劉芳，張清玫，王慧琳，易偉,4，彭志云,2,3，鄭佳,2,3

1.宜賓五糧液股份有限公司（宜賓 644000）；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜賓 644000）；3.中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜賓 644000）；4.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（沈陽(yáng) 110866）

中國(guó)傳統(tǒng)濃香型白酒是以谷物為原材料，大曲為發(fā)酵劑，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、儲(chǔ)存、勾兌而成的蒸餾酒[1]。原料是濃香型白酒釀造的物質(zhì)基礎(chǔ)：一方面生產(chǎn)中采用混蒸混燒的工藝，將蒸餾過(guò)程原料揮發(fā)的香氣物質(zhì)帶入酒體；另一方面在發(fā)酵過(guò)程中，原料又為微生物的生長(zhǎng)代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。白酒釀酒原料品種眾多，常見(jiàn)主要有高粱、玉米、小麥、糯米和大米，在釀酒界素有“高粱產(chǎn)酒香，玉米產(chǎn)酒甜，小麥產(chǎn)酒糙，糯米產(chǎn)酒綿，大米產(chǎn)酒凈”之說(shuō)，不同原料因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量不同，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也各異。

對(duì)釀酒原料的研究主要集中于原料理化性質(zhì)[3-5]及蒸煮過(guò)程中產(chǎn)生的游離態(tài)風(fēng)味物質(zhì)[6-9]。呂佳慧[2]研究結(jié)果表明，釀酒原料中豐富的結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程經(jīng)由微生物及酶的作用，轉(zhuǎn)化為游離態(tài)風(fēng)味物質(zhì)是原酒風(fēng)味的重要組分，其含量約為原料中游離態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的2～8倍，由此可見(jiàn)釀酒原料對(duì)白酒風(fēng)味具有重要影響。江偉等[10]采用GC-O-MS技術(shù)對(duì)5種單一原料釀造白酒的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，并結(jié)合感官感官評(píng)價(jià)分析，結(jié)果表明，5種單一糧食釀造白酒中，高粱酒香氣成分及香氣活性物質(zhì)為單一糧食中最多，通過(guò)感官評(píng)價(jià)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高粱酒以酯香為主、整體協(xié)調(diào)，其風(fēng)味在單一糧食中占優(yōu)勢(shì)地位，為單一糧食中最適合的釀酒原料。陸其剛等[11]選擇5種常用釀酒原料，進(jìn)行固液態(tài)發(fā)酵模擬試驗(yàn)與代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果顯示，單一釀酒原料發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)各具特色，同一種糧食采用不同的發(fā)酵方式其代謝產(chǎn)物也存在較大差異；但單糧發(fā)酵存在一定局限性，產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類較單一。Han等[12]比較5種單糧釀造白酒的風(fēng)味質(zhì)量及風(fēng)味物質(zhì)含量，結(jié)果顯示，高粱酒風(fēng)味最佳，小麥酒次之；大米酒酯類物質(zhì)含量低，醛類和醇類物質(zhì)含量較高；進(jìn)一步研究不同單寧含量的高粱酒，發(fā)現(xiàn)單寧含量與酯類物質(zhì)含量密切相關(guān)。

為探究單糧及多糧發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)特性，以5種單一原料及其混合原料為研究對(duì)象，以糖化酶及釀酒酵母為糖化發(fā)酵劑，探究單糧及多糧在單一發(fā)酵劑的固態(tài)發(fā)酵體系中的風(fēng)味物質(zhì)特性，為釀酒原料的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、大米、糯米、小麥、玉米、五糧粉（均來(lái)自生產(chǎn)車間）。

糖化酶（50 000 U/g，金源生物化工有限公司）；安琪酵母（安琪酵母股份有限公司）；同位素標(biāo)品ethyl hexanoate-d11、acetic acid-d4、benzaldehyde-d6、2-phenylethyl acetate-d3、benzyl-d7 alcohol、phenol-2,4,6-d3（加拿大C/D/N公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

刀式研磨儀（GM300，德國(guó)Retsch公司）；氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890B-5977B，美國(guó)Agilent公司）；DB-WAXETR色譜柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）；Lichrolut EN（200 mg/3 mL）萃取固相小柱（德國(guó)Merck公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

分別稱取5種單糧各1 000 g，粉碎后過(guò)篩，選擇粒徑3～4 mm的用于后續(xù)試驗(yàn)；五糧粉為已粉碎的車間生產(chǎn)用糧。分別稱取500 g粉碎后的原料，加350 mL熱水（約65 ℃），攪拌均勻后堆積潤(rùn)糧1 h。原料采用清蒸，待蒸鍋上汽后蒸糧35 min。蒸熟后加入350 mL開(kāi)水，攪拌均勻后攤量至28 ℃。

1.3.2 接種培養(yǎng)

冷卻后的糧食按以下方法進(jìn)行處理：加入相當(dāng)于原料干重0.2%的干酵母（使用前需經(jīng)2%糖水活化活化30 min）及4 g糖化酶，攪拌均勻后裝入1 000 mL密封發(fā)酵罐中，于35 ℃發(fā)酵30 d。

1.3.3 固相萃取

稱取10 g樣品，加入20 mL 10%乙醇水溶液，和50 μL 1 000 mg/kg混合同位素內(nèi)標(biāo)，渦旋3 min，按10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜。取10 mL上述濾液上0.5 g Lichrolut EN小柱，用6 mL二氯甲烷洗脫，加入2 g無(wú)水硫酸鈉去除殘余水分，將液體轉(zhuǎn)入干凈的瓶中氮吹至500 μL上機(jī)。

1.3.4 GC-MS條件

1.3.4.1 GC條件

載氣為高純度氦氣，流速1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。

1.3.4.2 MS條件

全掃描模式；EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍30～350 amu。

1.3.5 定性和定量

1.3.5.1 風(fēng)味物質(zhì)性方法

發(fā)酵糧食香氣成分定性通過(guò)與NIST 14質(zhì)譜中標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比匹配，保留指數(shù)根據(jù)Kovats法[13]計(jì)算后與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)后確認(rèn)。

1.3.5.2 風(fēng)味物質(zhì)定量方法

定量采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，參考內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，以待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比計(jì)算待測(cè)成分的半定量信息，單位以mg/kg表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒原料發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)分析

對(duì)發(fā)酵后釀酒原料進(jìn)行定量分析，風(fēng)味物質(zhì)主要包括酯類（16種）、酸類（7種）、酚類（6種）、芳香族（5種）、呋喃類（5種）、醇類（5種）、其他類（8種），釀酒原料風(fēng)味物質(zhì)組成見(jiàn)圖1。高粱、大米、糯米、小麥、玉米及混合五糧發(fā)酵后鑒定到風(fēng)味物質(zhì)分別為52，50，45，51，51和51種，表1展示各香氣成分含量。

圖1 釀酒原料發(fā)酵香氣成分含量

酯類物質(zhì)為白酒中重要的呈香物質(zhì)，5種單糧及混合五糧中，小麥及五糧酯類物質(zhì)總含量最高。琥珀酸單乙酯為含量最高的酯類物質(zhì)，在五糧及小麥中含量較高、高粱及大米次之、糯米中含量最低。四大酯中乳酸乙酯含量最高，在5種單糧及混合五糧中其含量具有顯著差異：五糧及小麥中最高，大米次之，高粱及玉米中相對(duì)較低，糯米中含量極低。乙酸乙酯含量主要表現(xiàn)為五糧較高，其余糧食含量較相近。酯類物質(zhì)總含量及四大酯含量均表現(xiàn)為五糧＞小麥＞大米＞高粱＞玉米＞糯米。

芳香族物質(zhì)是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，具有香味突出、閾值低的特點(diǎn)。白酒中芳香族物質(zhì)主要來(lái)源于微生物發(fā)酵代謝原料中的單寧、蛋白質(zhì)等[14]。發(fā)酵糧食中芳香族物質(zhì)總含量最高，約為總物質(zhì)含量的70%～90%，其含量在高粱和玉米中尤為突出。含量最高的芳香族化合物分別為苯甲醇、苯乙醇及苯甲醛。苯乙醇具有玫瑰花香氣，在高粱含量最高、玉米次之，糯米中最少。苯甲醇具有花果香味，在玉米中含量最高；苯甲醛具有杏仁香、堅(jiān)果香，其含量在蒸煮糧食中較高[15-16]，在5種單糧及混合五糧中含量無(wú)明顯差異。

醇類物質(zhì)在白酒中具有烘托香味的作用，同時(shí)還是合成酯類物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)，其主要來(lái)源于酵母菌代謝糖類和氨基酸[17]。發(fā)酵糧食中檢出的5種醇類物質(zhì)，均為高級(jí)醇，現(xiàn)有研究表明，過(guò)量的高級(jí)醇不僅使白酒呈苦澀味影響口感[18]，對(duì)人體也有一定毒害作用，高級(jí)醇較乙醇化學(xué)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，在人體內(nèi)代謝也更緩慢，過(guò)量累積會(huì)對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻醉和毒害并導(dǎo)致肝損傷[19-20]。發(fā)酵糧食中高粱與玉米異丁醇及異戊醇含量相對(duì)較高，其中作為單糧釀造白酒常用原料的高粱，異戊醇及異丁醇含量約為五糧的4倍。

酸類物質(zhì)為白酒中重要的香氣成分，其酸味隨碳鏈的增加而減弱，在發(fā)酵單糧及混合五糧中含量均較低。己酸是含量最高酸類物質(zhì)，具有典型的汗臭味，是濃香型白酒主體香味己酸乙酯的前體物質(zhì)。糯米己酸含量尤為突出，其余糧食無(wú)明顯差異。異戊酸與異丁酸含量?jī)H次于己酸，其含量表現(xiàn)為玉米含量最高、高粱大米次之，五糧與糯米含量最低；丁酸、苯丙二酸、戊酸及丙酸含量較低，其中小麥丁酸及丙酸含量相對(duì)較高、玉米中苯丙二酸相對(duì)含量較高，大米中戊酸含量相對(duì)較高?？v向比較發(fā)酵糧食，高粱及五糧酸類物質(zhì)相對(duì)含量較均衡，無(wú)含量突出的酸。

白酒中的酚類物質(zhì)主要來(lái)源于釀酒原料中單寧、木質(zhì)素的降解[21]。酚類物質(zhì)能夠賦予白酒特殊的香氣：愈創(chuàng)木酚具有水果香、花香，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有水果香、香瓜味，香草醛具有奶油香、甜香味，苯酚具有墨汁香氣[22]。在5種單糧及混合五糧中，高粱與玉米酚類物質(zhì)總量最高，苯酚為發(fā)酵糧食中含量最高的酚類物質(zhì)，在高粱中含量最高，五糧次之。發(fā)酵糧食中玉米愈創(chuàng)木酚含量最高、高粱次之；4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在發(fā)酵糧食中含量表現(xiàn)為糯米＞大米＞小麥＞玉米，在五糧中未檢出。玉米中香草醛含量最高，小麥次之、大米及糯米中含量最低。

呋喃類物質(zhì)主要表現(xiàn)為焦香、堅(jiān)果香、烤杏仁香味[23]。發(fā)酵糧食中的呋喃類化合物主要為糠醛及2,3-二羥基苯并呋喃。小麥中糠醛含量較高、其余糧食中含量極低。2,3-二羥基苯并呋喃為玉米中特有的呋喃類物質(zhì)，在其余發(fā)酵糧食中含量極低。

發(fā)酵糧食中共檢出其他類化合物8種，2-甲基四氫噻吩及3-甲硫基丙醇為硫化物。硫化物是一類含量十分少、閾值極低的化合物，該類化合物大多具有卷心菜、腐敗的大白菜、腐敗的韭菜、生洋蔥或炒熟的洋蔥的氣味[24]。2-甲基四氫噻吩在較低濃度時(shí)具有烘焙香氣，其在玉米及高粱中含量較高，其余發(fā)酵糧食中含量較低且無(wú)明顯差異；3-甲硫基丙醇低濃度下具有咖啡香味，其在玉米中含量最高。內(nèi)酯具有椰香味[25]，閾值低，是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵糧食中檢出2種內(nèi)酯，分別為泛酰內(nèi)酯及丁內(nèi)酯。泛酰內(nèi)酯在小麥中含量最高，丁內(nèi)酯在玉米中含量最高。乙偶姻為白酒中關(guān)鍵化合物四甲基吡嗪的前體物質(zhì)，主要來(lái)源于釀酒原料蒸煮過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)，其含量在糯米中最高，在高粱中最低。

2.2 釀酒原料關(guān)鍵香氣成分相關(guān)性分析

為更直觀描述發(fā)酵糧食中風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，使用Rcorrplot包計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)并繪圖，樣本間相關(guān)性系數(shù)由-1～1表示，值約接近1則表明其相關(guān)性越強(qiáng)。由圖2可知，高粱與玉米相似度最高，相關(guān)系數(shù)0.91，結(jié)合表1各類風(fēng)味物質(zhì)含量可知，高粱與玉米發(fā)酵體系中芳香族、醇類及呋喃類物質(zhì)含量較高，酯類化合物含量較低；小麥與五糧相關(guān)性較強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.86，小麥與五糧芳香族化合總量相近、酯類化合物含量較高，醇類物質(zhì)含量相對(duì)較低；糯米因其風(fēng)味物質(zhì)總量低與其他幾種釀酒原料差異相對(duì)較大。

圖2 發(fā)酵糧食相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

以高粱、大米、糯米、小麥、玉米，及混合五糧為原料，糖化酶、釀酒酵母為發(fā)酵劑進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同原料發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)存在明顯差異，且與傳統(tǒng)關(guān)于釀酒原料特性一致。基于香氣成分含量對(duì)發(fā)酵糧食的分析結(jié)果表明，高粱因其原料特性，發(fā)酵產(chǎn)生的芳香族物質(zhì)、酚類物質(zhì)含量相對(duì)較高，因此有“高粱產(chǎn)酒香的”說(shuō)法，大米發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分含量較低但較均衡，與“大米產(chǎn)酒凈”相符。糯米發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分種類及含量均為5種單糧中最低，芳香族化合物含量相對(duì)其他組分較高，符合“糯米產(chǎn)酒綿”的說(shuō)法。小麥風(fēng)味物質(zhì)組成與五糧最為相似，具有酯類物質(zhì)含量高的特點(diǎn)。玉米發(fā)酵產(chǎn)生的醇類物質(zhì)含量較高，物質(zhì)間缺乏協(xié)調(diào)感，該結(jié)果與江偉等[10]的研究結(jié)果一致。混合五糧發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分含量較均衡，且酯類物質(zhì)含量最高，而濃香型白酒主要以己酸乙酯為主體香，采用五糧作為濃香型白酒釀酒原料能更好的突出其香型特點(diǎn)。與單糧發(fā)酵相比，五糧發(fā)酵產(chǎn)生的高級(jí)醇含量最低，酯類物質(zhì)更多，香氣成分含量較均衡，為最適宜的釀酒原料。