江 濤,由 涌,夏東帥,薄思涵,王永為,高亞賢,宋鴻儒

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.免疫學(xué)教研室、2.解剖學(xué)教研室,河北 承德 067000;3.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院免疫學(xué)教研室,河北 張家口 075000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種難治性慢性的全身性自身免疫性疾病,其病理改變?yōu)槎喟l(fā)和對稱性的滑膜異常增生、關(guān)節(jié)軟骨與骨破壞,常侵犯全身小關(guān)節(jié)[1-2],從而引發(fā)關(guān)節(jié)畸形和功能的喪失。目前普遍認為遺傳因素、環(huán)境及免疫失調(diào)與之相關(guān)[3]。

自噬是將細胞質(zhì)中的物質(zhì)運送到溶酶體進行降解,在細胞、組織和有機體的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[4],有相關(guān)研究表明自噬與風(fēng)濕性疾病的病理改變存在密切聯(lián)系,例如橘皮素和5-羥基6,7,8,3′,4′-五甲基甲黃酮被證明通過AKT/mTOR信號傳導(dǎo)抑制自噬,從而抑制大鼠與牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病理變化[5]。相比于臨床上治療類風(fēng)濕藥物的非甾體抗炎藥(NSAIDs)[1]、糖皮質(zhì)激素(GC)等,中藥具有多靶點、毒副作用小等特點。同時隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)興起,越來越多的中醫(yī)藥從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)體系轉(zhuǎn)化[6]。課題組前期經(jīng)大量實驗研究證實中藥穿山龍治療RA效果肯定[7-10],并且不良反應(yīng)少,因此本實驗通過建立CIA小鼠模型,探討穿山龍主要藥效成分穿山龍薯蕷皂苷[2]是否通過自噬治療CIA小鼠。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級DBA1小鼠:雄性,鼠齡6～7周。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:LAC2021034]

1.1.2實驗藥物 穿山龍薯蕷皂苷來自中國南京秋實生物科技有限公司,稱取1 g羧甲基纖維素鈉加入100 mL超純水中,充分溶解,配成1 %的羧甲基纖維素鈉溶劑。稱取1.2 g穿山龍薯蕷皂苷加入30 mL溶劑中充分混勻制成40 g·L-1的母液。按母液 ∶溶劑為1 ∶1比例稀釋得到20 g·L-1的中劑量組混懸液,按母液 ∶溶劑為1 ∶3比例稀釋得到10 g·L-1的低劑量組混懸液。

陽性對照藥物:雷公藤甲素來自華潤三九(黃石)藥業(yè)有限公司,根據(jù)說明書人的雷公藤甲素每日劑量為72 μg,按照人與鼠體表面積比值計算的小鼠的每日劑量為12 μg·kg-1,體質(zhì)量約為20 g的小鼠,每次灌胃100 μL計算的濃度為2.4 mg·L-1,每片雷公藤片含雷公藤甲素12 μg。將4片雷公藤片研磨成粉末,加入20 mL羧甲基纖維素鈉溶劑中,充分混勻制成混懸液。

1.1.3主要試劑 雞Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司)弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒(中國SparkJade公司),LC3A/B、Beclin-1(美國Cell Signaling Technology),p62(英國Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模與分組 CIA模型建立:適應(yīng)性飼養(yǎng)DBA1小鼠1周,溫度(24 ± 2)℃,濕度(50 ± 10)%,將雞II型膠原與弗氏完全佐劑等體積混合于無菌的EP管中,用玻璃注射器反復(fù)抽吸至乳化完全,以滴入水中不分散形成邊緣規(guī)則的圓點為乳化成功標準。初次免疫:尾根部皮內(nèi)注射100 μL完全弗氏佐劑與雞Ⅱ型膠原1 ∶1混合乳劑免疫,其中10只尾根部皮內(nèi)注射100 μL生理鹽水作為對照組,第21天依照上述方法和劑量加強免疫[11]。加強免疫后將膠原免疫的50只小鼠隨機分組為CIA模型組、雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組,每組10只。從加強免疫后1 d開始連續(xù)灌胃14 d,雷公藤組灌胃給予雷公藤片混懸液100 μL(按雷公藤甲素計每天12 μg·kg-1),穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組灌胃分別給予每天50、100、200 mg·kg-1穿山龍薯蕷皂苷混懸液100 μL,對照組和CIA模型組給予等體積溶劑。

1.2.2CIA小鼠造模后一般情況及關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)測定 在初次免疫21 d對CIA小鼠進行二次免疫后,對小鼠的精神狀態(tài)、飲食狀況、毛發(fā)光亮程度進行觀察,并且每隔3 d對小鼠進行體質(zhì)量、足爪厚度、及AI值測量記錄。用AI值作為衡量足爪腫脹情況的標準。AI評分如下[12]:0級:無明顯腫脹(0分);I級:趾關(guān)節(jié)有輕微紅腫(1分);Ⅱ級:紅腫蔓延足趾關(guān)節(jié)以下(2分);Ⅲ級:紅腫蔓延踝關(guān)節(jié)以下(3分);Ⅳ級:全足爪腫脹(含踝關(guān)節(jié),4分),AI值即四肢骨節(jié)腫脹分數(shù)合計(0～16)。AI指數(shù)值與關(guān)節(jié)癥狀嚴重度呈正比關(guān)系。AI評分大于4分即表明小鼠CIA模型已成功創(chuàng)建。

1.2.3取材 小鼠加強免疫后15 d處理小鼠,處死小鼠后自膝關(guān)節(jié)以下取小鼠足爪去除皮膚和肌肉組織,放入提前配好的4%多聚甲醛溶液,另取小鼠的脾臟,淋巴結(jié)放入液氮中保存。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色 在對小鼠膝關(guān)節(jié)和足爪進行固定和脫鈣后,將組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋處理,隨后對包埋好的組織進行切片,60 ℃烘箱烤片2 h,將切片進行二甲苯透明和常規(guī)乙醇梯度脫水后進行HE染色,再進行乙醇梯度脫水和二甲苯透明,中性樹膠封片后顯微鏡下觀察,采集圖像進行分析。

1.2.5qPCR檢測Beclin-1、p62、LC3的RNA表達 按不同分組分別取小鼠脾和淋巴結(jié)進行研磨的檢測RNA純度和濃度(OD260/280介于1.8～2.0),逆轉(zhuǎn)錄為cDNA置-20 ℃冰箱內(nèi),封存?zhèn)溆?。qPCR引物如下:Beclin-1-F:5′-CTTTTCTGGACTGTGTGCAGC-3′;Beclin-1-R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′;p62-F:5′-CGTGGGGTCCCTCAGATTG-3′;p62-R:5′-TCAGCTTCTTGGACCATGCG-3′; LC3-F:5′-CCAAGTTCCTGGTGCCTGAC-3′;LC3-R:5′-CTTCGGAGATGGGAGTGGAC-3′;GAPDH-F:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′;GAPDH-R:5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。使用2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒,采用PCR循環(huán)(兩步法),94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性5 s,退火60 ℃30 s,循環(huán)40次。所測數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCT方法測量mRNA的相對表達量,ΔΔCT=(實驗組目的基因ΔΔCT均值-實驗組內(nèi)參基因ΔΔCT均值)-(對照組目的基因ΔΔCT均值-對照組內(nèi)參照基因ΔΔCT均值)。2-ΔΔCT表示不同組織中靶基因的相應(yīng)表達水平。

1.2.6Western blot法檢測小鼠脾、淋巴結(jié)組織Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量 將100 mg左右脾、淋巴結(jié)組織放入2 mL離心管中,每個離心管放入3粒3 mm大小的鋼珠,再加入含PMSF的裂解液,隨后放入勻漿儀中進行充分勻漿,裂解至無明顯組織碎片后,4 ℃靜置30 min,在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min,取上清液即脾、淋巴結(jié)組織總蛋白,BCA法測定和調(diào)整濃度后,在100 ℃,5 min條件下進行蛋白變性。取20 μL樣本上樣,經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳(80～120 V)、轉(zhuǎn)膜(200 mA)、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜3次,隨后將膜在稀釋后的一抗(1 ∶1 000)中4 ℃孵育過夜。TBST洗5次,每次5 min。二抗(1 ∶10 000)中室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min。配制適量ECL顯色液均勻滴加在PVDF膜上,放入超敏全自動成像分析儀器中曝光成像,最后將膠片進行掃描并保存。通過ImageJ軟件讀取分析條帶灰度值,計算每個樣本中目標蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足爪AI評分對照組中小鼠足爪無紅腫表現(xiàn),因此AI在本實驗中為0;CIA模型組的AI指數(shù)對比對照組和穿山龍薯蕷皂苷高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,見Fig1。

Fig1 Mouse paw AI score n=4)

2.2 小鼠足爪厚度差值比較與對照組相比,CIA模型組小鼠足爪厚度增加;與CIA模型組相比,雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷組足爪厚度降低,見Fig2,3。

Fig2 Comparison of mouse paw thickness differences

Fig3 Comparison of swelling degree of mouse paws

2.3 小鼠體質(zhì)量變化與對照組相比,其余各組體質(zhì)量均下降,CIA模型組體質(zhì)量下降明顯;雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷低、高劑量組體質(zhì)量明顯回升,見Fig4。

Fig4 Mouse weight comparison

2.4 足爪踝關(guān)節(jié)HE染色與對照組相比,CIA模型組關(guān)節(jié)間隙變窄且有大量炎性細胞浸潤,骨組織明顯被破壞。與CIA模型組相比,雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組有不同程度緩解,并且穿山龍薯蕷皂苷的中、高劑量組對骨質(zhì)破壞和細胞浸潤情況治療作用較為明顯,見Fig5。

Fig5 Histopathological effects of mouse ankle joint (×200)

2.5 膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色與對照組相比,CIA模型組出現(xiàn)滑膜組織增生并且有大量炎性細胞浸潤。與CIA模型組相比,穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組和雷公藤組減輕了炎性細胞浸潤情況,且兩組間對比無明顯差異,見Fig6。

Fig6 Histopathological effects of mouse knee joint synovium (×200)

2.6 各組小鼠脾和淋巴結(jié)中的Beclin-1,p62,LC3的mRNA水平比較與對照組相比,CIA模型組小鼠脾、淋巴結(jié)組織的LC3,Beclin-1的mRNA表達升高,p62的mRNA表達下降;與CIA模型組比較雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組中LC3,Beclin-1的mRNA表達有不同程度下降,p62的mRNA表達水平有不同程度升高,見Fig7,8。

Fig8 Expression of Beclin-1, p62, and LC3 mRNA levels in mouse lymph node n=3)

2.7 各組小鼠脾和淋巴結(jié)中的Beclin-1,p62,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平比較與對照組相比,CIA模型組小鼠脾、淋巴結(jié)組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,Beclin-1蛋白表達顯著升高,p62蛋白表達下降;與CIA模型組比較雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,Beclin-1蛋白表達均有不同程度下降,p62蛋白表達水平有不同程度升高,Fig9,10。

Fig9 Expression of Beclin-1, p62, and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ protein levels in mouse spleen tissue n=3)

Fig10 Expression of Beclin-1, p62, and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ protein levels in mouse lymph node n=3)

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病,嚴重損害患者身體功能和降低生活質(zhì)量[13]。 而膠原誘導(dǎo)性CIA小鼠作為常用的動物模型[14]主要病理表現(xiàn)為增生性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細胞浸潤,其病理表現(xiàn)與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似[15],并且課題組前期對小鼠CIA動物模型建立過程中的小鼠一般情況、足爪腫脹度、足爪AI值及關(guān)節(jié)組織病理學(xué)進行過動態(tài)觀察[9-10],因此被選作為本試驗中的模型。本研究中DBA1小鼠首先采用雞Ⅱ型膠原乳劑初次免疫,第21天再次給予相同劑量加強免疫一次。經(jīng)觀察,初次免疫至加強免疫之前小鼠的一般狀態(tài)良好與正常組之間無明顯區(qū)別,關(guān)節(jié)無明顯變化,加強免疫后2～3 d,小鼠的進食減少,體質(zhì)量開始減輕,小鼠的背部及尾根部形成多處小潰瘍,被毛無光澤,隨后有小鼠潰瘍愈合,形成皮下結(jié)節(jié)。加強免疫第7 d,CIA小鼠精神狀態(tài)差,運動遲緩,體質(zhì)量增長緩慢,95%小鼠后足出現(xiàn)充血紅腫,皮溫升高,足墊增厚,逐漸累及后膝關(guān)節(jié)及前肢,加強免疫第14 d足及膝關(guān)節(jié)腫脹達高峰,嚴重的關(guān)節(jié)不能負重,體質(zhì)量下降明顯?；谇捌诖罅繉嶒灮A(chǔ),在本實驗研究中,DBA1小鼠在第21 d再次給予相同劑量刺激加強免疫后,開始給予穿山龍薯蕷皂苷藥物治療干預(yù)治療,通過對小鼠一般狀況、體質(zhì)量、足爪厚度、及AI值等測量記錄,與對照組相比,模型組及各治療組出現(xiàn)不同程度的足趾腫脹,足關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色顯示炎癥細胞浸潤等,表明模型建立成功,且穿山龍薯蕷皂苷治療組能夠不同程度的緩解足爪腫脹及炎癥浸潤。

自噬是真核細胞中一種常見的正常生理降解機制,有關(guān)于自噬的研究表明其對細胞的生存具有兩面性,一方面發(fā)揮降解蛋白質(zhì)或細胞器的功能,從而維持代謝平衡起到促進細胞存活的功能[16];另一方面,過度的自噬會導(dǎo)致細胞功能的受損,引起自噬性死亡[17]。目前研究表明,自噬水平與RA的病程進展以及病理表現(xiàn)密切相關(guān),RA的細胞炎癥水平與相關(guān)自噬分子呈正相關(guān)。研究有關(guān)自噬的重要標志物有LC3、Beclin-1、p62[18-19]。LC3是研究最充分的自噬分子之一,該蛋白具有4個亞型(LC3A、LC3B、LC3B2和LC3C);通過被蛋白內(nèi)切酶活性的ATG4剪切后的LC3,生成的LC3-Ⅰ與ATG3和ATG7發(fā)生泛素化反應(yīng),繼而生成了持續(xù)附著在自噬體膜上的LC3-Ⅱ,并且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達與自噬水平呈正相關(guān)[20]。Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)和自噬相關(guān)的標志蛋白,是募集自噬效應(yīng)分子的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點,也是干預(yù)修飾自噬通量的可能點[21],其表達的水平可以反應(yīng)自噬的活性[22]。p62/SQSTM1是一種自噬接頭蛋白,可以運輸泛素化物質(zhì)[23],通過和泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合促進了泛素化集合體的合成與降解。由于p62在自噬過程中不斷降解,因此其表達水平與自噬呈負相關(guān)[24]。

在此,為了探討穿山龍薯蕷皂苷能否通過調(diào)控自噬的相關(guān)分子的表達從而減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的癥狀,從而起到治療和預(yù)防的作用。本實驗選擇檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62這三個與自噬相關(guān)的重要標志物的表達來反應(yīng)自噬水平的高低。實驗結(jié)果顯示,與正常組相比,CIA模型組的小鼠體質(zhì)量下降,足爪厚度腫脹明顯增加,膝關(guān)節(jié)滑膜和足爪踝關(guān)節(jié)HE染色顯示有大量炎癥細胞增生。CIA模型組與正常組相比,脾和淋巴結(jié)組織中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的mRNA和蛋白水平明顯升高,p62的mRNA和蛋白水平降低,表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與自噬水平的升高相關(guān)聯(lián)。CIA小鼠經(jīng)過陽性藥物(雷公藤)和高、中、低劑量的穿山龍薯蕷皂苷治療后,與CIA模型組相比,小鼠的一般情況得到改善,體質(zhì)量回升明顯,足爪腫脹程度明顯緩解,脾和淋巴結(jié)中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的mRNA和蛋白水平降低,p62的mRNA和蛋白水平升高,表明CIA小鼠通過穿山龍薯蕷皂苷的治療能夠降低自噬的水平。

本研究基于自噬探討穿山龍薯蕷皂苷對CIA小鼠的治療作用,實驗發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的滑膜組織的炎性浸潤和增生可能與自噬水平升高有密切關(guān)系,并且穿山龍薯蕷皂苷可以通過抑制自噬,使自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表達下調(diào)和p62水平上調(diào),減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥和滑膜增生的情況,使其RA癥狀得到改善。本實驗為尋找新的治療靶點,豐富中藥治療RA提供了重要的理論與實際意義。但本次研究沒有涉及自噬相關(guān)機制研究,今后將進一步探討穿山龍薯蕷皂苷通過抑制自噬治療RA的作用機制。