李廣 張鋒

蛹蟲草菌是冬蟲夏草的近緣種，簡(jiǎn)稱蛹草，不僅含有種類齊全、含量比例適宜的人體必需氨基酸，還含有大量腺苷、蟲草素、腺嘌呤，是食藥兩用的蟲草屬真菌。其中，蟲草素具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗癌等功效，是蛹草中重要的活性成分。不同蛹草菌產(chǎn)蟲草素能力不同，本文采用LiCl、60Co γ復(fù)合誘變，對(duì)1株蛹草菌原始菌株進(jìn)行誘變，考察了LiCl不同質(zhì)量濃度、60Co γ射線不同輻照劑量對(duì)誘變菌株致死率、突變率的影響，并用高效液相色譜法對(duì)篩選出的穩(wěn)定突變體發(fā)酵液中的蟲草素含量進(jìn)行測(cè)定，篩選出高產(chǎn)蟲草素突變體1株，蟲草素含量達(dá)2.64mg/mL，為蛹蟲草菌的進(jìn)一步改良提供了一定的參考依據(jù)。

一、材料與設(shè)備

1.材料與試劑。蛹蟲草菌（CM#1）；甲基纖維素；磷酸鹽緩沖液PBS（pH=7.2）；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品；LiCl；亞甲藍(lán)溶液（0.1%）；甲醇；超濾離心管；96孔深孔板；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基（g/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加23g甲基纖維素制成）。

2.儀器與設(shè)備。液相色譜儀、顯微鏡、電子天平、生化培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、1mL移液槍、超純水機(jī)等。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.孢子懸浮液的制備。取保存蛹蟲草菌的試管進(jìn)行孢子懸浮液的制備。用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS（pH=7.2）洗脫、無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，最后用PBS稀釋至1×106conidia/mL。通過(guò)亞甲藍(lán)染色顯微鏡觀察確定活孢子，光學(xué)顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2. LiCl誘變。配制氯化鋰PBS溶液并高壓滅菌，按照質(zhì)量體積濃度為0.0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%加到孢子懸浮液中混合均勻，轉(zhuǎn)移到盛裝于三角瓶的20mL半固體培養(yǎng)基中，搖勻。在25℃、無(wú)光照條件下靜置培養(yǎng)3d，觀察統(tǒng)計(jì)單菌落并計(jì)算致死率。

隨機(jī)選取出發(fā)菌株及LiCl各誘變條件下的8個(gè)單菌落，無(wú)菌條件下用1mL移液槍轉(zhuǎn)移到96深孔板中的1.6mL液體培養(yǎng)基中，在25℃、無(wú)光照條件下靜置培養(yǎng)10d。將直徑為6mm的無(wú)菌濾紙分別浸潤(rùn)各菌落發(fā)酵液后置于涂布枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）平板上，在30℃、無(wú)光照條件下培養(yǎng)12h進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定突變率。通過(guò)比較各突變體與出發(fā)菌株的抑制直徑篩選突變體，抑制直徑大于出發(fā)菌株抑制直徑20%的為正向突變，以正向突變率為指標(biāo)篩選LiCl最佳質(zhì)量濃度。

致死率/%=（Nb-Na）/ Nb×100；正向突變率Pf/%=Np/Nv×100。Nb、Na分別為誘變前、后菌落數(shù)，Np、Nv分別為正向突變、存活菌落數(shù)。

3.60Co γ射線輻照誘變。以優(yōu)化質(zhì)量濃度的LiCl誘變蛹草孢子懸液6h后，分別以0、5、10、20、40、60、80、100、120、140Gy的60Co γ輻照20min，進(jìn)行致死率實(shí)驗(yàn)；參照LiCl誘變中的方法，以枯草芽孢桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定正向突變率，選擇最佳輻照劑量。以確定的正向突變率為指標(biāo)篩選突變株，分別接種到PDA斜面培養(yǎng)基，于25℃、無(wú)光照條件下連續(xù)6次傳代，每代6d。將1代和6代突變體株接種到含有20mL液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，在無(wú)光照、25℃恒溫條件下靜置培養(yǎng)30d。采用高效液相色譜法，通過(guò)比較相同突變株的1代和6代菌株發(fā)酵液蟲草素含量，篩選獲得5個(gè)穩(wěn)定突變體。

4.蟲草素含量的測(cè)定。篩選出的5個(gè)穩(wěn)定突變體及出發(fā)菌株于避光、25℃恒溫條件下靜置培養(yǎng)30d，發(fā)酵液經(jīng)10000r/min高速離心5min，過(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)HPLC測(cè)定各發(fā)酵液中蟲草素含量。色譜條件如下：色譜柱：Diamonsil C18（4.6μm×250mm，5μm）；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：0 min，85%A→11.5min，20%A→11.6min，20%A→16.1min；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：20?L；檢測(cè)波長(zhǎng)：261nm。

三、結(jié)果與分析

1.LiCl質(zhì)量濃度的選擇。不同質(zhì)量濃度LiCl的誘變結(jié)果見(jiàn)表1。隨著誘變劑LiCl質(zhì)量濃度的增加，蛹草菌的死亡率逐漸增大，當(dāng)濃度為0.30%、0.35%時(shí)致死率達(dá)94%以上，濃度為0.40%時(shí)致死率達(dá)到100%，基本上沒(méi)有菌體存活。當(dāng)LiCl的質(zhì)量濃度為0.20%時(shí)，致死率為76%，正向突變率最大為28%，與文獻(xiàn)所述此時(shí)菌體發(fā)生正向突變的概率最大相符。最終確定LiCl最佳誘變質(zhì)量濃度為0.20%。

2.60Co γ射線輻照劑量的選擇。表2為經(jīng)質(zhì)量濃度0.20%的LiCl誘變，不同劑量60Co γ射線輻照后的致死率和突變率數(shù)據(jù)。由表2數(shù)據(jù)可知，隨著暴露劑量的加大，致死率逐漸增大，正向突變率先增大后降低。當(dāng)輻照劑量為140Gy時(shí)，基本沒(méi)有孢子存活。輻照劑量為80Gy時(shí)，致死率為78%，正向突變率最大為38%，確定最佳輻照劑量為80Gy。

3.液相色譜條件的選擇優(yōu)化。（1）流動(dòng)相洗脫條件的優(yōu)化。因本實(shí)驗(yàn)在研究蛹草中蟲草素含量變化時(shí)還會(huì)涉及腺嘌呤指標(biāo)，雖然參照《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定 高效液相色譜法》（NY/T 2116-2012）能較好地分離檢測(cè)蟲草素，但腺嘌呤卻得不到較好的分離，不能準(zhǔn)確測(cè)定其含量。通過(guò)嘗試更換流動(dòng)相中有機(jī)試劑種類并逐步調(diào)整流動(dòng)相比例，最終確定流動(dòng)相條件為：A水、B甲醇，梯度洗脫，此時(shí)，腺嘌呤和蟲草素均能得到較好的分離，見(jiàn)圖1。

（2）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。對(duì)蟲草素、腺嘌呤進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在209nm、261nm處兩種化合物均有較大吸收，且209nm處的吸收值要大于261nm處吸光值，但考慮到發(fā)酵液基質(zhì)較復(fù)雜，低波長(zhǎng)209nm處很多化合物都會(huì)有吸收，會(huì)對(duì)目標(biāo)物的分離檢測(cè)帶來(lái)干擾，所以選擇261nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.HPLC法復(fù)篩高產(chǎn)蟲草素突變株。將篩選出的5個(gè)穩(wěn)定突變體CMp1-CMp5及原始菌株CM#1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)30d，用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中蟲草素含量，進(jìn)行高產(chǎn)蟲草素突變體篩選，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，原始菌株發(fā)酵液中蟲草素含量為1.26mg/mL，正向突變菌株發(fā)酵液除1個(gè)突變體含量較低（0.624mg/mL）外，其他菌株發(fā)酵液中蟲草素含量均在1.65mg/mL以上，最高達(dá)2.64mg/mL，是原始菌株的2倍多。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以致死率、突變率為指標(biāo)，考察了誘變劑LiCl不同質(zhì)量濃度、60Co γ射線不同輻照劑量對(duì)蛹蟲草菌原始菌株的誘變影響，最終篩選出高產(chǎn)蟲草素突變體1株，發(fā)酵液中的蟲草素含量達(dá)到2.64mg/mL，實(shí)現(xiàn)了蛹草菌株的改良，為后續(xù)選育更高產(chǎn)蟲草素菌株提供了重要技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

基金項(xiàng)目：甘肅省屬科研院所創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（21JR7RA765）。

作者簡(jiǎn)介：李廣（1981-），男，漢族，山東肥城人，助理研究員，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?、生物次生代謝產(chǎn)物。

*通信作者：張鋒（1981-），男，漢族，高級(jí)工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>