侯曉燕

黃連是一味中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。因黃連在生長過程中受空氣、水等因素或者人為用藥的影響，不可避免地會出現(xiàn)農(nóng)藥殘留的現(xiàn)象。近年來，國家對中藥農(nóng)藥殘留的監(jiān)管力度逐年加大，《中國藥典》2020年版四部“2341農(nóng)藥殘留量測定法”增加了“第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測定法”，這一標(biāo)準(zhǔn)對完善中藥農(nóng)藥殘留監(jiān)管體系，保障中藥用藥安全起著至關(guān)重要的作用。由于黃連基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重，因此建立準(zhǔn)確、高效的農(nóng)藥殘留檢測方法非常重要。

本次實驗在《中國藥典》的基礎(chǔ)上，針對黃連液質(zhì)檢測中遇到的苯線磷亞砜目標(biāo)峰與干擾峰難分離的問題，有針對性地進(jìn)行系列實驗，建立了黃連中30種農(nóng)藥多殘留同時分析檢測的方法，為黃連中農(nóng)藥殘留快速檢測提供技術(shù)支持。

一、材料和方法

1.儀器和試劑。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號：Triple Quad 3500），SCIEX；電子分析天平（型號：BCE224I-1CCN），賽多利斯；超純水儀（型號：Milli-IQ7000），Milli-Q；精密移液器（型號：Prospenser plus），賽多利斯；氮吹儀（型號：MTN-5800），奧特賽恩斯；旋蒸儀（型號：RV10），IKA；乙腈（色譜純），德國默克；甲酸（色譜純），阿拉?。宦然c（分析純），科密歐；超純水，由超純水儀制得。

2.耗材和對照品。農(nóng)殘混合對照品溶液，Alta；親水親油平衡材料固相萃取HLB-A柱（200mg，6mL），納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司。

3.樣品的提取和凈化。取黃連空白基質(zhì)，粉碎成細(xì)粉（過三號篩），取約5g，精密稱定。加氯化鈉1g，立即搖散，加入預(yù)冷的乙腈50mL，勻漿處理2min，離心，分取上清液。剩余沉淀中加入預(yù)冷的乙腈50mL，勻漿處理1min，離心，合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至約3-5mL，放冷。用乙腈稀釋至10.0mL，搖勻，量取溶液3mL至親水親油平衡材料固相萃取HLB-A柱，收集全部凈化液，混勻，備用。

精密量取空白基質(zhì)溶液1.0mL至氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.6mL，梯度加入混合對照品溶液后加乙腈定容至1.0mL，渦旋混勻。精密加入水0.3mL，混勻，過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液，上機待測。

精密吸取供品溶液各l.0mL，精密加入水0.3mL，混勻，過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液，上機待測。

4.檢測條件。（1）色譜條件。色譜柱：艾杰爾-飛諾美（貨號：00D-4462-AN），十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（10cm×2.1mm，2.6?m）。以0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）為流動相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）（95：5）為流動相B，流速為0.3mL/min，柱溫為40℃，梯度洗脫程序參考《中國藥典》2020年版四部“2341農(nóng)藥殘留量測定法”第五法。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI源）。正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式：每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量、定性離子對，離子化溫度：400℃；離子化電壓：3000V；輔助加熱器：50μL/min；氣簾氣：25μL/min；噴霧氣：55μL/min；碰撞氣：9；CXP：6；EP：10。30種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子對、錐孔電壓、碰撞電壓參考《中國藥典》2020年版四部“2341農(nóng)藥殘留量測定法”第五法附注。

二、結(jié)果與討論

1.色譜條件優(yōu)化。根據(jù)2020版《中國藥典》“2341”第五法中推薦的離子對，苯線磷亞砜離子對分別為：320.1-292.1、320.1-233.0、320.1-171.3，檢測過程中的突出問題是目標(biāo)化合物苯線磷亞砜離子對320.1-292.1、320.1-233.0與其結(jié)構(gòu)相似的干擾峰無法實現(xiàn)有效分離，導(dǎo)致該化合物無法定量檢測。本次實驗通過對色譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)目標(biāo)化合物與干擾物的有效分離。

（1）洗脫梯度優(yōu)化。通過分析目標(biāo)化合物苯線磷亞砜和干擾峰的出峰時間，發(fā)現(xiàn)干擾峰的出峰時間受色譜條件影響較小，因此比較了流動相A：B（75：25）、A：B（80：20）、A：B（85：15）等不同比例下流動相的洗脫效果，目標(biāo)化合物苯線磷亞砜和干擾峰未實現(xiàn)有效分離，且影響其他29種目標(biāo)化合物中部分化合物的出峰。

（2）流速條件優(yōu)化。在液相色譜系統(tǒng)中，流速的變化影響目標(biāo)峰的出峰時間，但不改變出峰順序，因此考察了三種不同流速（0.35、0.30、0.20mL/min）下的出峰情況。通過分析圖譜可知，流速的改變未實現(xiàn)苯線磷亞砜和干擾峰的有效分離。

（3）柱溫條件優(yōu)化。在液相色譜系統(tǒng)中，柱溫的變化也會在一定程度上影響目標(biāo)峰的出峰時間，因此考察了不同梯度柱溫（50、40、30、20℃）下的出峰情況。通過調(diào)整柱溫，對比目標(biāo)峰與干擾峰的出峰情況，確定柱溫為20℃時，目標(biāo)峰與干擾峰出現(xiàn)良好的分離效果，結(jié)果見圖1，其他29種目標(biāo)化合物出峰正常。

2.方法學(xué)研究。（1）線性關(guān)系和專屬性考察。按上述方法制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，對照品溶液添加量分別為10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL（以甲胺磷為例，濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL），上機分析，把空白基質(zhì)圖譜與基質(zhì)對照品混合溶液最低濃度點圖譜對比，確定方法的專屬性；建立各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)r均達(dá)到0.99以上，線性關(guān)系良好（見表1）。

（2）準(zhǔn)確性和靈敏度實驗。在黃連空白基質(zhì)樣品中添加適量標(biāo)樣，分別設(shè)置40%LOQ、100%LOQ、150%LOQ三個水平的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次。40%LOQ中30種農(nóng)藥的平均回收率為66.1%-99.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%-11.2%，方法的靈敏度良好。三個添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均回收率為64.7%-95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.2%-9.5%，方法的準(zhǔn)確性良好（見表1）。

三、結(jié)論

本實驗采用乙腈提取、固相萃取方式二（HLB）凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法柱溫20℃檢測，建立了黃連中30種農(nóng)殘的檢測方法，并對方法的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、靈敏度進(jìn)行考察。在三個添加水平下，回收率和相標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足檢測要求，說明本方法靈敏、可靠，為黃連的農(nóng)藥殘留檢測提供了較為可行的方法。