于文娜，于連升，王爍，趙丹,2，杜仁鵬,2

（1黑龍江大學，生命科學學院，農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2河北環(huán)境工程學院，河北省農業(yè)生態(tài)安全重點實驗室，河北秦皇島 066102）

0 引言

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)可以產生具有各種功能特性和理化性質的胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，其通常具有改善乳制品及其他食品的口感、質地，延長食品的保質期，改變發(fā)酵產品的外觀柔軟度等多種功能，因此被作為增稠劑、乳化劑應用在食品行業(yè)[1-2]。此外，LAB EPS 還具有抗癌、免疫調節(jié)、益生特性、制作防止致病菌粘附的抗生物膜劑、降血糖/降膽固醇等特性，被廣泛應用在醫(yī)藥保健、美容化工等領域[3-5]。由于LAB EPS的功能特性和其公認的安全(GRAS)特性，近年來引起廣泛的關注[6]。

目前已知可以產EPS的LAB主要有：植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、乳 酸 乳 球 菌(Lactococcuslactis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、干酪乳桿菌(Lactiplantibacilluscasei)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、羅伊氏乳桿菌(Lactiplantibacillusreuteri) 和融合魏斯氏菌(Weissellaconfuse)等[7-9]。關于產EPS的LAB已有很多報道，但是相關研究主要集中在產EPS LAB 的篩選、EPS 合成機制的探索、EPS 構效關系等[10]，而有關EPS的工業(yè)化大規(guī)模生產的相關研究較少。盡管EPS具有多種優(yōu)良的理化性質，但LAB EPS 的產量低，限制了EPS 的大規(guī)模應用。因此分離篩選高產EPS 的LAB，優(yōu)化菌株產EPS 的發(fā)酵條件，進而提高EPS 的產量可以為工業(yè)化生產EPS節(jié)省時間和原料成本。大量研究表明，能夠影響乳酸菌產EPS的因素有很多，主要包括底物濃度和培養(yǎng)基的理化條件等[11-12]。WANG 等[13]通過單因素試驗對檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)B2產EPS的蔗糖、酵母提取物濃度和pH等進行優(yōu)化，得到了(59.33 ± 1.34)g/L 的EPS，是優(yōu)化前的5.93 倍。劉麗娜等[14]對W.confuseXG-3產EPS的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，EPS產量達到61.03 g/L，相較于優(yōu)化前提高了44.95%。在之前的研究中，課題組從東北各地域的酸菜中分離并確定了一株產EPS 的P.acidilacticiJ1，菌株產生的EPS具有持水性、抗氧化性、益生特性等眾多優(yōu)良的功能。本研究通過單因素實驗，對P.acidilacticiJ1產EPS的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，確定了P.acidilacticiJ1產EPS的最佳發(fā)酵條件，為EPS的工業(yè)應用提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株P.acidilacticiJ1保藏于黑龍江大學生命科學學院微生物重點實驗室。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基從天津恒興化學試劑制造有限公司采購苯酚、濃硫酸、無水乙醇等試驗所需試劑，天津致遠化學試劑有限公司采購三氯乙酸。檢測所需試劑全部為分析純。

MRS 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、無水亞硫酸鈉0.1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、檸檬酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL 108℃高壓滅菌20 min，用于供試菌活化及種子液制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化將-80℃冰箱保藏的P.acidilacticiJ1以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過夜后，在轉接兩次MRS液體培養(yǎng)基，活化菌株。

1.2.2 EPS 的提取與測定將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min，培養(yǎng)5 d。以MRS 培養(yǎng)基為對照組，將菌液稀釋不同倍數(shù)涂布于MRS平板中，過夜培養(yǎng)后，計算活菌數(shù)量。將發(fā)酵液12000 r/min離心10 min，取上清液后加入三倍體積的95%乙醇，4℃冰箱中過夜沉淀EPS[15]。分別配制不同濃度葡萄糖標準溶液，隨后，將1 mL 葡萄糖溶液和200 μL 6%(w/v)的苯酚溶液放入比色管中，再加入1 mL濃硫酸，經(jīng)過冷卻處理后，測定OD490。以葡萄糖濃度(μg/mL)與OD490作為橫縱坐標，繪制標準曲線為y=0.00472x-0.00857，R2=0.9993，通過苯酚-硫酸法測定EPS含量。

1.2.3 培養(yǎng)基成分對P.acidilacticiJ1 生長及產EPS 的影響探索培養(yǎng)基組分及含量對P.acidilacticiJ1 的生長和EPS產量的影響。將葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖和乳糖作為碳源，并考察不同蔗糖濃度對菌株生長及產EPS 的影響。分別添加不同濃度的酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨和檸檬酸銨為菌株生長所需的氮源。同時分別考察K2HPO4、MgSO4、CH3COONa 對菌株產EPS含量的影響。

1.2.4 培養(yǎng)條件對P.acidilacticiJ1 生長及產EPS 的影響以最佳的培養(yǎng)基組成為基礎，分別考察不同培養(yǎng)條件對P.acidilacticiJ1 生長和產EPS 的影響。接種量：分別以1、2、3、4、5%的接種量將菌液接種于MRS培養(yǎng)基中，觀察不同接種量對菌株生長及產EPS 的影響。酸堿值：考察培養(yǎng)基初始pH 4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5對菌液生長及EPS 產量的影響。溫度：考察溫度在20、25、30、35、40℃下對菌液生長及EPS 產量的影響。搖床轉速：探究100、120、140、160、180 r/min的搖床轉速對菌液生長及EPS產量的影響。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件Origin 2021對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分對P.acidilactici J1產EPS的影響

2.1.1 碳源和蔗糖添加量對P.acidilacticiJ1 生長和EPS 產量的影響碳源是細菌維持正常生長及生理代謝過程中的重要營養(yǎng)成分，其種類及添加量是細菌合成EPS過程中的重要影響因素[16]。本研究選用20 g/L麥芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖5 種碳源對P.acidilacticiJ1生長和EPS產量進行差異分析。結果表明當20 g/L 蔗糖作為P.acidilacticiJ1 的碳源時，菌株的生長情況和EPS產量顯著優(yōu)于其他碳源（表1）。陶靜等[17]探究了不同碳源（果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉）對保加利亞乳桿菌(Lactiplantibacillusbulgaricus)EPS產量的影響，表明蔗糖是L.bulgaricus產EPS的最佳碳源。蔗糖可以為L.bulgaricus的生長提供碳源，同時也是L.bulgaricus合成EPS 的誘導劑，當培養(yǎng)基中有蔗糖存在時，葡聚糖蔗糖酶可以催化蔗糖合成EPS。

表1 碳源對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

蔗糖濃度對菌株生長代謝及產EPS的影響如圖1所示。蔗糖濃度為20 g/L時EPS產量最少?？赡苁桥囵B(yǎng)基中的碳源含量過少，未達到菌株正常生理代謝所需的碳源含量。蔗糖濃度70 g/L時菌株產EPS的產量達到最大值(35.72±1.09)g/L。繼續(xù)提高蔗糖濃度，EPS的產量下降，可能是高濃度的蔗糖會在培養(yǎng)基中產生較大的滲透壓，不利于菌株的正常生長和EPS 的產生[15]。

2.1.2 氮源對P.acidilacticiJ1 生長和EPS 產量的影響氮源可以為微生物的正常生理代謝提供必需的氮元素，包括有機氮源和無機氮源[18-19]。由表2 可知，牛肉膏是P.acidilacticiJ1產EPS的最適有機氮源。隨后考察了不同添加量的最適有機氮源牛肉膏與無機氮源檸檬酸銨對細菌生長及產EPS的影響，結果如圖2(a)，當牛肉膏含量為14 g/L 時EPS 含量達到最大值(43.76±1.07)g/L。如圖2(b)，當檸檬酸銨添加量在3.5 g/L 時EPS含量達到最大值(51.39±2.49)g/L。

圖2 牛肉膏和檸檬酸銨濃度對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

表2 氮源對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

2.1.3 無機鹽對P.acidilacticiJ1 生長和產EPS 的影響無機鹽可以為細菌生長和代謝提供必不可少的金屬離子及微量元素，不同的無機鹽對細菌生長及產EPS 的作用存在差異。磷酸氫二鉀、硫酸鎂和無水乙酸鈉在相同添加量的情況下對P.acidilacticiJ1生長及EPS產量的生長情況如表3。結果顯示3 種無機鹽對細菌的生長代謝具有不同程度的影響。其中無水乙酸鈉對細菌產EPS 的影響最為顯著，表明無水乙酸鈉是P.acidilacticiJ1合成EPS的關鍵無機鹽。隨后探索了不同濃度的無機鹽添加量對P.acidilacticiJ1生長及EPS產量的影響，EPS 產量達到最優(yōu)值分別所需的磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水乙酸鈉濃度為2 g/L、0.3 g/L、4 g/L（圖3、圖4、圖5）。

圖3 磷酸氫二鉀添加量對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

圖4 硫酸鎂添加量對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

圖5 無水乙酸鈉添加量對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

2.2 培養(yǎng)條件對P.acidilactici J1產EPS的影響

2.2.1 接種量對P.acidilacticiJ1 生長和產EPS 的影響接種量會顯著影響細菌的生長和繁殖速度，接種量過大會導致細菌溶解氧不足，使菌體缺乏必要的營養(yǎng)，從而阻礙其代謝產物的形成；反之，接種量過小則可能導致菌種的繁殖周期縮短，因此確定菌株最適接種量對工業(yè)化生產EPS、降低成本具有重要意義。接種量對細菌生長與產EPS影響如圖6所示，接種量在1%時產EPS 的量最少，為(61.42±2.43)g/L。接種量在4%時，EPS 產量達到最大值，為(72.66±2.98)g/L，隨后逐漸減小。接種量過低，培養(yǎng)基中菌液數(shù)量較少，影響了細菌的培養(yǎng)時間，使細菌達到對數(shù)期的時間增長。接種量過高，菌液維持正常生理代謝活動所需的營養(yǎng)含量增加，但在有限的培養(yǎng)基內，營養(yǎng)物質有限，限制了菌液的生長代謝并影響了EPS的合成。

2.2.2 pH 對P.acidilacticiJ1 生長和產EPS 的影響pH是細菌產EPS和維持自身生長代謝過程中重要的理化指標，探索細菌生長代謝過程中的最適pH有利于優(yōu)化菌株產EPS 的含量。不同pH 對P.acidilacticiJ1 生長和產EPS 的影響如圖7 所示，在初始pH 5.5 時，P.acidilacticiJ1的產糖量達到最大值，為(67.74±2.29)g/L，在初始pH 4.5 時產EPS 量最少，為(55.19±1.02)g/L。不同初始pH 對細菌產EPS 含量的影響呈現(xiàn)先升后降的趨勢。推測過高或過低的pH 改變了營養(yǎng)物質的溶解度，降低了P.acidilacticiJ1對營養(yǎng)的吸收，進而影響了菌株產EPS 相關酶的活性和穩(wěn)定性，改變了P.acidilacticiJ1的產EPS效率[20]。當pH 5.5～6.0之間，乳酸菌中葡聚糖蔗糖酶的活性最高，能以蔗糖為底物大量合成EPS。SEESURIYACHAN 等[21]對融合乳桿菌(Lactiplantibacillusconfuses)TISTR 1498 產EPS 的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結果表明，當碳源為100 g/L 的蔗糖，pH 5.5 時，產生了最高的EPS 產量38.20 g/L，與本研究結果一致。

圖7 pH對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度對P.acidilacticiJ1 生長和EPS 產量的影響溫度可以改變營養(yǎng)物質的運輸、產糖相關酶的活性以及物質的溶解度來影響糖的代謝速率[22]。不同的發(fā)酵溫度對P.acidilacticiJ1產EPS的影響如圖8，當溫度為20～25℃時，菌株產EPS的量較少。溫度較低，可能影響了物質及微量元素的運輸，P.acidilacticiJ1的生長較為緩慢，影響了菌株產EPS的效率。當溫度達到35℃時EPS的產量達到最大值，為(64.94±2.82)g/L。繼續(xù)提高發(fā)酵溫度，菌株的生長以及產EPS 的效率逐漸下降。相關的研究發(fā)現(xiàn)，EPS 合成的最適溫度普遍低于菌株的最適生長溫度[23]。唐華英等[24]優(yōu)化假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)GX-3的培養(yǎng)溫度，結果表明，在30℃時EPS 的合成量達到最大，為(40.27±1.26)g/L。邢瀚文[25]發(fā)現(xiàn)Ln.mesenteroidesDRP105 產EPS 的最適生長溫度為25℃，EPS 產量高達(39.08±1.31)g/L。本研究結果同上述一致，即最適產EPS溫度均低于菌株最適生長溫度。

圖8 溫度對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

2.2.4 搖床轉速對P.acidilacticiJ1 生長和EPS 產量的影響搖床轉速可以影響培養(yǎng)液中溶解氧的含量，控制產EPS 相關酶的活性，進而控制EPS 的合成[16]。轉速對P.acidilacticiJ1 生長及產EPS 的影響如圖9 所示，當搖床轉速為160 r/min 時，EPS 含量最高，為(67.52±1.02)g/L，當轉速為100 r/min 時，EPS 產量最少，為(57.57±2.11)g/L。當培養(yǎng)基轉速超過160 r/min后，EPS的產量逐漸下降。

圖9 不同的搖床轉速對P.acidilactici J1生長和EPS產量的影響

3 討論與結論

LAB在功能性食品領域發(fā)揮著重要的作用，不僅可以增加食品的感官特性，還能提高食品的營養(yǎng)價值[26]。LAB在代謝過程中產生的EPS具有巨大的應用潛力，近年來大量綜述性文章總結了LAB EPS的功能及產糖機理[27-29]。然而EPS 的產量受到多種因素的干擾，產量較低，不符合目前多糖類聚合物大規(guī)模工業(yè)化生產的要求，限制了EPS 的開發(fā)和利用，因此提高LAB EPS 的產量是研究的重點。目前關于EPS 發(fā)酵優(yōu)化的方法主要包括：改變底物濃度的添加量、發(fā)酵條件的變化、調整細菌接種量等[30-31]。KATJA 等[32]通過優(yōu) 化 馬 乳 酒 樣 乳 桿 菌 (Lactiplantibacillus kefiranofaciens)產EPS 的發(fā)酵溫度、攪拌速率以及碳源、氮源、維生素和礦物質的添加量等，提高了EPS的產量。FERNANDA 等[33]優(yōu)化Ln.pseudomesenteroides產EPS的發(fā)酵溫度、pH、碳源添加量等，優(yōu)化后EPS的產量提高到53.77 mg/mL。由此可見，環(huán)境因素諸如碳源、氮源、溫度、pH 和無機鹽濃度等對LAB 產EPS進程具有重要的影響作用。

P.acidilactici作為一種優(yōu)良的益生菌，具有產酸、調節(jié)腸道生態(tài)平衡、抑制病原微生物的生長、增強機體免疫等功能。除此之外，P.acidilactici產生的EPS 對食品化工等行業(yè)均具有重要的應用價值。但是目前對于P.acidilactici的研究僅局限于產酸、產乳酸片球菌素等代謝產物的研究上，對于P.acidilactici產EPS 的研究較少。本研究通過單因素試驗優(yōu)化了影響P.acidilactici產EPS的關鍵因素。在發(fā)酵過程中，蔗糖、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉的添加量對P.acidilactici產EPS 的影響尤為顯著，可能是金屬離子K+、Na+直接影響菌株葡聚糖蔗糖酶的活性，進而影響EPS的合成，而初始溫度、轉速對P.acidilactici產EPS 的影響相對較小。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的培養(yǎng)基成分對菌株產EPS 的影響均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這是因為當菌液濃度達到環(huán)境所能承受的最大限度時，EPS的含量也會維持在相對穩(wěn)定或有所降低的水平。胡盼盼[34]研究副干酪乳桿菌(Lactiplantibacillusparacasei)M5L產EPS的條件優(yōu)化中，接種量、發(fā)酵溫度、pH等均呈現(xiàn)先升后降低的趨勢，與本研究結果相似。pH不僅影響菌體的生長，還對培養(yǎng)基的理化因素具有一定的作用，改變菌體對環(huán)境中營養(yǎng)物質的吸收以及代謝反應中葡聚糖蔗糖酶對蔗糖的利用。P.acidilactici屬于耐酸性較強的細菌，但是過低的pH 仍不利于菌體生長，當培養(yǎng)基中的初始pH 4.5時，細菌生長受到抑制，但對EPS 的合成影響不大。推測低pH 環(huán)境下菌株生長速度緩慢，但是菌液中的糖基轉移酶活性較強，不斷利用環(huán)境中的蔗糖來合成EPS。

本研究通過單因素試驗得到了P.acidilactici產EPS 的最佳培養(yǎng)條件為蔗糖70 g/L，牛肉膏14 g/L，檸檬酸銨3.5 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，無水乙酸鈉4 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，接種量4%，培養(yǎng)溫度35℃，初始pH 5.5，搖床轉速160 r/min，EPS 產量為(72.66±0.02)g/L，相較于優(yōu)化前(15.27±0.14)g/L 提高了4.76 倍，優(yōu)化后的產量提升較為明顯。其中，蔗糖的添加量對P.acidilactici產EPS的影響最大。本研究結果有助于提高EPS產量，為工業(yè)化生產EPS提供理論基礎，未來可以通過響應面法來進一步優(yōu)化P.acidilactici產EPS的發(fā)酵條件。