游贛花,安群英,何 娟,李 凱,楊 萌,文 周,錢 城,朱建國

(1.貴州省第二人民醫(yī)院科研科,貴州 貴陽 550004; 2.衡水市第六人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,河北 衡水 053200;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科,貴州 貴陽 550003;4.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院,貴州 貴陽 550005;5.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院,貴州 遵義 563000;6.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二五醫(yī)院質(zhì)量管理科,貴州 貴陽 550000;7.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科,貴州 貴陽 550000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,也是泌尿系腫瘤中致死率最高的腫瘤之一[1]。2020年,全球新患RCC病例43.1萬例,因RCC死亡17.9萬例[2]。世界衛(wèi)生組織根據(jù)其分子、遺傳特征形態(tài)對腎癌進行了分類,腎透明細胞癌是RCC中最常見的亞型。在診療過程中,約30%的RCC患者在診斷時被發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,30%～70%的RCC患者在手術(shù)治療后仍有可能復(fù)發(fā)[3]。因此,進一步明確RCC的發(fā)病機制,并開發(fā)出新型、高效、低毒的化療藥物對于治療這種惡性腫瘤至關(guān)重要。

鐵死亡是一種調(diào)節(jié)性細胞死亡形式,由鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化引起[4-5],谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)通過將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒脂質(zhì)醇來預(yù)防鐵死亡[6-7]。研究表明,抑制GPX4誘導(dǎo)鐵死亡已成為觸發(fā)癌細胞死亡的治療策略之一[8]。因此,通過誘導(dǎo)腎癌細胞發(fā)生鐵死亡可能是一種有前景的治療策略。

本研究旨在探討蛇莓醇提物誘發(fā)活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累引發(fā)RCC細胞發(fā)生鐵死亡,進一步抑制腎癌細胞OS-RC-2增殖,為開發(fā)具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 蛇莓蛇莓購買于貴州省貴陽市中藥材市場,由貴州省食品藥品檢驗所中藥室專家進行鑒定,鑒定結(jié)果為薔薇科蛇莓屬植物蛇莓Duchesneaindica(Andr.) Focke。

1.2 細胞株OS-RC-2腎透明細胞癌細胞購買于武漢普諾賽公司,經(jīng)過STR鑒定。

1.3 主要試劑胰酶(美國Gibco,批號:2428760);RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco,批號:8122551);胎牛血清(以色列BI,批號:2351431);ROS分析試劑盒(江蘇凱基,批號:20220621);流式凋亡試劑盒(Meilunbio,批號:MA0220);谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒(上海索萊寶,批號:20220408);丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(上海索萊寶,批號:20220414);細胞活力(cell counting kit,CCK-8)檢測試劑盒(日本同仁,批號:SX748);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海索萊寶,批號:20220225);超敏化學(xué)發(fā)光試劑(新賽美,批號:20230208);NAC(MCE,HY-134495);Fer-1(MCE,HY-100579);GAPDH抗體(CST,5174S);GPX4抗體(三鷹,67763-1-lg); HO-抗體(Abcam,ab68477); SLC7A11抗體(Abcam,ab275411);Transferrin抗體(Abcam,ab214039);Dulcitol(上海MCE,CAS號:608-66-2)。

1.4 主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO);流式細胞儀(美國Beckman);酶標儀(美國Bio-teck);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國SYNGENE)。

2 主要方法

2.1 蛇莓活性成分及潛在作用靶點的獲取利用HERB本草組鑒數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)獲取蛇莓化學(xué)成分,Swiss target數(shù)據(jù)庫(https://swisstargetprediction.ch)獲取蛇莓各成分對應(yīng)的靶點。利用Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫,以“ferroptosis”為關(guān)鍵詞進行檢索,以種屬為“Homo(智人)”,相關(guān)性大于“1”為篩選標準,獲取鐵死亡的相關(guān)基因,用Cytoscape3.5.1軟件展示蛇莓-成分-靶點的關(guān)系。

2.2 蛇莓活性成分和鐵死亡核心靶點的分子對接利用pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取蛇莓成分的分子結(jié)構(gòu),保存為SDF格式,利用MOE2020.09軟件對分子結(jié)構(gòu)進行能力最小化;利用RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫,獲取GPX4的蛋白結(jié)構(gòu),編號為“2OBI”,利用MOE2020.09軟件對蛋白結(jié)構(gòu)去除配體、水分子、計算電荷,隨后對蛇莓化合物配體和GPX4蛋白受體進行分子對接,對接次數(shù)為30次。

2.3 藥物的提取及配制蛇莓醇提物:取適量干燥的蛇莓全葉粉碎后用70%乙醇浸泡2 h,回流提取3次(每次1 h),隨后合并提取液,過濾后,減壓回收溶劑至無醇味,得到浸膏。稱取浸膏100 mg充分溶解于DMSO中,加細胞培養(yǎng)液定容至20 mL,0.22 μm小濾器過濾,制備成母液(5 g·L-1)備用。根據(jù)需要稀釋至所需濃度給藥(DMSO終濃度<0.2%)。

2.4 細胞的培養(yǎng)快速從液氮罐中取出細胞,經(jīng)37 ℃水浴,再加入5～10倍體積的完全培養(yǎng)液低速離心5 min后棄上清液,加入1 mL 10%培養(yǎng)液重懸細胞后,加培養(yǎng)液至4 mL,置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),24 h后更換新培養(yǎng)液。

2.5 CCK-8檢測按4×103個OS-RC-2細胞接種于96孔板,細胞貼壁后進行藥物處理,每組分別設(shè)3個復(fù)孔,并設(shè)置2個調(diào)零孔,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,然后加入10 μL CCK-8在37 ℃下孵育1.5 h,用酶標儀在450 nm處測量吸光度值。

2.6 ROS水平檢測按1×106個/孔將細胞接種于6孔板,按照不同分組分別對相應(yīng)的孔進行處理,CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。向孔中加入DCFH-DA使終濃度為10 μmol·L-1,吹打混勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育。流式細胞儀上機檢測,使用488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長,各組細胞的平均熒光強度反映了細胞內(nèi)的ROS水平。

2.7 流式細胞凋亡檢測將對數(shù)生長期的OS-RC-2細胞接種于6孔板內(nèi),進行所需的處理(加藥或不加藥),48 h后終止培養(yǎng)。收集細胞,加入600 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后室溫避光孵育20 min,加入10 μL PI染色液,混勻,冰浴避光放置5 min,在30 min內(nèi)進行流式細胞檢測。

2.8 GSH檢測5×106個OS-RC-2細胞加入1 mL GSH檢測試劑,在液氮或37 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次,8 000×g離心10 min,取上清置于冰上待測,并按說明書進行操作。蛋白濃度計算GSH含量(μg·mg-1prot)=x÷Cpr(Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,x為標準曲線斜率)。

2.9 MDA檢測5×106個細胞離心收集后,超聲波破碎,取上清,測定管和空白管分別加入300 μL MDA工作檢測液,測定管加入100 μL樣品,空白管加入100 μL蒸餾水;混合液在100 ℃水浴中放置60 min,置于冰浴中冷卻,10 000g常溫離心10 min。吸取200 μL上清液于96孔板中,測定各樣本在532 nm和600 nm處的吸光度。MDA含量(nmol·mg-1prot)=53.763×ΔA÷Cpr(Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,g·L-1)

2.10 Western blot蛋白表達檢測提取細胞總蛋白,上樣濃度為每孔40 μg,利用SDS-PAGE進行電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,牛奶封閉液中室溫下?lián)u床封閉1 h;加入GPX4、SLC7A11、Transferrin、HO-1一抗工作液置4 ℃冰箱過夜;TBST 緩沖液(pH 7.4)洗膜,室溫下孵育稀釋的二抗1.5 h;TBST洗膜,ECL發(fā)光液顯影。同法封閉、孵育GAPDH。ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPad 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表示為。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,服從正態(tài)分布時,兩兩比較采用LSD-t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;不服從正態(tài)分布時,采用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析兩個或多個組之間的差異,檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞增殖、ROS水平的影響CCK-8檢測不同濃度(0～24 mg·L-1)的蛇莓醇提物給藥24、48、72 h后對OS-RC-2細胞活力的影響。結(jié)果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物可呈時間及濃度依賴性抑制OS-RC-2的細胞活力,見Fig1A。

Fig1 Duchesnea indica (Andr.) Focke alcohol extract inhibited OS-RC-2 cell proliferation and increased ROS

采用ROS試劑盒檢測蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞ROS水平的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,5、15 mg·L-1兩個濃度的蛇莓醇提物明顯促進了OS-RC-2細胞的ROS水平,見Fig1B、1C。

3.2 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,與DMSO對照組相比,1.25、2.5、5、10、20 mg·L-1的蛇莓醇提物給藥明顯促進OS-RC-2細胞凋亡。然而,5、10、20 mg·L-1的給藥濃度引起的各組間細胞凋亡率并無顯著差異,提示蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖可能并非通過凋亡途徑,見Fig2。

Fig2 Effect of Duchesnea Indica extract on apoptosis of OS-RC-2

3.3 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞GSH、MDA含量的影響檢測5、10、15 mg·L-1蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞GSH、MDA含量的影響。結(jié)果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物給藥后明顯降低OS-RC-2細胞的GSH含量,見Fig3A;而MDA含量顯著增加,見Fig3B。

Fig3 Effect of Duchesnea Indica (Andr.) Focke alcohol extract on content of OS-RC-2 GSH and

3.4 鐵死亡抑制劑、ROS抑制劑對蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖的影響為進一步研究蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖的機制,本課題利用鐵死亡抑制劑Fer-1或ROS抑制劑NAC預(yù)處理細胞,并將實驗分為4組,即:DMSO對照組、Fer-1(1 μmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、Fer-1+蛇莓醇提物聯(lián)合給藥組,或:DMSO對照組、NAC(5 mmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、NAC+蛇莓醇提物聯(lián)合給藥組,用CCK-8進行細胞活力檢測。結(jié)果顯示,相較于蛇莓醇提物單獨給藥組,Fer-1與蛇莓聯(lián)合給藥組顯著回復(fù)蛇莓醇提物單獨給藥引起的細胞活力降低,見Fig4A;相較于蛇莓醇提物單獨給藥組,ROS抑制劑NAC與蛇莓聯(lián)合給藥組逆轉(zhuǎn)了蛇莓醇提物單獨給藥引起的細胞活力降低,見Fig4B。

Fig4 Effects of ferroptosis and ROS inhibitors on proliferation of OS-RC-2

3.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接研究蛇莓中潛在的藥效物質(zhì)利用Herb數(shù)據(jù)庫對蛇莓的主要成分進行查詢,蛇莓草藥編號為:HERB004977,數(shù)據(jù)庫顯示蛇莓主要成分有Ducheside A(蛇莓苷A)、Ducheside B(蛇莓苷B) 、Rosamultin(野薔薇苷)、Pomolic acid(坡模醇酸)、Dulcitol (衛(wèi)矛醇)、Roseoside(玫瑰花苷)、Ponalactone A(波那內(nèi)酯A)等。

隨后利用Cytoscape軟件對蛇莓-成分-靶點進行可視化,如Fig5A;接下來,利用MOE軟件對蛇莓的主要成分與鐵死亡的核心靶點GPX4進行分子對接。結(jié)果顯示,衛(wèi)矛醇與GPX4蛋白受體-配體復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定,結(jié)合能為-6.5 kJ·mol-1。衛(wèi)矛醇與GPX4蛋白受體的ARG-152、ILE-129、LYS-135存在四對相互作用并存在4個氫鍵,見Fig5B,這提示蛇莓中的衛(wèi)矛醇可能直接作用于GPX4誘導(dǎo)OS-RC-2細胞發(fā)生鐵死亡。

Fig5 Composition and target of Duchesnea Indica (Andr.) Focke

3.6 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞鐵死亡蛋白標志物的影響因蛇莓醇提物明顯降低OS-RC-2細胞的GSH含量并增高MDA含量和ROS水平,鐵死亡抑制劑Fer-1和ROS抑制劑NAC逆轉(zhuǎn)了蛇莓醇提物引起的細胞活力下降,且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接發(fā)現(xiàn)蛇莓醇提物中的衛(wèi)矛醇可能作用于鐵死亡的關(guān)鍵靶點GPX4,表明蛇莓醇提物誘發(fā)了OS-RC-2細胞鐵死亡。為明確蛇莓醇提物引起OS-RC-2細胞發(fā)生鐵死亡的分子機制,進行了Western blot檢測。結(jié)果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物明顯增加Transferrin、HO-1蛋白水平并降低了GPX4,SLC7A11蛋白水平,見Fig6A、6B。

Fig6 Effect of Duchesnea Indica (Andr.) Focke alcohol extract on level of ferroptosis

接下來,將實驗分為以下四組:DMSO對照組、Fer-1(1 μmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、Fer-1+蛇莓醇提物聯(lián)合給藥組。Western blot結(jié)果顯示,Fer-1與蛇莓聯(lián)合給藥組能明顯逆轉(zhuǎn)蛇莓單獨給藥所引起的Transferrin、HO-1蛋白水平升高及GPX4,SLC7A11蛋白水平降低,見Fig6C、6D。

3.7 衛(wèi)矛醇對OS-RC-2細胞增殖及GPX4蛋白表達的影響為明確蛇莓醇提物中的衛(wèi)矛醇對OS-RC-2細胞增殖能力及對鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4蛋白表達的影響,課題組用CCK-8檢測不同濃度的衛(wèi)矛醇(0～80 μmol·L-1)給藥48、72 h后對OS-RC-2細胞活力的影響,并用Western blot檢測衛(wèi)矛醇給藥48 h后GPX4蛋白表達水平的變化。

結(jié)果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物中的衛(wèi)矛醇可抑制OS-RC-2的細胞活力,見Fig7A、7B;并顯著降低GPX4的蛋白表達,見Fig7C、7D。

Fig7 Effect of Dulcitol on cell proliferation and protein

4 討論

蛇莓為薔薇科蛇莓屬植物的葉,其化學(xué)成分較為明確,主要包括蛇莓苷A、蛇莓苷B、烏蘇酸、齊墩果酸、β-谷甾醇、薔薇酸、對羥基桂皮酸和芹菜素等[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蛇莓具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤的作用[10-11]。如蛇莓提取物可通過MEK/ERK途徑抑制MMP-2活性,從而降低口腔癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能[12];此外,蛇莓提取物還具有抑制膀胱癌、宮頸癌[13-14]等腫瘤細胞的增殖作用,但在腎透明細胞癌中的作用及其機制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)蛇莓呈濃度及時間依賴性抑制腎透明細胞癌OS-RC-2細胞的增殖,并顯著增加細胞ROS水平。隨后,在與細胞活力呈濃度依賴的范圍內(nèi)(0～20 mg·L-1)進行了細胞凋亡檢測,結(jié)果顯示當(dāng)蛇莓濃度超過5 mg·L-1后,即使藥物濃度增加至20 mg·L-1,OS-RC-2細胞的凋亡率并未隨之增加,提示蛇莓引起的細胞活力降低并非由凋亡驅(qū)動。

接下來進行了GSH、MDA的含量檢測,結(jié)果顯示蛇莓給藥降低OS-RC-2細胞GSH含量并增加MDA的含量。GSH含量降低、MDA含量增加均是鐵死亡的標志性事件之一[15],且ROS的積累,導(dǎo)致氧化失衡是鐵死亡的必經(jīng)過程[16]。課題組利用鐵死亡的抑制劑Fer-1和活性氧的抑制劑NAC進行了回復(fù)實驗,探索蛇莓抑制OS-RC-2細胞增殖是否由鐵死亡驅(qū)動,結(jié)果表明Fer-1和NAC均在一定程度上逆轉(zhuǎn)了蛇莓引起的細胞活力降低,提示蛇莓醇提物通過誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮抑制OS-RC-2細胞增殖作用。對蛇莓給藥后OS-RC-2細胞的鐵死亡關(guān)鍵蛋白表達進行檢測,顯示蛇莓給藥后降低了細胞GPX4、SLC7A11蛋白表達水平。

GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17],研究顯示,GPX4活性對于維持細胞中的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、防止有毒脂質(zhì)ROS的積累,從而阻斷鐵死亡的氧化引起的非凋亡性細胞死亡模式至關(guān)重要[18]。為研究蛇莓中潛在的藥效物質(zhì),我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方式對蛇莓的成分和靶點進行分析,并與鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控因子GPX4進行了分子對接,結(jié)果顯示蛇莓主要成分衛(wèi)矛醇與GPX4蛋白受體-配體復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定,結(jié)合能為-6.5 kJ·mol-1?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,衛(wèi)矛醇可以通過SIRT1/p53途徑抑制肝細胞癌的增殖和遷移[19];可通過調(diào)節(jié)自噬途徑對大鼠C6膠質(zhì)瘤發(fā)揮抑制作用[20],表明衛(wèi)矛醇可能是一種有潛力化療劑。為進一步驗證衛(wèi)矛醇的抑癌作用及作用機制,課題組進行了CCK-8及Western blot實驗,結(jié)果表明衛(wèi)矛醇可抑制OS-RC-2細胞增殖并降低GPX4的蛋白水平。綜上,提示衛(wèi)矛醇可能直接作用于GPX4驅(qū)動腎癌細胞發(fā)生鐵死亡。

蛇莓醇提物中成分眾多,針對類似混合物的研究僅僅使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的策略可能存在一定的局限性,結(jié)合液相-質(zhì)譜技術(shù)對混合物的成分進行檢測,隨后再進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可能對其藥效成分的探索更具有科學(xué)性,本次研究僅僅在細胞層面上證實了蛇莓中的衛(wèi)矛醇可能是一種鐵死亡的驅(qū)動劑,但仍需要進一步在動物或者更多的細胞系上驗證。

本次研究結(jié)果表明,蛇莓中的活性成分衛(wèi)矛醇可能作為一種潛在的腎癌鐵死亡誘導(dǎo)劑,通過降低GPX4的表達,驅(qū)動腎癌細胞發(fā)生ROS積累、脂質(zhì)過氧化,進一步驅(qū)動腎癌細胞發(fā)生鐵死亡,此研究有望為開發(fā)具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎(chǔ)。