懷欲曉，李文璇，邢佳琦，唐百川，盧曉明,2

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院（泰安 271018）；2.山東省高等學(xué)校食品營養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（泰安 271018）

黑蒜是大蒜經(jīng)高溫、高濕處理一定時(shí)間后得到的產(chǎn)品，具有獨(dú)特的口感，無辛辣刺激味道，口感軟糯酸甜，深受人們喜歡[1]。與新鮮大蒜相比，發(fā)酵后的黑蒜多酚、多糖含量及抗氧化能力均較高[2]，富含沒食子酸、p-香豆酸、槲皮素、兒茶素及表兒茶素等多酚類化合物[3]，具有較高的鐵離子還原能力、清除DPPH·、ABTS+、OH和超氧陰離子自由基的抗氧化活性[4-5]，以及抗炎、抗癌及預(yù)防肥胖等多種生理活性[6]，已經(jīng)成為公認(rèn)的天然保健食品，開發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊[7-13]。

黑桑葚又稱為桑棗、桑果、桑椹，色澤誘人，酸甜多汁，風(fēng)味較獨(dú)特[14]。桑葚中除了含有機(jī)酸、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)外[15-16]，還富含酚類和花色苷等多種功能成分[17]。研究表明，桑葚能有效地清除自由基[18]，具有抗腫瘤[19]、降血糖[20]、降血脂[21]等多種功能。目前，桑葚因其良好的口感、豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和對人體的健康功效使得其精深加工產(chǎn)品的市場需求量激增，備受關(guān)注。

此研究以黑蒜和桑葚為原料，羧甲基纖維素鈉為穩(wěn)定劑，通過添加一定量的赤蘚糖醇、薄荷醇和檸檬酸進(jìn)行調(diào)味制得黑蒜桑葚復(fù)合口服液，并與抗壞血酸進(jìn)行對比，以DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除能力等指標(biāo)評價(jià)其抗氧化活性[22-23]，以期為黑蒜桑葚復(fù)合口服液的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

獨(dú)頭黑蒜（濟(jì)南康澤生物科技有限公司）；桑葚（泰安農(nóng)貿(mào)市場）。

1.2 試劑

沒食子酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；福林酚（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（分析純，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、無水乙醇、碳酸鈉、H2O2溶液（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；抗壞血酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑材料科技有限公司）；赤蘚糖醇、薄荷醇、檸檬酸（食品級，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司）；羧甲基纖維素鈉（食品級，億鑫生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FSJ-A03D1粉碎機(jī)（小熊電器股份有限公司）；CN-LPC6002電子秤（昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司）；Lambda 365紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；pH計(jì)（奧豪斯儀器有限公司）；PAL-1糖度計(jì)（ATAGO）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黑蒜桑葚復(fù)合口服液的制備

流程圖如圖1所示。

圖1 黑蒜桑葚復(fù)合口服液流程圖

1.4.2 原料處理

黑蒜汁制備：黑蒜去皮清洗，按照1∶6（g/mL）的比例與水混合破碎，在60 ℃水浴浸提20 min，冷卻后過濾，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液。

桑葚汁制備：桑葚用5%的食鹽溶液浸泡清洗5 min，按照1∶3（g/mL）的比例與水混合進(jìn)行榨汁并過濾，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液。

1.4.3 復(fù)合口服液工藝條件的確定

1.4.3.1 單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定黑蒜汁與桑葚汁比例3∶5、羧甲基纖維素鈉添加量0.60%。以預(yù)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，優(yōu)化赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量和檸檬酸添加量的最佳配比。

因素設(shè)計(jì)：赤蘚糖醇添加量分別為1.00%，1.50%，2.00%，2.50%和3.00%；薄荷醇添加量分別為0.25%，0.50%，0.75%，1.00%和1.25%；檸檬酸添加量分別為0.40%，0.50%，0.60%，0.70%和0.80%?？疾煲陨?個(gè)因素對桑葚黑蒜復(fù)合口服液工藝的影響，并結(jié)合感官評分確定單因素的最佳條件。

1.4.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Design-Expert軟件，以模糊感官評分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，得到復(fù)合口服液的最優(yōu)工藝條件。因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 單位：%

1.4.4 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

黑蒜桑葚復(fù)合口服液的評價(jià)采用感官綜合評分法，參照GB 7101—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》[24]進(jìn)行評價(jià)，制定出評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。由10同學(xué)組成感官品評小組，主要對復(fù)合口服液的組織狀態(tài)、滋味、氣味和口感4個(gè)方面進(jìn)行評定。評定每一個(gè)樣品后，清水漱口評定下一個(gè)樣品。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 黑蒜桑葚復(fù)合口服液感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.5 模糊數(shù)學(xué)評價(jià)模型的建立

1.4.5.1 因素集的建立

以組織狀態(tài)、滋味、氣味和口感組成評價(jià)因素集，即U={組織狀態(tài)，滋味，氣味，口感}。

1.4.5.2 評語集的建立

以優(yōu)（V1）、良（V2）、中（V3）、差（V4）組成每個(gè)因素的評語集，即V={優(yōu)，良，中，差}。

1.4.5.3 評價(jià)權(quán)重集的確定

將評價(jià)因素組織狀態(tài)、滋味、氣味和口感分別賦予權(quán)重系數(shù)0.20，0.25，0.25和0.30，即W={0.20，0.25，0.25，0.30}。

1.4.5.4 模糊關(guān)系綜合評判集的確定

參考李夢倩等[25]方法，采用模糊數(shù)學(xué)評價(jià)法對黑蒜桑葚復(fù)合口服液感官綜合評價(jià)進(jìn)行評定。對10名感官評價(jià)人員模糊數(shù)學(xué)評價(jià)各因素投票數(shù)統(tǒng)計(jì)，每組樣品的評價(jià)結(jié)果L=（權(quán)重矩陣M×模糊矩陣T），得到模糊評價(jià)矩陣T1～T17。分別賦予優(yōu)、良、中、差分值為90，80，70和60分，將L中的各個(gè)量分別與相應(yīng)分值相乘再相加即可得感官評分。

1.4.6 理化指標(biāo)的測定

1.4.6.1 pH測定

采用pH計(jì)測定pH。

1.4.6.2 可溶性固形物含量測定

采用糖度計(jì)測定可溶性固形物含量。

1.4.6.3 總酚含量測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[26-27]測定。以含量（μg）對吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=0.028 7x+0.020 5，線性關(guān)系R2=0.999 2，線性范圍10～60 μg。結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位μg GAE/mL。

1.4.7 抗氧化活性研究

1.4.7.1 DPPH自由基清除率的測定

取2 mL復(fù)合口服液于10 mL離心管中，與2 mL DPPH溶液混勻，避光放置30 min后，以乙醇為空白對照，于波長517 nm下測定吸光度A1；同時(shí)測定2 mL復(fù)合口服液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度A2，及2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A0；以VC作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為波長517 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A2為2 mL復(fù)合口服液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度，L/（g·cm）；A0為2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.2 羥自由基清除率的測定

加入1 mL FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液于10 mL離心管中混勻，依次加入1 mL乙醇-水楊酸溶、1 mL復(fù)合口服液及1 mL去離子水，混勻后于37 ℃水浴避光放置15 min后，于波長510 nm處測定吸光度A1。同樣方法測定以1 mL去離子水代替H2O2溶液的吸光度A2，及以1 mL去離子水代替待測液的吸光度A0。其中，A0以不加H2O2體系為參比，A1和A2以純水為參比，VC作為陽性對照。按式（2）計(jì)算羥自由基清除率[28-29]。

式中：A1為波長510 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A2為以1 mL去離子水代替H2O2溶液的吸光度，L/（g·cm）；A0為以1 mL去離子水代替待測液的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.3 ABTS+自由基清除率的測定

取4.8 mL ABTS+自由基稀釋液，加入0.2 mL復(fù)合口服液并混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，以無水乙醇為參比，于波長734 nm處測定吸光度A1。以0.2 mL無水乙醇代替待測液作空白對照，測定吸光度A0，VC陽性對照。ABTS+清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A1為波長734 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A0為0.2 mL無水乙醇代替待測液作空白對照測定的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)平行測定3次，采用Design-Expert 11.0和IBM SPSS 27處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，0rigin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 赤蘚糖醇添加量的確定

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇添加量為1.00%～2.00%時(shí)，感官評分逐漸升高，高于2.00%時(shí)感官評分呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)赤蘚糖醇添加量＜2.00%時(shí)，口服液甜度不足，添加量＞2.00%時(shí)口服液過于甜膩，掩蓋了其本身原材料的滋味。在赤蘚糖醇添加量為2.00%時(shí)，感官評分最高，甜度適口，風(fēng)味獨(dú)特，因此赤蘚糖醇添加量選擇2.00%。

圖2 赤蘚糖醇添加量對口服液的感官評分的影響

2.1.2 薄荷醇添加量的確定

從圖3可以看出，薄荷醇添加量為0.10%～0.15%時(shí)，感官評分逐漸上升，0.15%以上感官評分逐漸降低。當(dāng)薄荷醇添加量＜0.15%時(shí)，感官評分稍低，添加量＞0.15%時(shí)具有較強(qiáng)的薄荷清涼感，產(chǎn)生苦澀味，掩蓋了桑葚黑蒜原有的風(fēng)味，因此薄荷醇添加量選擇0.15%。

圖3 薄荷醇添加量對感官評分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量的確定

從圖4可以看出，隨著檸檬酸添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢。當(dāng)添加量為0.60%時(shí)，感官評分最高。當(dāng)檸檬酸添加量＜0.60%時(shí)，飲料酸味不足，不夠爽口；添加量＞0.60%酸味過重。因此檸檬酸添加量選擇0.60%。

圖4 檸檬酸添加量對感官評分的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及方差分析

選擇赤蘚糖醇添加量（A）、薄荷醇添加量（B）和檸檬酸添加量（C）為自變量，感官評價(jià)（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，方差分析結(jié)果如表4所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 回歸系數(shù)方差分析結(jié)果

利用Design-Expert 11.0軟件對表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：感官評分=88.83+0.273 7A+2.05B-2.92C-0.462 5AB-0.350 0AC+0.662 5BC-2.50A2-3.66B2-4.582C2。

由表4可知，感官評分模型F值=264.76，P＜0.000 1，表明該試驗(yàn)所用數(shù)學(xué)模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)為0.247 2（P＞0.05），為不顯著，表明模型的預(yù)測結(jié)果良好，預(yù)測值與實(shí)際值接近，可用于預(yù)測黑蒜桑葚復(fù)合口服液的最佳配方?；貧w方程的預(yù)測值之間的相關(guān)系數(shù)模型的R2=0.997 1，Radj2=0.993 3，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用模型進(jìn)行相關(guān)解釋，方程的可靠性較高。變異系數(shù)（C.V.）為0.994 9%，較小，方程模型具有良好的擬合性。一次項(xiàng)B、C及二次項(xiàng)A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），根據(jù)F值可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的先后順序?yàn)锽＞C＞A，即薄荷醇添加量＞檸檬酸添加量＞赤蘚糖醇添加量。

2.2.2 各因素的交互作用分析

響應(yīng)面反映了各因素之間交互作用的強(qiáng)弱，響應(yīng)面傾斜度越高，表明各因素之間的交互作用越顯著[30]。從圖5可以看出，赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量、檸檬酸添加量的交互作用對復(fù)合口服液感官評分影響的響應(yīng)面坡度均相對陡峭，表明赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量、檸檬酸添加量之間的交互作用對感官評分均有影響，且薄荷醇添加量和檸檬酸添加量的交互作用坡度傾斜度較高，交互作用較大。響應(yīng)面圖中的最高點(diǎn)存在響應(yīng)值極值，表明黑蒜桑葚復(fù)合口服液的感官評分具有極大值。

圖5 兩因素交互作用對黑蒜桑葚復(fù)合口服液感官評分影響的響應(yīng)面

為進(jìn)一步確定最佳工藝條件，結(jié)合各因素間交互作用對感官評分的影響并以最高感官評分為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)Design-Expert 11.0軟件運(yùn)行結(jié)果，得到最佳工藝條件：赤蘚糖醇添加量1.98%，薄荷醇添加量0.14%，檸檬酸添加量0.61%，在此條件下模型預(yù)測感官評分為88.85分。

2.3 黑蒜桑葚復(fù)合口服液最佳配方驗(yàn)證

為了便于操作，在黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5、羧甲基纖維素鈉添加量0.60%的條件下，選擇赤蘚糖醇添加量2.00%、薄荷醇添加量0.15%、檸檬酸添加量0.60%進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，平均感官評分為88.24±0.35，與模型預(yù)測結(jié)果88.85接近，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，具有一定可行性。

2.4 理化指標(biāo)測定結(jié)果

測定最佳工藝條件下獲得的黑蒜桑葚復(fù)合口服液的理化指標(biāo)，結(jié)果顯示可溶性固形物含量10.00%，pH 3.12，總酚含量17.83 μg GAE/mL。

2.5 抗氧化活性研究與分析

如表5所示，與抗壞血酸相比，復(fù)合口服液DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、ATBS+自由基清除率略低，分別為90.05%，57.14%和87.64%，表明該口服液具有一定的抗氧化效果。

表5 黑蒜桑葚復(fù)合口服液抗氧化活性成分和自由基清除能力檢測結(jié)果 單位：%

3 結(jié)論

此試驗(yàn)以黑蒜和桑葚為主要原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用模糊數(shù)學(xué)綜合評價(jià)法結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化法獲得黑蒜桑葚復(fù)合口服液的最佳工藝條件。最佳工藝條件為黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5，羧甲基纖維素鈉添加量0.60%，赤蘚糖醇添加量2.00%，薄荷醇添加量0.15%，檸檬酸添加量為0.60%。在最佳工藝條件下，感官評分為88.24分，產(chǎn)品pH為3.12，可溶性固形物含量為10.00%，總酚含量為17.83 μg GAE/mL，DPPH自由基清除率為90.05%，羥自由基清除率為57.14%，ATBS+自由基清除率為87.64%。黑蒜桑葚復(fù)合口服液色澤均勻，呈深紫紅色，澄清透明，無分層現(xiàn)象，酸甜爽口，具有獨(dú)特的黑蒜和桑葚風(fēng)味和較高的抗氧化活性。此研究為黑蒜和桑葚多元化產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。