黎 婷

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生起源于胚胎階段,首先發(fā)育成為生殖祖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs),當(dāng)PGCs遷移到胚胎性腺后發(fā)育成為卵原細(xì)胞,開始進(jìn)行減數(shù)分裂成為卵母細(xì)胞,并停留在雙線期,個(gè)別卵母細(xì)胞被單層扁平顆粒細(xì)胞包繞形成原始卵泡[1].之后當(dāng)卵母細(xì)胞開始生長(zhǎng),單層扁平顆粒細(xì)胞變?yōu)榱⒎叫?并增殖形成多層次結(jié)構(gòu),被泡膜間質(zhì)細(xì)胞包繞,從而形成次級(jí)卵泡,次級(jí)卵泡繼續(xù)發(fā)育形成卵泡腔,成為有腔卵泡,而顆粒細(xì)胞分化形成卵丘顆粒細(xì)胞,圍繞次級(jí)卵母細(xì)胞行成卵丘.雌性動(dòng)物開始發(fā)情后,周期性分泌促性腺激素促進(jìn)囊狀卵泡中的卵母細(xì)胞完全成熟,繼續(xù)完成減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ,繼而排卵[2-3].

卵泡的發(fā)育受到下丘腦-腦垂體-卵巢軸中不同水平的激素調(diào)控,主要有下丘腦分泌促性腺素釋放激素、垂體前葉分泌促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)促黃體素(luteinizing hormone,LH).卵巢產(chǎn)生雌激素[4].FSH刺激顆粒細(xì)胞增和顆粒細(xì)胞內(nèi)的芳香化酶的活性,使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,增加雌激素的水平和促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增殖,可用于誘發(fā)排卵或超排卵.初級(jí)卵泡到腔前卵泡中都表達(dá)FSH受體,受其促生長(zhǎng)和抗凋亡作用形成有腔卵泡,FSH在卵泡發(fā)育中發(fā)揮主導(dǎo)作用[5].

在發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)源性生長(zhǎng)因子之前,普遍認(rèn)為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)是受到單向調(diào)控,顆粒細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)成分,而FSH調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖[6].通過內(nèi)分泌學(xué)和超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),位于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的縫隙結(jié)合部存在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),二者之間有豐富的物質(zhì)聯(lián)系,如顆粒細(xì)胞通過縫隙結(jié)合部提供小分子物質(zhì),如營(yíng)養(yǎng)素、分子信號(hào)等調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟,卵母細(xì)胞產(chǎn)生自源性生長(zhǎng)因子GDF9和BMP15,卵泡發(fā)育受到卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的雙向調(diào)控[7].

1977年,Eppig[8]使用卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系首次進(jìn)行系統(tǒng)性研究,利用未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得成熟卵母細(xì)胞的新技術(shù).近年來已有體外培養(yǎng)小鼠、牛等多種動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞,獲得成熟卵母細(xì)胞的研究報(bào)道[9].該繁殖技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于試管嬰兒、遺傳改良等人和動(dòng)物的生殖研究,以期改善人類生活、產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益[10].

1 顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的作用

1.1 卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)連接

原始卵泡外周被前顆粒細(xì)胞直接圍繞,進(jìn)入生長(zhǎng)期后很快產(chǎn)生透明帶包繞卵母細(xì)胞,將其與顆粒細(xì)胞隔開,而顆粒細(xì)胞會(huì)形成胞質(zhì)突,穿過透明帶,仍和卵母細(xì)胞維持一定的直接接觸[11].大部分胞質(zhì)突由富含肌動(dòng)蛋白絲的主鏈構(gòu)成,小部分由微管蛋白構(gòu)成,因此顆粒細(xì)胞層中遠(yuǎn)層的顆粒細(xì)胞仍能保持和卵母細(xì)胞的直接聯(lián)系[12].胞質(zhì)突的數(shù)量和形狀隨著卵泡發(fā)育發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng),在體外培養(yǎng)中胞質(zhì)突顯著減少,添加雌二醇和FSH可緩解胞質(zhì)突的減少,提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率[13].

在胞質(zhì)突的頂端,顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙結(jié)合部,形成胞間通道,允許離子和小分子物質(zhì)(<1kDa)直接通過,縫隙結(jié)合部由連接蛋白類組成,6個(gè)連接蛋白寡聚體化形成1個(gè)連接子,相鄰細(xì)胞間(卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間、卵泡的顆粒細(xì)胞間)的兩個(gè)連接子組成通道,從而形成縫隙結(jié)合部[14].另外一些觀點(diǎn)認(rèn)為,顆粒細(xì)胞、卵泡(包括卵母細(xì)胞,不包括泡膜細(xì)胞,二者被基膜分離)形成功能性胞體,小分子物質(zhì)如氨基酸、核酸、代謝產(chǎn)物和cAMP等都通過顆粒細(xì)胞的縫隙結(jié)合部,與卵母細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換,這對(duì)卵泡發(fā)育至關(guān)重要,如小鼠卵母細(xì)胞不能合成Cx37(Connexin37,細(xì)胞連接蛋白37),卵母細(xì)胞只能發(fā)育為正常體積的74%,不能完成減數(shù)分裂,卵泡也不能發(fā)育為成熟的格拉夫卵泡[15-16].

1.2 氨基酸類和能量底物

顆粒細(xì)胞可以通過縫隙結(jié)合部運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸類)和能量物質(zhì)(能量底物)給卵母細(xì)胞,目前在小鼠生長(zhǎng)卵母細(xì)胞中的6種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)已被確定,顆粒細(xì)胞顯著增強(qiáng)其中甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和牛磺酸的攝取量[17].小鼠、牛、羊和人等動(dòng)物的卵母細(xì)胞可以通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取葡萄糖,但由于缺乏糖酵解酶中的果糖磷酸激酶,哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞利用葡萄糖作為能量底物的能力很低[18].因此,大多數(shù)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的能量底物來源于顆粒細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為卵母細(xì)胞可利用的物質(zhì),如丙酮酸鹽、乳酸鹽、NADPH等,以滿足卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)需求,而不是直接利用葡萄糖.體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與共培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān),如小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中沒有顆粒細(xì)胞時(shí),直徑到35 μm即停止生長(zhǎng),正是因?yàn)轭w粒細(xì)胞通過縫隙結(jié)合部進(jìn)行的氨基酸類和能量底物轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)卵母細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)有著至關(guān)重要的作用[19].

1.3 cAMP和cGMP

原始卵泡中卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期到減數(shù)分裂Ⅰ期即停滯,而卵泡在FSH和LH作用下繼續(xù)成熟,原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡,甚至早期有腔卵泡中的卵母細(xì)胞都沒有繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂的能力[20].而在生長(zhǎng)期最后由于促性腺激素的作用,卵母細(xì)胞以分段式完成減數(shù)分裂,到達(dá)減數(shù)分裂Ⅱ期[21].這種減數(shù)分裂的分段式完成受到卵泡環(huán)境和顆粒細(xì)胞的抑制作用,卵泡排卵后由于擺脫了卵泡環(huán)境和顆粒細(xì)胞的抑制,即使沒有促性腺激素,卵母細(xì)胞可自發(fā)完成減數(shù)分裂[22].研究發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞自發(fā)完成減數(shù)分裂是胞內(nèi)cAMP水平下降引起的.顆粒細(xì)胞通過縫隙結(jié)合部給卵母細(xì)胞運(yùn)送cGMP,cGMP抑制磷酸二酯酶3(cAMP水解酶),從而維持卵母細(xì)胞胞內(nèi)高cAMP水平阻斷減數(shù)分裂,這些環(huán)核苷酸對(duì)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[23].

cAMP和cGMP分別由腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶合成,磷酸二酯酶類可降解cAMP和cGMP.研究發(fā)現(xiàn),cAMP及卵泡液(主要是其中的次黃嘌呤)協(xié)作使小鼠卵母細(xì)胞無法停留在減數(shù)分裂Ⅰ期,次黃嘌呤抑制cAMP水解酶-磷酸二酯酶的活性[24].顆粒細(xì)胞中主要的鳥苷酸環(huán)化酶是鈉尿肽受體2,是配體利鈉肽的受體,使用利鈉肽處理卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體,可提高cGMP水平,敲除利鈉肽或其受體基因的小鼠卵母細(xì)胞無法停留在減數(shù)分裂Ⅰ期,最終早熟早衰[25].

1.4 旁分泌因子

顆粒細(xì)胞分泌可分泌多種物質(zhì),調(diào)控卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟,顆粒細(xì)胞生成的雌激素類可刺激自身增殖,分泌的旁分泌生長(zhǎng)因子可直接刺激卵母細(xì)胞的生長(zhǎng),生成的激活素和抑制素均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族,發(fā)揮調(diào)控腦垂體分泌FSH的作用[26].目前研究最多的調(diào)控粒層-卵母細(xì)胞交互作用的配體受體系統(tǒng)是酪氨酸激酶及其受體,對(duì)卵母細(xì)胞和卵泡的所有發(fā)育階段都起到促進(jìn)作用,可能也與原始卵泡中休眠卵母細(xì)胞的喚醒有關(guān)[27-28].

2 卵母細(xì)胞與卵泡發(fā)育

2.1 卵源因子:GDF9和BMP15

實(shí)施顯微操作卵子去除術(shù)會(huì)引起顆粒細(xì)胞的黃體化,說明一些卵源物質(zhì)可能阻止顆粒細(xì)胞的自發(fā)黃體化,證實(shí)了卵源物質(zhì)對(duì)顆粒細(xì)胞功能的直接影響,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論是基于排卵后顆粒細(xì)胞黃體化的生理學(xué)現(xiàn)象[29].卵母細(xì)胞對(duì)顆粒細(xì)胞的作用與卵源物質(zhì)調(diào)控糖酵解和三羧酸循環(huán)有關(guān),從而調(diào)控顆粒細(xì)胞的功能[30].研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞生成的特異性生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育,GDF9敲除小鼠的原始卵泡發(fā)育到形成1-2層顆粒細(xì)胞包繞即停止發(fā)育,而BMP15敲除母鼠生育力低下,免疫抑制GDF9和BMP5會(huì)顯著減少有腔卵泡的數(shù)量,最終證實(shí)了兩種卵源因子GDF9和BMP15的存在及對(duì)其顆粒細(xì)胞和卵泡發(fā)育的影響,GDF9和BMP15均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族[31-32].

2.2 顆粒細(xì)胞的增殖和形態(tài)學(xué)研究

每個(gè)原始卵泡都包含一個(gè)卵母細(xì)胞及包繞在外的單層扁平顆粒細(xì)胞,當(dāng)卵母細(xì)胞開始生長(zhǎng),顆粒細(xì)胞從扁平變?yōu)榱⒎叫?并隨著卵泡的發(fā)育開始增殖.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示,無腔卵泡中顆粒細(xì)胞的增殖受FSH和雌激素17β促進(jìn),無腔卵泡和有腔卵泡的顆粒細(xì)胞都受卵母細(xì)胞分泌的GDF9和BMP15促進(jìn),大量增殖從而形成卵丘[33].

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),體內(nèi)顆粒細(xì)胞與體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的外形有所差異,體外顆粒細(xì)胞外形類似成纖維細(xì)胞,這種形態(tài)學(xué)的改變可能是由于FSH、cAMP類似物和生長(zhǎng)因子的作用因引起的[34].近期研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)牛卵丘(去除卵母細(xì)胞)與顆粒細(xì)胞,單獨(dú)添加BMP15與不添加GDF+BMP15的情況下,顆粒細(xì)胞都分化為類似成纖維細(xì)胞,而添加GDF+BMP15后外形變?yōu)榱庑?與不添加GDF+BMP15體外培養(yǎng)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中的顆粒細(xì)胞形態(tài)相似,顯示卵母細(xì)胞通過GDF9和BMP15維持顆粒細(xì)胞的外形[35].顆粒細(xì)胞具有高度分化潛能,在體外培養(yǎng)時(shí)可分化為多種細(xì)胞系,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞,卵源生長(zhǎng)因子對(duì)于維持顆粒細(xì)胞的外形是必需的[36].

2.3 卵泡腔的形成

在卵泡發(fā)育后期,卵泡液開始積聚在顆粒細(xì)胞層之間形成的一個(gè)單獨(dú)空間就是卵泡腔.卵泡腔是哺乳動(dòng)物的特有結(jié)構(gòu),可能與哺乳動(dòng)物卵生及卵巢中卵泡的選擇性發(fā)育有關(guān).無腔卵泡體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示,添加FSH可刺激卵泡腔的形成;去除了卵母細(xì)胞的無腔卵泡無法形成卵泡腔,添加GDF9和BMP15會(huì)形成卵泡腔類似結(jié)構(gòu),證實(shí)卵母細(xì)胞可能通過GDF9和BMP15參與了卵泡腔的形成[37].

3 結(jié) 論

哺乳動(dòng)物卵巢、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和卵泡發(fā)育是一個(gè)協(xié)調(diào)發(fā)生的漫長(zhǎng)過程,以期排卵后產(chǎn)生具有受孕能力的卵子.在這個(gè)過程中,停留在減數(shù)分裂Ⅰ期的卵母細(xì)胞隨著顆粒細(xì)胞增殖、分化和有腔卵泡的發(fā)育重新開始減數(shù)分裂,同時(shí)在腦垂體作用下卵母細(xì)胞促進(jìn)了卵泡的發(fā)育及顆粒細(xì)胞的增殖和分化.這種雙向交互作用一通過卵源因子GDF9和BMP15調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖、分化及顆粒細(xì)胞cAMP及cGMP合成量,二通過顆粒細(xì)胞經(jīng)縫隙結(jié)合部運(yùn)送cAMP及cGMP給卵母細(xì)胞調(diào)控卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及卵母細(xì)胞GDF9和BMP15的合成量得以實(shí)現(xiàn).最終保證卵母細(xì)胞和卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的協(xié)調(diào)性,以及哺乳動(dòng)物個(gè)體正常的卵巢功能,產(chǎn)生具有受孕能力的卵子.卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)需要更成熟的條件才能完善卵母細(xì)胞的全部生長(zhǎng)過程,對(duì)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞交互作用的研究是為了更好的改進(jìn)體外培養(yǎng)系統(tǒng),從而掌握這項(xiàng)生殖技術(shù),更好的為人類服務(wù).