傅俊杰 ，李世琪，董樂 ，林曉思 ，黃兆斌，王芳

1.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（泉州 362000）；2.泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院（泉州 362000）

靈菌紅素（prodiginines，PGs）家族是一類由三吡咯結(jié)構(gòu)組成的微生物生物堿類天然紅色色素[1]。PGs家族中的靈菌紅素（prodigiosin，PG）于粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）中首次被發(fā)現(xiàn)[2]，并從該菌中分離出PG純品[1]。目前，PGs已被發(fā)現(xiàn)存在于沙雷氏菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）等多種微生物中[3-12]。據(jù)報(bào)道，已鑒定結(jié)構(gòu)的PGs包括PG、十一烷基靈菌紅素、庚基靈菌紅素（heptylprodigiosin，hPG）、間環(huán)靈菌紅素、鏈玉紅菌素B、靈菌紅素R1、壬基靈菌紅素、甲基環(huán)庚基靈菌紅素、類靈菌紅素以及鹽酸環(huán)狀靈菌紅素等[13]。此實(shí)驗(yàn)室從紅色鄰米草菌（Spartinivicinus ruber）菌株S2-4-1HT中分離鑒定獲得六氫環(huán)庚基靈菌紅素（six hydrogen cycloheptane prodigiosin，ShcPG）和hPG[10]，兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1[14]。研究表明，PGs具有抗腫瘤[15]、抗炎癥細(xì)胞因子[16]和抗細(xì)菌[17]等生物活性。非常重要的是，PGs對正常細(xì)胞系具有低毒性或無毒性[17]。在PGs的研究與開發(fā)上，PG相對較為深入。PG已被用于各種癌癥的實(shí)驗(yàn)藥物，且用其作為先導(dǎo)物合成的靈菌紅素衍生物（GX15-070或簡稱obatoclax）被用于治療晚期慢性淋巴細(xì)胞白血病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，并被證明具有良好的安全性[18]。PGs在臨床藥物開發(fā)、環(huán)境處理、食品添加劑制備等方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，在全球市場上占有越來越重要的地位[19]。

圖1 紅色鄰米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT中分離鑒定獲得的兩種靈菌紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)[14]

微生物生產(chǎn)具有環(huán)境友好、條件溫和、成本低、易于工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，因此，PGs的微生物生產(chǎn)被認(rèn)為是其制備的發(fā)展方向[19]。高水平的微生物發(fā)酵色素產(chǎn)品依賴于優(yōu)良的微生物菌株和有效的發(fā)酵方法。發(fā)酵生產(chǎn)取決于培養(yǎng)基組成、生產(chǎn)條件、發(fā)酵方法和微生物菌株等許多因素[20]，響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是同時(shí)考慮幾個(gè)因素變化時(shí)優(yōu)化工藝參數(shù)的最常用的統(tǒng)計(jì)工具。RSM不僅提供了關(guān)于直接效應(yīng)、成對組合交互效應(yīng)和變量參數(shù)的曲線變量效應(yīng)的全面知識[21]，而且省時(shí)省力。

此實(shí)驗(yàn)室從紅色鄰米草菌菌株S2-4-1HT中分離鑒定了hPG和ShcPG（以下稱hPG+ShcPG），其中ShcPG為首次發(fā)現(xiàn)，ShcPG的含量占hPG+ShcPG總含量的70%以上，并且ShcPG對腫瘤細(xì)胞A549的半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）值為0.226 1±0.026 1 μmol/L，其抑制效果為PG的25倍、順鉑的42倍[10]。因此，ShcPG具有極高的研究價(jià)值和抗腫瘤新藥開發(fā)潛力。目前，如何優(yōu)化微生物發(fā)酵條件、提高PGs產(chǎn)率依然是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)[22]。ShcPG的研究重點(diǎn)在于如何優(yōu)化S.ruber菌株S2-4-1HT通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)ShcPG的工藝，以提高ShcPG的產(chǎn)率。此研究在前期采用RSM試驗(yàn)對菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過單因素試驗(yàn)對菌株S2-4-1HT發(fā)酵條件進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上分別通過RSM試驗(yàn)對菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到穩(wěn)定可靠的菌株S2-4-1HT搖瓶發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的發(fā)酵工藝參數(shù)數(shù)據(jù)，旨在為ShcPG的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色鄰米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT，此實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中心（保藏編號：MCCC 1K03745T=KCTC 72148T），已完成對該菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定。

PG（分子量：350 g/mol）、ShcPG（分子量：352 g/mol）：純度均達(dá)98%以上，實(shí)驗(yàn)室純化制備，華僑大學(xué)分析測試中心核磁鑒定；金龍魚純正花生油：嘉里糧油（青島）有限公司；海生菌肉湯2216（Marine Broth 2216，MB）和瓊脂粉：生物級，美國Becton，Dickinson and Company公司；酵母粉胰蛋白胨（生物級，美國OXOID公司）；其他試劑（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將此實(shí)驗(yàn)室保存的菌株解凍后劃線接種于MB的固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取生長狀態(tài)好的紅色單菌落于MB的液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)液呈紅色后于4 ℃冷藏，備用。MB液體培養(yǎng)基的配制：在1 000 mL去離子水中加入37.4 g MB粉；MB固體培養(yǎng)基的配制：在每升MB液體培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂粉。

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

在前期發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方（花生油、蛋白胨、無水氯化鈣、六水合氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基礎(chǔ)上，主要考察溫度、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基總鹽度、培養(yǎng)時(shí)間對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響。因素水平見表1。

表1 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)因素水平表

1.2.2.2 發(fā)酵條件的RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取溫度、pH和總鹽度作為自變量，以S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵液中hPG+ShcPG質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的RSM試驗(yàn)，優(yōu)化搖瓶發(fā)酵hPG+ShcPG的培養(yǎng)條件。試驗(yàn)因素和水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平表

1.3 發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以hPG+ShcPG純品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以其無水乙醇溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，于535 nm波長處的吸光度（A535）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.123 4x+0.012 5（R2=0.999 1），表明hPG+ShcPG純品質(zhì)量濃度在0.547 0～7.020 0 mg/L時(shí)，A535和hPG+ShcPG的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.2 發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的測定

發(fā)酵完成后，將S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵液和乙酸乙酯按照1∶1體積混合，充分超聲破碎菌體細(xì)胞，靜置后取8 mL上清液于10 000 r/min離心5 min。將離心后上清液全部移至另一離心管中，待乙酸乙酯揮發(fā)完全即獲得hPG+ShcPG產(chǎn)物。用無水乙醇溶解hPG+ShcPG產(chǎn)物并全部轉(zhuǎn)移到10 mL比色管中，定容至5 mL。定容后的溶液于10 000 r/min離心5 min，移取上清液，采用比色法測定溶液中的hPG+ShcPG產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)均為3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Design-Expert 8.0.6軟件對發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)、方差分析及二次方差分析，繪制相應(yīng)的等高線圖和響應(yīng)曲面圖，采用Microsoft Office 2019進(jìn)行基本的圖表制作、繪制單因素試驗(yàn)相關(guān)曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)溫度對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖2。當(dāng)溫度為22～31 ℃時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢。當(dāng)溫度大于31 ℃時(shí)，hPG+ShcPG的產(chǎn)量急劇下降，并且當(dāng)溫度為31 ℃時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時(shí)，發(fā)酵溫度適合選擇在28～34 ℃。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.1.2 培養(yǎng)基pH對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基pH對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖3。當(dāng)pH為6.0～7.0時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢。當(dāng)pH大于7.0時(shí)，hPG+ShcPG的產(chǎn)量急劇下降，并且當(dāng)pH為7.0時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基pH適合選擇在6.0～8.0。

圖3 不同pH培養(yǎng)基hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.1.3 培養(yǎng)基總鹽度對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基總鹽度對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖4。當(dāng)總鹽度為1.0～2.5%時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢。當(dāng)總鹽度大于3.0%時(shí)，hPG+ShcPG的產(chǎn)量急劇下降，并且當(dāng)總鹽度為2.5%時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基總鹽度適合選擇在2.0%～3.0%。

圖4 不同總鹽度培養(yǎng)基hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)時(shí)間對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖5。當(dāng)時(shí)間為36～48 h時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢。當(dāng)時(shí)間大于48 h時(shí)，hPG+ShcPG的產(chǎn)量急劇下降，并且當(dāng)時(shí)間為48 h時(shí)，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間適合選擇48 h。

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間下hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.2 發(fā)酵條件RSM法優(yōu)化分析

2.2.1 發(fā)酵條件RSM法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與最佳工藝參數(shù)確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的RSM分析法，以發(fā)酵液中hPG+ShcPG質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵條件RSM法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析，結(jié)果見表4。hPG+ShcPG質(zhì)量濃度的回歸方程為Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB-0.054AC+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。由表4可知，模型P＜0.01，失擬項(xiàng)為0.606 9，表明模型具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此試驗(yàn)所得模型決定系數(shù)R2=0.986 2，說明建立的數(shù)學(xué)回歸模型擬合度較好，校正系數(shù)Radj2=0.968 3，說明該模型可以解釋96.83%的響應(yīng)值變化。試驗(yàn)因素中一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB、BC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對S.ruber產(chǎn)hPG+ShcPG的影響具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），交互項(xiàng)AC影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，相關(guān)因素對此次試驗(yàn)具有較大的影響，響應(yīng)值的變化不是簡單的線性關(guān)系。

表4 hPG+ShcPG發(fā)酵條件RSM中心組合設(shè)計(jì)的方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果建立的回歸方程進(jìn)行分析和擬合，得到響應(yīng)面對應(yīng)的等高線圖和響應(yīng)曲面圖，見圖6。響應(yīng)面圖中若圖形越陡峭，則說明兩因素間的交互作用影響越具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），越平坦說明影響越不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。等高線圖可以根據(jù)其圖形的形狀來判斷其交互影響的程度，若圖形為橢圓且密集則交互現(xiàn)象影響越具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 溫度，pH與總鹽度對hPG+ShcPG產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

由響應(yīng)面分析圖進(jìn)一步分析了3個(gè)因素對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的作用。圖6-A和圖6-E中三維曲面圖較陡峭，且圖6-B和圖6-F中等高線圖形接近橢圓形，表明溫度與pH、pH與總鹽度的交互作用影響具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖6-C中三維曲面圖較陡峭，但圖6-D高線圖形接近圓形，表明溫度與總鹽度的交互作用影響不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

若將交互項(xiàng)AC從回歸方程中剔除，且將其平方和及自由度并入試驗(yàn)誤差，進(jìn)行第二次方差分析，結(jié)果見表5。

表5 hPG+ShcPG發(fā)酵條件RSM中心組合設(shè)計(jì)的二次方差分析

二次方差分析結(jié)果表明，各項(xiàng)均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）且失擬項(xiàng)不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故hPG+ShcPG質(zhì)量體積濃度的回歸方程為Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。

在3個(gè)試驗(yàn)因素的編碼范圍內(nèi)，由Excel規(guī)劃求解得到的發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度28 ℃、pH 7.73和總鹽度2.85%。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方條件下hPG+ShcPG產(chǎn)量預(yù)測值為5.62 mg/L。

2.2.2 最佳發(fā)酵條件工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn)

在前期優(yōu)化最佳培養(yǎng)基配方工藝（花生油、蛋白胨、無水氯化鈣、六水合氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基礎(chǔ)上，培養(yǎng)溫度、pH和總鹽度分別為28 ℃，7.73和2.85%，發(fā)酵時(shí)間48 h，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的工藝驗(yàn)證值為5.71±0.12 mg/L（n=3），與預(yù)測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證明了RSM法優(yōu)化S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的最佳培養(yǎng)條件的可行性。

3 結(jié)論

綜合前期最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件的試驗(yàn)結(jié)果，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)基配方中花生油、蛋白胨、氯化鈣、氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL，培養(yǎng)基pH和總鹽度分別為7.73和2.85%，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在此工藝下，S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的產(chǎn)量為5.71±0.12 mg/L，是用MB培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)量的22.84倍，且預(yù)測值和測定值的絕對差值＜5%，表明回歸模型可靠。此次試驗(yàn)對紅色鄰米草菌S2-4-1HT發(fā)酵開發(fā)生產(chǎn)ShcPG具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。