(jì)算公式為

3.3.3 系統(tǒng)的靈敏度

為了測(cè)試本系統(tǒng)的成像靈敏度,針對(duì)ICG 試劑設(shè)置梯度實(shí)驗(yàn),對(duì)12 組不同濃度的ICG 試劑及空位進(jìn)行成像測(cè)試.其中,第1 組ICG 試劑的質(zhì)量濃度為1 mg/mL,并將該濃度持續(xù)進(jìn)行對(duì)半稀釋以作為第2 組至最后一組的試劑濃度.將多組試劑等劑量(200 μL)放置于標(biāo)準(zhǔn)96 孔板內(nèi),各組試劑間隔兩個(gè)孔位,以避免試劑間成像影響.熒光成像時(shí),相機(jī)曝光時(shí)間800 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長(zhǎng)為900 nm 和1000 nm,激光器功率密度約40 mW/cm2.由圖6 可知,在當(dāng)前成像狀態(tài)下,本系統(tǒng)可探測(cè)到質(zhì)量濃度為0.00048828125 mg/mL的ICG 試劑.該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本系統(tǒng)具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn).

圖6 ICG 梯度實(shí)驗(yàn) (a) 12 組的熒光信號(hào)強(qiáng)度分析;(b) 最后4 組的熒光信號(hào)強(qiáng)度分析Fig.6.ICG gradient experiment: (a) Analysis of fluorescence signal intensity in 12 groups;(b) analysis of fluorescence signal intensity for the last 4 groups.

4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法

本實(shí)驗(yàn)使用的小鼠為SPF 級(jí)別的BALB/C裸鼠和KM 小鼠,購(gòu)買(mǎi)自斯貝福(蘇州)生物技術(shù)有限公司,6—8 周齡.使用KM 小鼠成像時(shí),為避免小鼠毛發(fā)對(duì)熒光成像結(jié)果造成干擾,需利用剃毛膏在小鼠腹部清理出觀測(cè)區(qū)域,如圖7 所示.剃毛后將小鼠靜置一段時(shí)間,等待其生理狀態(tài)穩(wěn)定后,對(duì)其尾部靜脈注射200 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL的ICG 試劑/AIE 染料.注射完成后,盡快將小鼠固定在系統(tǒng)載物臺(tái)上,并調(diào)整系統(tǒng)參數(shù)對(duì)其進(jìn)行成像.成像過(guò)程中,對(duì)小鼠進(jìn)行持續(xù)麻醉,并可通過(guò)黑色膠帶固定小鼠四肢,以?xún)?yōu)化成像效果.熒光成像時(shí),激光器功率應(yīng)盡可能低(由于光纖傳輸?shù)仍斐傻墓β蕮p耗,本系統(tǒng)實(shí)測(cè)功率密度不超過(guò)65 mW/cm2,遠(yuǎn)低于激光產(chǎn)品的安全GB 7247.1—2012 所規(guī)定的最大允許照射量330 mW/cm2),以避免對(duì)被測(cè)活體的本能行為產(chǎn)生影響.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠的操作符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)要求及動(dòng)物倫理學(xué).

圖7 脫毛小鼠Fig.7.Depilatory mouse.

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

4.2.1 血管分布監(jiān)測(cè)

對(duì)脫毛小鼠尾部靜脈注射200 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的ICG 試劑,注射結(jié)束后,采用本系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行熒光成像,可觀測(cè)到小鼠體內(nèi)的血管分布情況,如圖8(a)所示,此時(shí),相機(jī)曝光時(shí)間12 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長(zhǎng)為900 nm和1000 nm,激光器功率為8 W.圖8(a)為相機(jī)采集的原始熒光圖像,采用基于本系統(tǒng)提出的熒光增強(qiáng)校正算法對(duì)其進(jìn)行處理,得到如圖8(b)所示的增強(qiáng)熒光圖像.對(duì)圖8(a),(b)進(jìn)行感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)選取,如圖8(c)所示,并分別對(duì)圖8(a),(b)進(jìn)行ROI 信背比分析,得到圖8(d),(e).可以看出,增強(qiáng)處理后熒光圖像的信背比有了明顯提升,增強(qiáng)圖像更為突出了血管,特別是細(xì)小血管,有利于血管分布情況的成像監(jiān)測(cè).

圖8 熒光成像 (a) 原始熒光圖像;(b) 增強(qiáng)熒光圖像;(c) ROI 選取示意圖;(d) 圖(a)的ROI 信背比分析;(e) 圖(b)的ROI 信背比分析Fig.8.Fluorescence imaging: (a) Original fluorescence image;(b) enhanced fluorescence image;(c) schematic diagram of ROI selection;(d) ROI analysis of signal-to-back ratio in Fig.(a);(e) ROI analysis of signal-to-back ratio in Fig.(b).

4.2.2 組織器官持續(xù)監(jiān)測(cè)

對(duì)上述脫毛小鼠進(jìn)行血管分布監(jiān)測(cè)后12 min左右,血管內(nèi)熒光信號(hào)已基本消失(出現(xiàn)漂白現(xiàn)象),ICG 分布到小鼠各組織器官,并被肝臟攝取、代謝和排泄進(jìn)入小腸,此時(shí)采用本系統(tǒng)可以明顯觀測(cè)到小鼠的胃腸道蠕動(dòng),如圖9 所示.此時(shí),相機(jī)曝光時(shí)間12 ms,鏡頭光圈F2.8,發(fā)射濾光片波長(zhǎng)為900 nm 和1000 nm,激光器功率為5 W.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本系統(tǒng)可以對(duì)小鼠腸道中的分布進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可視化追蹤,實(shí)現(xiàn)對(duì)組織器官的持續(xù)監(jiān)測(cè),為小鼠胃腸道蠕動(dòng)的健康狀態(tài)、胃腸動(dòng)力障礙的診斷和評(píng)估、藥物對(duì)腸梗阻的影響等研究提供有力的參考.

圖9 組織器官熒光成像持續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)果Fig.9.Continuous monitoring results of tissue and organ fluorescence imaging.

4.2.3 清醒狀態(tài)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

對(duì)裸鼠尾部靜脈注射200 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的AIE 染料,注射結(jié)束一段時(shí)間后,將裸鼠放入高透明亞克力盒中,并在亞克力盒內(nèi)放入一只未注射熒光染料/試劑的空白鼠,作為對(duì)照組,在無(wú)需麻醉的條件下,采用本系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)兩只裸鼠整體的熒光成像情況.如圖10(a)所示,為本系統(tǒng)采集的原始熒光圖像,此時(shí),考慮到裸鼠的自然運(yùn)動(dòng)狀態(tài)(移動(dòng)、晃頭等),相機(jī)曝光時(shí)間設(shè)置為9.8 ms,鏡頭光圈F2.8、景深約20 mm (基本可覆蓋活動(dòng)裸鼠待觀測(cè)區(qū)域厚度),發(fā)射濾光片波長(zhǎng)為1000 nm,激光器功率為8 W.如圖10(b)所示,為偽彩處理后的熒光圖像.可以明顯看出,空白鼠無(wú)明顯熒光反應(yīng),AIE 染料裸鼠仍存在較強(qiáng)的熒光反應(yīng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本系統(tǒng)可以較快的成像幀率動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物的熒光成像情況,實(shí)現(xiàn)活體動(dòng)物在清醒狀態(tài)下自由移動(dòng)時(shí)的實(shí)時(shí)成像監(jiān)測(cè)研究,為活體動(dòng)物的生物醫(yī)學(xué)成像研究提供非侵入、無(wú)需麻醉甚至安樂(lè)死的科學(xué)儀器.

圖10 活體動(dòng)物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果 (a) 原始熒光圖像;(b) 偽彩增強(qiáng)圖像Fig.10.Dynamic monitoring results of living animals: (a) Original fluorescence image;(b) pseudo color enhanced image.

5 結(jié)論

利用NIR-II 在生物組織中具有較大的穿透深度、較高的成像信噪比和靈敏度等特點(diǎn),自主研制開(kāi)發(fā)了NIR-II 小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng),采集得到高分辨率的熒光圖像并處理分析,提出了一種熒光增強(qiáng)和校正方法提高熒光圖像的信背比和清晰度.該系統(tǒng)具有較高的成像靈敏度、較快的成像速度及較高的系統(tǒng)集成度(與市面上同類(lèi)商業(yè)產(chǎn)品性能相似),可同時(shí)進(jìn)行2—3 只小鼠的成像實(shí)驗(yàn),有助于提高科研成像效率.與商用的ICG 試劑和AIE 染料等結(jié)合使用,該系統(tǒng)可以對(duì)小鼠進(jìn)行血管分布情況監(jiān)測(cè)、深層組織器官監(jiān)測(cè)以及清醒狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)研究等,可用于實(shí)時(shí)觀察基因在活體動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)、腫瘤的發(fā)展過(guò)程、藥物的治療效果等,有望在腫瘤疾病的早期診斷與治療、藥物研制開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用.此外,將結(jié)合顯微成像或內(nèi)窺成像進(jìn)行系統(tǒng)跨尺度研究,并結(jié)合光聲/超聲成像模塊進(jìn)行多模態(tài)成像研究等.