曹 振,程路暢,秦祎雄,郭 勇,韓 標(biāo)

(桂林醫(yī)學(xué)院1.智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院、2. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 桂林 541199)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是常見的惡性原發(fā)性腦腫瘤,也是最具侵襲性的癌癥之一。目前,GBM的主要治療方法是替莫唑胺配合化療,但中位數(shù)生存期僅為12～15個(gè)月[1]。因此,醫(yī)學(xué)上亟須開發(fā)新的藥物來治療GBM。

癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫是具有里程碑意義的癌癥基因組計(jì)劃,也是最大的癌癥數(shù)據(jù)庫,其包含兩萬多種原發(fā)癌的分子特征、33種癌癥類型及癌旁正常組織。TCGA數(shù)據(jù)庫已經(jīng)生成并提供了癌癥組織、癌旁組織基因組學(xué)數(shù)據(jù)以及患者的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)[2]。因其規(guī)范、龐大的臨床腫瘤數(shù)據(jù),已成為研究癌癥最實(shí)用、最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫。近年來,越來越多的研究者們將基因組學(xué)納入新藥開發(fā)的有效參考數(shù)據(jù)。連接圖譜(connectivity map,CMAP)是一種使用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)挖掘潛在治療藥物的新型獨(dú)立途徑。自CMAP出現(xiàn)以來,在藥物再利用、靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制闡明領(lǐng)域已取得了許多成就[3]。例如,最近在Cell上發(fā)表了一篇基于CMAP數(shù)據(jù)庫鑒定和治療肥胖癥的候選藥[4]。Wen等[5]通過CAMP數(shù)據(jù)庫識(shí)別了四物湯作為一種核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)激活劑和植物雌激素,在女性疾病與保健過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究通過TCGA基因組學(xué)數(shù)據(jù)和CMAP發(fā)現(xiàn)了一種治療GBM契合度高的藥物鹵泛群。鹵泛群是FDA批準(zhǔn)的用于治療重癥瘧疾藥物,對(duì)氯喹敏感和耐藥的瘧原蟲具有活性[6]。最近的一項(xiàng)研究顯示與替莫唑胺作用原代GBM KUGBM8細(xì)胞相比,鹵泛群抑制KUGBM8細(xì)胞活性率要低于50%[7]。盡管我們的發(fā)現(xiàn)顯示鹵泛群可能具有治療GBM的作用,但其準(zhǔn)確的治療效果和具體機(jī)制尚不清楚。為了研究鹵泛群治療GBM的潛在可能及其作用機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接預(yù)測(cè)鹵泛群治療GBM的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)鹵泛群治療膠質(zhì)母細(xì)胞的作用及作用靶點(diǎn)。本研究綜合了多個(gè)新藥開發(fā)的方法,整合了藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)和基因組學(xué)數(shù)據(jù),為疾病的新藥開發(fā)提供了全新思路,并為鹵泛群治療GBM提供參考。

1 材料與方法

1.1 GBM基因組學(xué)數(shù)據(jù)獲得從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取169個(gè)GBM組織樣品和5個(gè)癌旁組織樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。在進(jìn)行差異表達(dá)分析之前,對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。使用edgeR25 R語言包進(jìn)一步分析歸一化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),所有的P值都使用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)來校正多次比較,以差異倍數(shù)(fold change,FC)為2,P<0.01界定并篩選差異表達(dá)基因,使用R平臺(tái)中的gplots和heatmap包生成了火山圖和熱圖,用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)和基因本體(gene ontology,GO)富集對(duì)差異基因進(jìn)行系統(tǒng)歸類。

1.2 CMAP數(shù)據(jù)庫發(fā)掘GBM潛在治療藥物以FC為4,P<0.01認(rèn)定為具有極顯著差異,依據(jù)極顯著差異基因和CMAP數(shù)據(jù)庫(https://clue.io/about)篩選GBM潛在的治療藥物。

1.3 鹵泛群靶點(diǎn)收集利用STITCH數(shù)據(jù)(https://ngdc.cncb.ac.cn)、Drug bank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)、Binding DB數(shù)據(jù)庫(https://www.bindingdb.org)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn)、TargetNet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com)、Swiss Target數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)、PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)收集鹵泛群經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶點(diǎn)。

1.4 鹵泛群靶點(diǎn)功能富集利用STRING(https://cn.string-db.org)對(duì)鹵泛群靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析,選取經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證且蛋白互作得分在0.5分以上的關(guān)系進(jìn)行cytoscape軟件可視化,然后用cytoscape下的cluster maker對(duì)互作關(guān)系進(jìn)行功能區(qū)塊分析。

1.5 GBM疾病靶點(diǎn)收集利用Drug bank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、TDD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)收集GBM疾病靶點(diǎn),對(duì)這4個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選出的靶點(diǎn)取交集,選擇至少在3個(gè)數(shù)據(jù)出現(xiàn)的靶點(diǎn)作為GBM疾病靶點(diǎn)。

1.6 基于鹵泛群靶點(diǎn)和GBM靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析使用STRING進(jìn)行鹵泛群靶標(biāo)和GBM靶標(biāo)互作分析,取蛋白互作可信得分>0.9的關(guān)系進(jìn)一步分析,將選取的蛋白互作關(guān)系通過cytoscape可視化并分析其連接度得分,依據(jù)連接度得分進(jìn)行大小不同可視化。

1.7 基于鹵泛群靶點(diǎn)和GBM基因組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析取鹵泛群靶點(diǎn)和GBM差異表達(dá)的基因交集,對(duì)所選取交集基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集和蛋白互作分析,通過cytoscape可視化其相對(duì)應(yīng)關(guān)系,并依據(jù)可視化大小顯示其核心程度。

1.8 分子對(duì)接預(yù)測(cè)潛在的治療靶點(diǎn)選取以上網(wǎng)絡(luò)藥理分析的核心蛋白作為候選分子對(duì)接模型,通過PubChem獲取鹵泛群配體,從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)獲取蛋白三維結(jié)構(gòu),然后通過AutoDock Vina對(duì)藥物配體和蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接。Surflex-Dock評(píng)分函數(shù)的因子包括疏水項(xiàng)、極性項(xiàng)、排斥項(xiàng)、熵項(xiàng)和溶劑化項(xiàng)。這是該領(lǐng)域公認(rèn)的方法,在計(jì)算配體-受體相互作用中起著至關(guān)重要的作用?；赟urflex-Dock評(píng)分函數(shù)的最高評(píng)分構(gòu)象被選為最終生物活性構(gòu)象,選擇對(duì)接分值> 7的視為藥物潛在作用靶點(diǎn),通過PLIP網(wǎng)站(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de)和PyMol軟件將藥物作用蛋白的活性口袋和氨基酸位點(diǎn)顯示出來。

1.9 CCK-8檢測(cè)鹵泛群對(duì)GBM的抑制作用取對(duì)數(shù)期生長的人GBM細(xì)胞系U87,細(xì)胞以2×108·L-1接種于96孔板,每孔細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,加入不同濃度的鹵泛群(0、20、40、80、160、320、640 μmol·L-1),37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h,每孔棄上清液終止培養(yǎng),用PBS清洗后加入20 μL CCK-8,孵育1 h后,在酶標(biāo)儀震蕩混勻,選取波長450 nm測(cè)定吸光度值。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率,細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)細(xì)胞樣品加入TRIzol,靜置10 min后,以5 ∶1的比例加入氯仿,震蕩混勻后室溫靜置15 min,4 ℃,12 000×g離心15 min,吸取上層水相后加入等體積的異丙醇靜置10 min,4 ℃,12 000×g離心10 min,棄上清后加入75%的乙醇,懸浮沉淀后4 ℃,12 000×g離心10 min,棄上清,通風(fēng)櫥風(fēng)干5 min。65 ℃ 25 μL DEPC水溶解,Nanodrop 2000測(cè)定RNA的濃度和純度。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,再利用TaKaRa SYBR qPCR試劑盒測(cè)定基因(引物序列詳見Tab1)的表達(dá)量?！鰿T=CT目的基因-CT內(nèi)參基因,△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組,用2-△△CT表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)與對(duì)照組的變化倍數(shù)。

Tab1 Sequence of primers

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料多組比較用單因素方差分析,兩組比較均用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)挖掘GBM的發(fā)生機(jī)制通過R語言包對(duì)TCGA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘(Fig1),神經(jīng)母膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生過程中,大部分基因顯著下調(diào)(Fig1A)。為了更好地了解GBM的發(fā)生機(jī)制,進(jìn)行了GO富集和KEGG富集。從生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組分3個(gè)方面富集,每個(gè)方面均列出8個(gè)最顯著的差異富集,其中神經(jīng)元投射發(fā)育調(diào)節(jié)、突觸生成、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)在GBM發(fā)生中有重要作用(Fig1B)。列出15個(gè)顯著差異基因富集信號(hào)通路,其中晝夜節(jié)律、谷氨酸能突觸、嗎啡依賴、γ-氨基丁酸能突觸和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路在GBM發(fā)生發(fā)展中具有重要意義(Fig1C)。

Fig1 TCGA data mining mechanism of glioblastoma

2.2 CMAP發(fā)掘GBM潛在治療藥物依據(jù)極顯著差異基因和CMAP篩選GBM潛在的治療藥物(Tab2),其中鹵泛群具有結(jié)合度為1的治療潛能。

Tab2 Screening potential therapeutic drugs for glioblastoma in connectivity map

2.3 鹵泛群和GBM靶標(biāo)信息鹵泛群靶標(biāo)從STITCH數(shù)據(jù)庫獲得6個(gè)靶標(biāo)、Drug bank數(shù)據(jù)庫獲得6個(gè)靶標(biāo)、Binding DB數(shù)據(jù)庫獲得4個(gè)靶標(biāo)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得31個(gè)靶標(biāo)、TargetNet數(shù)據(jù)庫獲得10個(gè)靶標(biāo)、SwissTarget數(shù)據(jù)庫獲得49個(gè)靶標(biāo)、PubChem數(shù)據(jù)庫獲得72個(gè)靶標(biāo),然后對(duì)獲得靶標(biāo)取并集、刪除重復(fù)項(xiàng)后獲得150個(gè)鹵泛群且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶點(diǎn)(如Tab3)。

Tab3 Target of halofantrine

GBM疾病靶點(diǎn)從Drug bank數(shù)據(jù)庫收集62個(gè)靶標(biāo),DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集203個(gè)靶標(biāo),GeneCards數(shù)據(jù)庫收集1 381個(gè)靶標(biāo),TDD數(shù)據(jù)庫收集16個(gè)靶標(biāo),取以上4個(gè)數(shù)據(jù)庫靶標(biāo)的交集并選取在3個(gè)以上數(shù)據(jù)庫同時(shí)出現(xiàn)的靶標(biāo)作為疾病候選靶標(biāo)(Fig2A)。

Fig2 Venn diagram of disease target,drug target,disease differential gene

2.4 鹵泛群靶點(diǎn)功能富集對(duì)鹵泛群靶點(diǎn)的互作及靶點(diǎn)簇叢富集分析(Fig3),鹵泛群作用靶點(diǎn)主要集中在四大板塊:MAPK信號(hào)通路、鈣離子調(diào)節(jié)功能、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)功能、NADPH氧化功能。其中鈣調(diào)蛋白1(recombinant calmodulin 1,CALM1)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族成員3(solute carrier family 6,Member 3,SLC6A3)和4(solute carrier family 6,member 4,SLC6A4)處于網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn),其靶點(diǎn)的相關(guān)板塊均在GBM發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,提示鹵泛群治療GBM具有極大的可能性。

2.5 鹵泛群抗GBM靶點(diǎn)及功能相關(guān)蛋白互作STRING數(shù)據(jù)庫用于鹵泛群靶標(biāo)和GBM靶標(biāo)互作分析,取蛋白互作可信得分>0.9的關(guān)系進(jìn)一步分析。鹵泛群靶標(biāo)和GBM靶標(biāo)重合有12個(gè)(Fig2B),我們將重合靶標(biāo)置于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的中間,其中核心重合靶點(diǎn)有MAPK14,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A),胰島素樣生長因子1受體(type 1 insulin-like growth factor receptor,IGF1R)。表明鹵泛群極有可能通過MAPK信號(hào)通路治療GBM,調(diào)節(jié)GBM的細(xì)胞周期影響其生存率。并且將連接度大于10的核心基因置于網(wǎng)絡(luò)圖外側(cè)(Fig4),其中腫瘤蛋白p53、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)、胱天蛋白酶3(recombinant caspase 3,CASP3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)基因的突變是引起GBM直接的原因。結(jié)果表明鹵泛群也可能與這些蛋白相互作用的過程中發(fā)揮其治療GBM的功能。

Fig4 Network pharmacology analysis of halofantrine against glioblastoma

2.6 鹵泛群靶標(biāo)和GBM基因組學(xué)基因富集和網(wǎng)絡(luò)藥理分析取鹵泛群靶點(diǎn)和GBM差異表達(dá)的基因交集(Fig2C),對(duì)所選取交集基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集和蛋白互作分析。所選基因主要富集于鈣離子信號(hào)通路和多巴胺能突觸信號(hào)通路。其余關(guān)鍵信號(hào)通路晝夜節(jié)律,MAPK信號(hào)通路,神經(jīng)配體信號(hào)通路也是GBM發(fā)生發(fā)展的常見信號(hào)通路。此外,L-型電壓依賴鈣離子通道α1C亞基(calcium channel,voltage dependent,L-Type,Alpha 1C Subunit,CACNA1C)、谷氨酸受體亞基ε-2(glutamate receptor subunit epsilon 2,GRIN2B)、CALM1、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位β基因(protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta,PRKACB)是該網(wǎng)絡(luò)藥理的核心Hub點(diǎn),在鹵泛群治療GBM過程中發(fā)揮潛在的重要作用(Fig5)。

Fig5 Analysis of interacting proteins and corresponding signaling pathways at intersection of halofantrine targets and glioblastoma genomic data

2.7 分子對(duì)接預(yù)測(cè)鹵泛群治療GBM潛在核心靶點(diǎn)取Fig4、5中核心節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接來驗(yàn)證其是否是潛在的治療靶點(diǎn),其中能查詢到的蛋白結(jié)構(gòu)的有β-位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme,BACE1)、EGFR、MAPK14、IGF1R等,分子對(duì)接評(píng)分> 7具有潛在互作關(guān)系,結(jié)果如下:EGFR、MAPK14、IGF1R均有大于的7的互作關(guān)系,其中EGFR潛在作用得分高達(dá)8.5。因此,EGFR極有可能是鹵泛群治療GBM過程中核心靶點(diǎn)(Fig6)。

Fig6 Molecular docking model of halofantrine with target protein

2.8 鹵泛群抑制GBM U87的作用利用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度的鹵泛群抑制GBM U87增殖的影響(Fig7)。與空白對(duì)照組相比,80 μmol·L-1鹵泛群能明顯抑制GBM U87的增殖。

Fig7 Effect of halofantrine on viability of U87

2.9 鹵泛群降低MAPK14、EGFR、IGF1RmRNA的表達(dá)qPCR的結(jié)果顯示(Fig8),給予80 μmol·L-1的鹵泛群后,MAPK14、EGFR和IGF1RmRNA的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組。

Fig8 Effect of 80 μmol·L-1 halofantrine on mRNA of MAPK14,EGFR and

3 討論

GBM具有較高的侵襲性,且浸潤性腫瘤細(xì)胞始終停留在腦周圍,導(dǎo)致后來的疾病復(fù)發(fā),GBM難治性是臨床的主要障礙,嚴(yán)重降低了預(yù)期壽命,50%以上的GBM發(fā)生基因突變,導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞凋亡減少,化學(xué)耐藥性增加[8]。因此,治療GBM的新藥開發(fā)迫切且重要。本研究通過大樣本TCGA臨床基因組數(shù)據(jù)分析了GBM發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,并結(jié)合CMAP挖掘到潛在治療GBM藥物鹵泛群,進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接等方法綜合分析了鹵泛群治療GBM的可能性和潛在機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析顯示,鹵泛群具有調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路、鈣離子調(diào)節(jié)功能、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)功能、NADPH氧化功能。進(jìn)一步結(jié)合鹵泛群的靶點(diǎn)和GBM的靶點(diǎn),鹵泛群抗GBM的核心靶點(diǎn)有MAPK14、EGFR、CDKN2A、IGF1R。MAPK14是p38 MAPK家族成員,編碼p38α促分裂原活化蛋白激酶,已被報(bào)道在GBM炎癥微環(huán)境中的侵襲具有重要作用,MAPK14抑制劑減弱了GBM對(duì)促炎細(xì)胞因子的分泌,抑制了其侵襲轉(zhuǎn)移[9]。EGFR是ERBB家族的一種跨膜受體酪氨酸激酶,大量的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,EGFR基因和蛋白在GBM患者中高表達(dá),EGFR促進(jìn)GBM的生長、存活、侵襲、干性、代謝及血管生成的能力[10]。CDKN2A是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A,其編碼的蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而充當(dāng)腫瘤抑制基因,通過對(duì)10例原發(fā)性和復(fù)發(fā)性 GBM全基因組分析發(fā)現(xiàn),在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性 GBM 中普遍觀察到CDKN2A/CDKN2B的突變[11]。IGF1R是激素胰島素樣生長因子1的細(xì)胞表面受體,屬于酪氨酸激酶受體家族,其參與細(xì)胞凋亡、有絲分裂、細(xì)胞遷移、多藥耐藥性和放射耐藥性且在GBM發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[12]。我們通過鹵泛群的靶點(diǎn)與GBM發(fā)病顯著基因交互分析,結(jié)果獲得了34個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn),且34個(gè)潛在關(guān)鍵治療靶點(diǎn)所在信號(hào)通路是多巴胺能突觸和鈣離子信號(hào)通路。多巴胺和鈣離子是GBM發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子,多巴胺通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用并通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成來影響GBM發(fā)生。鈣離子信號(hào)通路的失調(diào)與功能異常是GBM發(fā)生的先決條件,使其在有絲分裂的第一間隙期/合成期(first gap/synthesis,G1/S)檢查位點(diǎn)失衡[13]。其中處于核心的靶點(diǎn)是CACNA1C、GRIN2B、CALM1、PRKACB。CACNA1C是一種鈣離子通道,將帶正電的鈣原子輸送到細(xì)胞,在細(xì)胞產(chǎn)生電信號(hào)的能力中起著關(guān)鍵作用。最近的一項(xiàng)研究表明[14],敲低CACNA1C可以抑制GBMLN299,U87細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的增殖,原位膠質(zhì)母細(xì)胞小鼠模型中過表達(dá)CACNA1C明顯縮短了小鼠生存期。GRIN2B編碼的蛋白質(zhì)是NMDA受體離子通道的一個(gè)亞單位,NMDA受體是谷氨酸的激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn),在被激活時(shí)允許陽離子交換。GRIN2B在GBM細(xì)胞中大量表達(dá),被證明通過負(fù)調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)變來促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。CALM1基因編碼一種鈣調(diào)蛋白,鈣調(diào)蛋白是鈣依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬。有研究表明,敲低CALM1對(duì)體內(nèi)GBM具有很強(qiáng)的抗侵襲作用。PRKACB基因編碼的蛋白質(zhì)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員,cAMP信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)許多過程都很重要,包括細(xì)胞增殖和分化[16]。目前針對(duì)PRKACB基因在GBM中的作用沒有具體的研究,但有研究表明,在EGFR突變的條件下PRKACB功能激活可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲。最后通過分子對(duì)接模型預(yù)測(cè),我們篩選出EGFR、MAPK14和IGF1R 3個(gè)可能的作用靶點(diǎn)。因此,鹵泛群的抗GBM藥理活性可能是通過調(diào)節(jié)多巴胺能突觸、鈣離子信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等多方面而受益的。

本研究通過臨床基因組學(xué)大數(shù)據(jù)和CMAP挖掘出潛在治療GBM的藥物鹵泛群,這與最近一項(xiàng)研究具有類似的結(jié)果,Senbabaoglu等[7]通過體外高通量藥物篩選,從1 200種FDA批準(zhǔn)的藥物中篩選具有明顯抑制GBM的藥物,為了能更好的反應(yīng)藥物的抑制效果和更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),該團(tuán)隊(duì)從膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者組織中提取原代細(xì)胞系KUGBM8細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)研究模型。以傳統(tǒng)藥物替莫唑胺作為治療對(duì)照,經(jīng)過1 200種藥物劑量標(biāo)準(zhǔn)化后發(fā)現(xiàn)鹵泛群明顯抑制KUGBM8細(xì)胞的生存力(降低到50%以下)。本研究從TCGA疾病基因組學(xué)數(shù)據(jù)出發(fā),通過疾病發(fā)生發(fā)展的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義基因逆向?qū)ふ覞撛谥委熕幬?卻與從藥物出發(fā),廣泛篩選治療疾病的藥物得出相同的結(jié)論,不僅增加了我們研究的可信度,更為新藥的研究開發(fā)提供一種全新的思路。

GBM發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要方面是惡性轉(zhuǎn)化遺傳改變的順序積累和生長因子信號(hào)通路異常調(diào)節(jié)的結(jié)果,其中最重要的改變是EGFR的擴(kuò)增和過度表達(dá)。目前大量研究治療GBM的藥物是以EGFR為靶標(biāo)逆向?qū)ふ宜幬?人參皂苷Rh2、埃羅替尼、β-欖香烯等藥物均能抑制EGFR信號(hào)通路,并且,研究表明這些藥物均有抑制GBM增殖遷移的作用,其中人參皂苷Rh2、埃羅替尼、β-欖香烯等藥物都被發(fā)現(xiàn)是通過抑制EGFR信號(hào)通路抑制GBM的增殖遷移[17]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)EGFR也是鹵泛群治療GBM的靶點(diǎn),且EGFR與鹵泛群分子對(duì)接得分達(dá)7.6,從側(cè)面更加肯定了我們研究結(jié)果,為鹵泛群治療GBM提供了充足的理論依據(jù)。此外,我們的研究較他人的研究更優(yōu)越的地方在于,我們挖掘了更多鹵泛群治療GBM的潛在靶點(diǎn),MAPK14和IGF1R。其次本研究對(duì)鹵泛群藥物靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn),鹵泛群對(duì)人的主要作用還包括促進(jìn)鉀鈣離子流,離子流的門控調(diào)節(jié)紊亂也是GBM發(fā)生最常見的因素[18]。因此,本研究發(fā)現(xiàn)的藥物鹵泛群可能從鉀鈣離子信號(hào)通路、EGFR信號(hào)通路和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路等多個(gè)通路對(duì)GBM起治療作用。

本研究主要從基因組大數(shù)據(jù)出發(fā)尋找藥物,再通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接佐證藥物的治療作用并挖掘潛在作用靶點(diǎn),開發(fā)了一種基于疾病基因組大數(shù)據(jù)挖掘潛在治療藥物,為新藥的研究提供一種新方法、新理論,但是這樣的研究主要還是停留在理論指導(dǎo)方面,忽略其實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值,實(shí)際上鹵泛群具有較大的毒副作用,在臨床治療上易導(dǎo)致心臟猝死,且其具有疏水性,口服在體內(nèi)吸收較差。后期的研究我們將首先通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鹵泛群治療GBM的作用機(jī)制,接著考慮使用脂質(zhì)體包裹鹵泛群藥物進(jìn)行準(zhǔn)確靶向治療,不僅可以提高鹵泛群生物利用度,還可以減少其毒副作用,同時(shí)還能解決腦部疾病如血腦屏障的問題。

我們的研究充分表明鹵泛群極有可能成為治療GBM的新藥物,這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了作用GBM中的鈣離子信號(hào)通路和EGFR、MAPK14、IGF1R、CACNA1C、GRIN2B、CALM1、PRKACB的表達(dá)可能是鹵泛群對(duì)抗GBM的關(guān)鍵藥理學(xué)機(jī)制。

綜上所述,鹵泛群對(duì)GBM具有潛在的治療作用,其治療機(jī)制可能與鈣離子信號(hào)通路和多巴胺能突觸通路密切相關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)有EGFR、MAPK14、IGF1R。