黃城益,鄧淑怡,宋 采,2

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院,廣東 深圳 518117)

β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積、膽堿能遞質(zhì)缺失、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡等在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。有關(guān)AD發(fā)病的起因與機(jī)制眾說紛紜。其中Aβ假說認(rèn)為,氧化應(yīng)激促進(jìn)β-分泌酶(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,Bace1)和γ-分泌酶先后切割淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP),產(chǎn)生了Aβ并沉積于腦內(nèi),損傷神經(jīng)元,最終引發(fā)AD[1]。而炎癥假說對其進(jìn)一步解釋,可溶性Aβ寡聚體(Aβ oligomers,O-Aβ)能夠過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子,小膠質(zhì)細(xì)胞上的Tyro3-Axl-MerTK(TAM)受體酪氨酸激酶之一Axl酶的水平降低,從而降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用,進(jìn)一步加劇了Aβ的積聚[2]。細(xì)胞凋亡假說認(rèn)為,可溶性O(shè)-Aβ使電壓依賴性陰離子通道-1(voltage dependent anion channel-1,VDAC1)水平上升,誘導(dǎo)促凋亡蛋白從線粒體內(nèi)膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中,如B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)[3]以及半胱天冬酶(Caspase)家族的Caspase-3和Caspase-9[4],這些促凋亡蛋白使神經(jīng)元凋亡。已有研究報道,炎癥反應(yīng)能夠使乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)水平上升,而AChE除了能夠?qū)е乱阴Ｄ憠A(acetylcholine,ACh)降解,阻礙神經(jīng)信號傳遞外,還能使細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)更敏感,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5],最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。

已有研究證明Al3+能夠成功誘導(dǎo)斑馬魚AD模型,并應(yīng)用于阿爾茨海默病的病因和治療研究中,但Al3+誘導(dǎo)AD的中樞神經(jīng)炎癥機(jī)制仍有待研究[6]。我們假設(shè),Al3+一方面使腦內(nèi)產(chǎn)生Aβ的前體APP,導(dǎo)致Aβ的積累,另一方面使外周炎癥發(fā)生,釋放促炎細(xì)胞因子進(jìn)入大腦,激活小膠質(zhì)炎癥亞型并抑制其吞噬作用,從而加劇Aβ的積累,誘導(dǎo)了促凋亡機(jī)制的發(fā)生,使神經(jīng)元細(xì)胞死亡,AChE水平上升,導(dǎo)致認(rèn)知障礙,引發(fā)了AD。

當(dāng)前針對AD的治療藥物療效差,尚無準(zhǔn)確靶向中樞神經(jīng)炎癥的藥物,且副作用大。而omega(n)-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)作為海洋生物活性物質(zhì),是細(xì)胞膜的重要組成成分,也是維持人體正常生理活動的必需脂肪酸,具有明顯的抗炎效果且無毒副作用。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是主要的n-3 PUFAs,增加飲食中EPA的攝入,能夠明顯改善中樞神經(jīng)炎癥[7]。增加DHA的攝入,能夠明顯改善免疫疾病中氧化損傷、外周炎癥水平等[8]。我們和他人的大量研究證明EPA和DHA能夠改善M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,減少促炎細(xì)胞因子的釋放,增加神經(jīng)營養(yǎng)因子合成,且均能夠抑制細(xì)胞凋亡[9]。但是,我們曾報道EPA具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化作用,而DHA促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和再生,似對記憶的改善作用更強(qiáng)[10]。由于兩者在食物、衰老和疾病中的比值多變,其單一和最佳組合的功效不明。本團(tuán)隊曾在Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞AD模型上發(fā)現(xiàn),EPA+DHA(1 ∶2)對抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)的作用最佳[11]。本實驗擬解決的關(guān)鍵問題是利用Al3+誘導(dǎo)斑馬魚AD 模型比較研究EPA、DHA及EPA+DHA (1:2)對認(rèn)知障礙及神經(jīng)炎癥的改善作用及其機(jī)制。

本研究通過新物體識別及獎賞記憶實驗評估了斑馬魚的認(rèn)知和記憶能力;通過ELISA法檢測Aβ、q-PCR檢測APP、Bace1和Axl用于評估斑馬魚腦內(nèi)Aβ沉積情況及小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力;q-PCR測定腦內(nèi)IL-6和TNF-α,評估斑馬魚炎癥水平;q-PCR檢測腦內(nèi)VDAC1、Bax、Caspase-3和Caspase-9,評估斑馬魚細(xì)胞凋亡情況;q-PCR檢測腦內(nèi)AChE,進(jìn)一步評價斑馬魚的認(rèn)知障礙;利用GC-MS檢測并評估斑馬魚軀干多不飽和脂肪酸的組成和濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑6～8月齡野生型斑馬魚(上海佳譽(yù)水族館);棕櫚油(益海嘉里金龍魚糧油有限公司,批號:20200406);EPA(純度:85%,批號:TZSW210310-1)、DHA(純度:85%,批號:TZSW210315-1)均購自西安通澤生物科技有限公司;六水合氯化鋁(西隴科學(xué)股份有限公司,批號:7784-13-6);Trizol RNA 提取試劑(廣州齊云生物科技有限公司);HiScript ? Ⅱ Q Select RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:7E472J0)和SYBR qPCR Master Mix熒光染料試劑盒(批號:7E551A1)均購自南京諾維贊生物科技有限公司;RNA引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1分組及處理方式 野生型斑馬魚隨機(jī)分成5組:對照組、模型組、DHA、EPA和DHA+EPA (2 ∶1)治療組。其中DHA+EPA的比例,根據(jù)團(tuán)隊中已發(fā)表的研究選擇2 ∶1。對照組在pH值為6.0±0.2 的清水中并飼喂含棕櫚油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的飼料;將模型組以及治療組的斑馬魚暴露在含Al3+質(zhì)量濃度為100 μg·L-1,pH值亦為6.0±0.2的清水中,模型組飼喂含棕櫚油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的飼料,治療組分別喂食含DHA、EPA和DHA+EPA(2 ∶1)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%的飼料;每天測量并使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)水的pH值。實驗周期為30 d。

1.2.2行為學(xué)實驗 新物體識別實驗于T形迷宮中評價成年斑馬魚的認(rèn)知能力。T形迷宮由透明有機(jī)玻璃制成,外部各臂粘有黑色塑料自黏膜,利用不透光的黑色塑料自黏膜鏤空裁出三角形、正方形和圓形,并將自黏膜分別粘于起始臂、訓(xùn)練臂和新臂。將斑馬魚放入起始臂,關(guān)閉新臂,使其在起始臂和訓(xùn)練臂中自由活動30 min,24 h后打開新臂,將斑馬魚仍從起始臂放入,使其自由探索迷宮5 min,記錄到達(dá)新臂的潛伏期、進(jìn)入新臂的次數(shù)以及在新臂中活動的時長。獎賞記憶實驗亦于T形迷宮中,利用斑馬魚對食物的偏好性,評價斑馬魚的記憶水平。將斑馬魚放入起始臂,自由活動30 min,在訓(xùn)練臂和獎勵臂各放置一個投食環(huán),僅在獎勵臂的投食環(huán)中每10 min投放少量飼料,24 h后,撤去兩端的投食環(huán),將斑馬魚仍從起始臂放入,使其自由探索迷宮5 min,記錄第一次到達(dá)獎勵臂的潛伏期。當(dāng)天結(jié)束試驗后,使斑馬魚在迷宮中自由活動20 min,在獎勵臂的投食環(huán)中每10 min投放少量飼料,進(jìn)行強(qiáng)化記憶訓(xùn)練。第2、3和4天重復(fù)第1天的實驗步驟,第4天測試結(jié)束后不再進(jìn)行強(qiáng)化訓(xùn)練。

1.2.3GC-MS檢測脂肪酸 脂肪酸提取及甲酯化:稱取斑馬魚軀體200 mg,加入適量氯仿-甲醇溶液(2 ∶1)研磨均勻,室溫離心(3 600 r·min-1, 2 min)取上清加入圓底玻璃試管中,與7 mL氯仿-甲醇溶液混合,充滿氮氣后充分渦旋。加入2.5 mL 生理鹽水,充滿氮氣后充分渦旋,室溫離心(500 r·min-1, 20 min)。吸取下層溶液過濾于無水硫酸鈉,3 mL 氯仿緩慢滴洗后收集濾液并用氮氣吹干。于樣品中加入2 mL 0.5 mol·L-1NaOH的甲醇溶液, 90 ℃水浴15 min。冷卻后加入2 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液, 90 ℃水浴30 min。冷卻后加入2 mL 飽和氯化鈉溶液和3 mL 正己烷,萃取2次,僅收集上層溶液。合并2次上層溶液,氮氣吹干,得到脂肪酸甲酯,加入正己烷稀釋至所需濃度,用0.45 μm濾膜過濾,可于-20 ℃保存待測。GC-MS儀器參數(shù):色譜柱InterCap Pure-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為氦氣,流速1 mL·min-1,分流比1 ∶50,進(jìn)樣器溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃,進(jìn)樣量1 μL。采用程序升溫:80 ℃保留2 min,以10 ℃·min-1升至120 ℃,保留5 min,以10 ℃·min-1升至180 ℃,保留5 min,以10 ℃·min-1升至240 ℃,保留8 min。MS條件及參數(shù):離子源溫度:230 ℃,接口溫度:250 ℃,采集方式:Q3 Scan。

1.2.4qPCR檢測 取適量斑馬魚腦組織,利用Trizol提取RNA,測定RNA濃度,利用ddH2O稀釋統(tǒng)一RNA質(zhì)量,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,得到cDNA,利用熒光染料試劑盒于PCR儀檢測IL-6、TNF-α、CD206、APP、Bace1、Axl、AChE、VDAC1、caspase-3、caspase-9、和Bax的mRNA水平,并計算得到相對mRNA水平。各引物序列如Tab1。

Tab1 Primer sequence of qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 EPA、DHA及其組合對Al3+誘導(dǎo)斑馬魚記憶障礙的改善作用由Fig1所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了d 1～4天斑馬魚進(jìn)入獎勵臂的潛伏期(P<0.01,P<0.01);與模型組相比,給予DHA(P<0.01,P<0.01)和DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)均明顯改善了d 1～4斑馬魚進(jìn)入獎勵臂的潛伏期,且DHA+EPA的改善效果更好,而EPA僅明顯改善了d 2～4的潛伏期(P<0.01)。

Fig1 DHA, EPA and their combination significantly inhibited memory deficit of zebrafish induced by Al3+ exposure(n=11-12)

2.2 DHA及其與EPA的組合抑制甚至逆轉(zhuǎn)了Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚認(rèn)知障礙由Fig2所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了斑馬魚到達(dá)新臂的潛伏期(P<0.01),明顯降低了進(jìn)入新臂的持續(xù)時間(P<0.05)和次數(shù)(P<0.05);與模型組相比,DHA+EPA(2 ∶1)均明顯逆轉(zhuǎn)了Al3+暴露后到達(dá)新臂的潛伏期(P<0.01)、進(jìn)入新臂的持續(xù)時間(P<0.01)和次數(shù)(P<0.01),而DHA 僅明顯改善了到達(dá)新臂的潛伏期(P<0.01),EPA則均無明顯的改善作用。上述結(jié)果表明組合的抑制效果最佳。

Fig2 DHA and DHA+EPA significantly reduced or even reversed increased latency of zebrafish to reach new arm (A), the duration in new arm (B) and the number of entries into new arm (C) in Al3+

2.3 EPA與DHA改善Al3+對斑馬魚軀體omega-3多不飽和脂肪酸的降低由Fig3所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯降低了斑馬魚軀體EPA(P<0.01)、DPA(P<0.01)和DHA(P<0.05)的濃度,明顯增加了AA(P<0.05)的濃度;與模型組相比,單獨EPA明顯增加了斑馬魚軀體EPA(P<0.05)和DPA(P<0.05)的濃度,明顯降低了AA的濃度(P<0.05);DHA明顯增加了軀體DHA的濃度(P<0.05),明顯抑制了AA濃度的增加(P<0.01);DHA+EPA(2 ∶1)明顯逆轉(zhuǎn)了AA的濃度增加(P<0.01),對AA濃度的降低效果最佳。

Fig3 DHA, EPA and their combination significantly ameliorated decrease in EPA (A), DHA (B) and DPA concentration (C),while inhibited AA (D) in zebrafish

2.4 EPA、DHA及其組合對Al3+暴露后斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)病理變化的改善作用

2.4.1EPA、DHA及其組合對Aβ蛋白濃度以及APP和Bace1 mRNA表達(dá)的干預(yù)作用 由Fig4.1所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了斑馬魚腦內(nèi)Aβ蛋白濃度以及APP和Bace1的mRNA水平,DHA和EPA則明顯逆轉(zhuǎn)了APP(P<0.01,P<0.01)和Bace1(P<0.01,P<0.01)的mRNA水平變化,DHA和DHA+EPA(2 ∶1)均明顯抑制了Aβ蛋白濃度的上升(P<0.05,P<0.05)。其中單獨EPA對APP mRNA表達(dá)具有最佳的抑制作用。

Fig4.1 DHA, EPA and their combination significantly reduced level of Aβ related parameters in zebrafish brain of Al3+ model group: Aβ protein concentration (A) and relative mRNA level of APP (B) and Bace1

2.4.2EPA、DHA及其組合對神經(jīng)炎癥、小膠質(zhì)亞型及其吞噬清除能力的作用 Fig4.2顯示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內(nèi)TNF-α(P<0.01)和IL-6 (P<0.01)的mRNA水平,明顯降低了小膠質(zhì)細(xì)胞M2型標(biāo)志物CD206(P<0.01)和吞噬清除Aβ相關(guān)基因Axl(P<0.01)的mRNA水平;與模型組相比,3種藥物治療明顯降低IL-6的mRNA表達(dá)水平(均為P<0.01)明顯增加CD206的mRNA水平(均為P<0.01);而DHA及DHA+EPA明顯上調(diào)甚至逆轉(zhuǎn)了Axl mRNA水平的降低(分別為P<0.001,P<0.05),DHA和EPA則明顯逆轉(zhuǎn)了TNF-α mRNA的增加(均為P<0.01)。從P值可以看出,單獨DHA對IL-6和Axl水平的變化具有最佳的逆轉(zhuǎn)作用。

Fig4.2 DHA, EPA and their combination significantly inhibited and even reversed increase of TNF (A) and IL-6 (B) and decrease of CD206 (C) and Axl (D) in zebrafish brain after

Fig4.3 DHA, EPA and their combination reversed increase of AChE in zebrafish brain after Al3+exposure(n=6-8)

2.4.3EPA、DHA及其組合對AChE mRNA表達(dá)的抑制作用 Fig4.4顯示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內(nèi)AChE(P<0.01)的mRNA水平;與模型組相比,DHA(P<0.01)、EPA(P<0.01)、DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)均明顯改善甚至逆轉(zhuǎn)了Al3+暴露后AChE的mRNA水平,其中單獨DHA和DHA+EPA(2 ∶1)的改善效果優(yōu)于單獨EPA,且作用相似。

Fig4.4 DHA, EPA and their combination significantly alleviated and even reversed increased apoptosis related factors mRNA level in zebrafish brain after Al3+exposure: VDAC1 (A), caspase-3 (B), caspase-9 (C) and Bax (D)(n=7-9)

2.4.4EPA、DHA及其組合對腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的抑制作用 由Fig4.3所示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內(nèi)VDAC1(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、Caspase-9(P<0.05)和Bax(P<0.05)的mRNA水平;EPA、DHA及組合治療均降低了Al3+增加Caspase-3(均為P<0.01)、Caspase-9(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01)和Bax(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01)的mRNA水平。而單獨給予DHA(P<0.01)和DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)明顯改善甚至逆轉(zhuǎn)了VDAC1的mRNA水平。P值進(jìn)一步顯示,DHA+EPA (2 ∶1)對Caspase-3和Bax水平的升高有更好的改善作用。

3 討論

眾多動物實驗和臨床研究證明,n-3 PUFA作為重要的膜成分之一,通過增加膜流動性、減少氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)和凋亡途徑[12],從而改善或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病。本研究首次比較了EPA和DHA及其組合對Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚AD模型中認(rèn)知障礙和神經(jīng)病理性變化的不同作用,然后探討EPA和DHA在該模型中的潛在協(xié)同作用。根據(jù)這些結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)DHA和EPA及其組合具有改善甚至逆轉(zhuǎn)認(rèn)知障礙和神經(jīng)病理性變化的作用。其機(jī)制涉及不同程度地抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),恢復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用,降低AChE水平上升,減少神經(jīng)元凋亡。本研究將從以下幾個發(fā)現(xiàn)進(jìn)行討論。

3.1 EPA和DHA的組合對認(rèn)知障礙具有最佳的逆轉(zhuǎn)作用本研究結(jié)果顯示,與AD患者的行為相似,暴露于Al3+的斑馬魚出現(xiàn)認(rèn)知與記憶障礙,說明Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚AD模型成立。臨床實驗表明,長期攝入n-3 PUFAs能改善衰老和早期AD引起的認(rèn)知和記憶衰退[13],本研究的行為結(jié)果進(jìn)一步支持該臨床研究發(fā)現(xiàn)。在獎賞記憶實驗中,DHA和EPA及其組合均明顯降低了斑馬魚進(jìn)入獎勵臂中的潛伏期,其中兩者的組合具有最佳的改善記憶的作用。在新物體識別實驗中,單獨EPA無明顯改善作用,單獨DHA則明顯降低了斑馬魚到達(dá)新臂的潛伏期,而DHA+EPA的組合不僅明顯降低了到達(dá)新臂的潛伏期,還明顯增加了在新臂中的持續(xù)時間以及進(jìn)入新臂的次數(shù),說明在Al3+暴露下,此組合比單獨DHA或EPA對記憶和認(rèn)知障礙具有更好的抑制作用,其組合的作用機(jī)制可能與以下討論結(jié)果相關(guān)。

3.2 EPA和DHA的組合對AA濃度上升具有最佳的抑制作用我們在機(jī)制方面首先探討了三種治療方式對斑馬魚軀干中EPA、DHA、DPA和AA濃度的干預(yù)效果。結(jié)果表明,Al3+明顯降低了斑馬魚軀體中EPA、DPA和DHA的濃度,明顯增加了AA的濃度,這些結(jié)果證明Al3+抑制抗炎o(hù)mega-3,增加促炎o(hù)mega-6 PUFAs合成, 前人在其他動物AD模型上也有類似的結(jié)果。并且我們發(fā)現(xiàn),給予單獨EPA明顯增加了Al3+暴露后斑馬魚軀干中EPA和DPA的濃度,明顯降低了AA的濃度;單獨DHA明顯改善DHA濃度的降低和AA濃度的升高;而DHA+EPA的組合雖然對EPA、DPA以及DHA沒有明顯的干預(yù)效果,但對AA濃度上升的抑制作用最佳。已有動物實驗表明,AA濃度反映了動物體內(nèi)的炎癥水平,且與記憶和認(rèn)知能力呈負(fù)相關(guān)[14]。因為我們認(rèn)為,在本研究中,DHA和EPA在這個比例的組合具有協(xié)同作用,可能是通過降低斑馬魚軀干AA的濃度來抑制斑馬魚體內(nèi)的炎癥水平,從而改善Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚記憶和認(rèn)知障礙。

3.3 EPA、DHA及其組合對Aβ蛋白濃度及其相關(guān)蛋白水平表達(dá)的抑制作用有研究發(fā)現(xiàn),給予的飼料中降低n-3/n-6比例能夠使APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中Aβ濃度增加[15],且我們團(tuán)隊曾發(fā)現(xiàn)EPA的抗炎活性能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的Aβ前體APP的表達(dá)[16]。本研究的結(jié)果證明,給予單獨DHA或EPA均明顯逆轉(zhuǎn)了Al3+誘導(dǎo)斑馬魚腦內(nèi)Bace1和APP的mRNA水平的增加。雖然單獨DHA與組合均明顯降低了Aβ的蛋白濃度,但兩者之間無明顯差異。因此我們認(rèn)為DHA+EPA的組合可能主要不是通過干預(yù)Aβ的生成而達(dá)到改善斑馬魚記憶和認(rèn)知障礙的最佳效果。這一結(jié)果間接地提示多年來作用于Aβ的藥物研發(fā)屢屢失敗的潛在原因。

3.4 單獨DHA對神經(jīng)炎癥、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其吞噬清除能力有最佳的逆轉(zhuǎn)效果本研究也同樣發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Al3+成年斑馬魚腦內(nèi)M1標(biāo)志物CD11表達(dá)增加,抗炎M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)明顯降低,與之對應(yīng),促炎細(xì)胞因子的表達(dá)明顯上升,說明Al3+的刺激能夠誘導(dǎo)斑馬魚腦內(nèi)炎癥的發(fā)生,使小膠質(zhì)細(xì)胞功能紊亂。由于小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬Aβ的功能,對AD的發(fā)生與發(fā)展起到了重要的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)Al3+的刺激不僅引發(fā)了中樞神經(jīng)炎癥,還降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力,由此加劇了Aβ在腦內(nèi)的積累,誘導(dǎo)了斑馬魚AD的發(fā)生。3種PUFAs干預(yù)后,DHA對降低炎癥指標(biāo)TNF-α和IL-6、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活并恢復(fù)其吞噬功能具有最佳的效果,說明單獨DHA可能是通過恢復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞的對Aβ的吞噬作用而干預(yù)Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚認(rèn)知和記憶障礙。但未知組合PUFAs干預(yù)斑馬魚認(rèn)知和記憶障礙最佳療效的作用機(jī)制。

3.5 DHA+EPA的組合對AChE水平的增加和腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的抑制作用最佳AChE在膽堿能突觸間能夠降解ACh,阻礙神經(jīng)信號傳遞,AChE過度活躍是引起記憶和認(rèn)知障礙的原因之一[5]。本研究發(fā)現(xiàn),單獨DHA和EPA以及兩者組合均明顯降低了AChE的mRNA水平,其中組合的干預(yù)作用最佳,說明DHA和EPA在這個比例下對AChE水平的降低具有協(xié)同作用。

3.6 PUFAs組合對細(xì)胞凋亡的抑制作用最佳AD的細(xì)胞凋亡假說認(rèn)為,可溶性O(shè)-Aβ使神經(jīng)元細(xì)胞的陰離子通道VDAC1水平上升,誘導(dǎo)促凋亡蛋白從線粒體內(nèi)膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中,如Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)[3]以及Caspase家族的Caspase-3和Caspase-9[4]這些蛋白使神經(jīng)元凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),Al3+明顯增加腦內(nèi)VDAC1、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平,說明Al3+模型符合AD的細(xì)胞凋亡假說。EPA和DHA及其組合干預(yù)均逆轉(zhuǎn)了VDAC1、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的上升,而DHA+EPA的組合具有最佳的干預(yù)效果。綜上所述,DHA和EPA的比例為2 ∶1時,在抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)方面具有協(xié)同作用,并且對AChE表達(dá)的最佳抑制作用可進(jìn)一步降低了神經(jīng)元與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)合,從而實現(xiàn)對Al3+誘導(dǎo)的斑馬魚記憶和認(rèn)知障礙的最佳干預(yù)效果。