顧東彥，王子雯，許孟月，楊彤，陳姣，劉學(xué)偉

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

關(guān)節(jié)病型銀屑?。≒soriasis arthropathica）或稱(chēng)銀屑病關(guān)節(jié)炎（Psoriatic arthritis，PsA）是銀屑病的一種特殊類(lèi)型，主要臨床表現(xiàn)為在尋常型銀屑病的皮損上伴有外周、中軸關(guān)節(jié)不同程度受累，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量與身心健康[1]。有研究顯示，PsA 在我國(guó)的發(fā)生率為5.8%[2]，國(guó)外報(bào)告PsA 在銀屑病中約占6%～41%[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用非甾體抗炎藥、激素和生物制劑進(jìn)行治療，但存在治愈率低、不良反應(yīng)大的風(fēng)險(xiǎn)[1]。中醫(yī)認(rèn)為濕熱毒邪痹阻經(jīng)絡(luò)是本病的主要病因，而以雷公藤為主的中藥提取物能有效改善類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與銀屑病的臨床癥狀，緩解患者疼痛，提高生活質(zhì)量，相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、多項(xiàng)藥理學(xué)和蛋白組學(xué)，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，強(qiáng)調(diào)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，闡釋藥物的藥理作用和疾病的發(fā)病機(jī)制[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析中藥雷公藤治療PsA 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床運(yùn)用和實(shí)驗(yàn)研究提供客觀科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 雷公藤活性成分與潛在靶點(diǎn)收集 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“雷公藤”為檢索詞，以化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18，篩選符合條件的活性成分及對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)，并使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 PsA 疾病靶點(diǎn)收集 通過(guò)GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、DrugBank（http：//go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“psoriasis arthropathica”、“psoriatic arthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，取交集并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，獲取疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將雷公藤活性成分及潛在作用靶點(diǎn)在Excel 中構(gòu)建對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用Cytoscpe3.7.2 軟件繪制“藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖?；钚猿煞峙c靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）構(gòu)建 將雷公藤與PsA共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（http：//string-db.org）在線數(shù)據(jù)庫(kù)，以置信度分?jǐn)?shù)＞0.9 為條件篩選，將所得結(jié)果以文本形式結(jié)合Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖并獲取核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（GO）富集和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)，以P＜0.05 為篩選條件，進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，進(jìn)一步闡明雷公藤治療PsA 的作用機(jī)制。GO 富集分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，包括細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程；KEGG 富集分析可以得到雷公藤和PsA 共同靶點(diǎn)富集的主要信號(hào)通路。

1.6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/pdb）下載靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式，使用PyMOL軟件去配體，再用AutoDock1.5.6 軟件去水加氫分配原子，計(jì)算電荷，保存為PDBQT 格式，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物的三維結(jié)構(gòu)，用CHEM3D 軟件做力場(chǎng)分析，最小能量化，進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白與化合物的對(duì)接，使用Discovery2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤活性成分 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選后，得到雷公藤活性成分51 個(gè)，刪除重復(fù)化合物和無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化合物，共獲得28 個(gè)活性成分和132 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 PsA 疾病靶點(diǎn) 在疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards、OMIM、DrugBank）檢索PsA 的作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后，共計(jì)得到1 393 個(gè)靶點(diǎn)。并利用Venny2.1.0 軟件繪制藥物-疾病韋恩圖，獲得藥物疾病交集靶點(diǎn)70 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 雷公藤-關(guān)節(jié)型銀屑病韋恩圖

2.3 雷公藤活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 運(yùn)用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建化合物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，度值（Degree）越大的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有160 個(gè)節(jié)點(diǎn)，414 條邊，見(jiàn)圖2。其中Degree 值前5 名的活性成分為山奈酚、β-谷固醇、雷公藤甲素、諾必列汀和豆甾醇等。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，雷公藤通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同作用的方式發(fā)揮藥效。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖 將70 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)設(shè)置參數(shù)，得到雷公藤治療PsA 潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果轉(zhuǎn)換為文本格式，利用Cytoscape3.7.2 軟件，運(yùn)用Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到潛在靶點(diǎn)基因拓?fù)鋮?shù)自由度，自由度表示節(jié)點(diǎn)所包含的邊的數(shù)目，靶點(diǎn)自由度越大，表明通過(guò)改該靶點(diǎn)發(fā)揮作用的可能性越大。根據(jù)2 倍Degree 值（12），得到核心靶點(diǎn)有11 個(gè)，見(jiàn)表1，相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖3。

表1 核心靶點(diǎn)信息

圖3 雷公藤治療PsA 的PPI

2.5 GO 和KEGG 功能富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)雷公藤和PsA 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，與生物過(guò)程（BP）相關(guān)條目270 個(gè)，主要涉及維生素D 生物合成過(guò)程的正調(diào)控、突觸傳遞的負(fù)調(diào)節(jié)，多巴胺能、氮素利用的調(diào)節(jié)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控等；與細(xì)胞成分（CC）相關(guān)條目29 個(gè)，主要涉及孔復(fù)合體、CD40 受體復(fù)合物、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜筏、細(xì)胞器膜等；與分子功能（MF）相關(guān)條目57 個(gè)，主要涉及前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、維生素D 24-羥化酶活性、9-順式視黃酸受體活性、一氧化氮合酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性等。以條形圖展示，見(jiàn)圖4。相同方法篩選KEGG 相關(guān)條目105 個(gè)，主要涉及癌癥的途徑、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路、Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等，選取前20 個(gè)以氣泡圖可視化，見(jiàn)圖5。

圖4 雷公藤治療PsA 的GO 富集分析

圖5 雷公藤治療PsA 的KEGG 富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 根據(jù)度值選取山奈酚和雷公藤甲素與靶點(diǎn)二聚體轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示結(jié)合能均為負(fù)值，表明受體與配體可以自發(fā)結(jié)合，能量＜-5 kcal/mol，提示二者之間有較強(qiáng)的結(jié)合活性，見(jiàn)表2，分子對(duì)接結(jié)果，見(jiàn)圖6。

表2 活性成分與靶點(diǎn)受體蛋白間的結(jié)合能

圖6 雷公藤治療PsA 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

關(guān)節(jié)病型銀屑病，皮膚表現(xiàn)在中醫(yī)上屬于“白疕”范疇，關(guān)節(jié)表現(xiàn)在中醫(yī)上屬于“歷節(jié)病”、“痹證”等范疇。致病原因多由機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，外邪侵襲所致。PsA 治療的目的在于緩解疼痛和延緩關(guān)節(jié)進(jìn)一步的破壞，同時(shí)兼顧治療關(guān)節(jié)炎和銀屑病皮損。傳統(tǒng)中藥雷公藤，味苦，有大毒，有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)等功效，藥理研究證實(shí)，雷公藤有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[6]。Zhao 等[7]研究表明雷公藤通過(guò)抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）磷酸化而抑制輔助性T 細(xì)胞17（Th17）功能，可明顯改善由咪喹莫特誘導(dǎo)的皮膚損傷。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法得到雷公藤治療PsA 的關(guān)鍵活性成分有山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素和豆甾醇等，以上活性成分可能是雷公藤治療PsA 的物質(zhì)基礎(chǔ)。山奈酚是天然的黃酮類(lèi)化合物，有抗氧化、抗癌、抗炎等多種生物學(xué)活性[8-9]。Liu等[10]觀察山奈酚能夠降低銀屑病型小鼠CD3+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)，下調(diào)皮膚中的促炎性核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）的信號(hào)傳導(dǎo)，在體外抑制T 細(xì)胞的增殖及絲氨酸蛋白激酶（mTOR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。β-谷甾醇屬于植物甾醇的一種，有多種藥理活性，有研究表明其在抗氧化、抗高血脂、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面有諸多藥理作用[11-12]。雷公藤甲素是中藥雷公藤的主要活性成分之一，有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性[13]。有研究表明，雷公藤甲素對(duì)銀屑病有明顯改善作用[14]。豆甾醇是一種植物甾醇，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，生物活性強(qiáng)，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低膽固醇和改善記憶等生物活性[15]。

根據(jù)雷公藤蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析，雷公藤治療PsA 的核心靶點(diǎn)有：STAT3、TNF、JUN、絲氨酸蛋白激活酶1（AKT1）、絲氨酸/蘇氨酸激酶14、8（MAPK14、MAPK8）、人源重組蛋白（RELA）、TP53 基因、趨化因子8（CXCL8）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、核蛋白轉(zhuǎn)錄因子（FOS）。STAT3 為STAT 家族的一員，STAT3 的激活是由多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子引起的，在成熟的吞噬細(xì)胞中，STAT3 抑制TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制炎性反應(yīng)[16]。TNF 超家族通路在細(xì)胞增殖、存活和死亡中起重要作用[17]。JUN 是一種二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由c-JUN，c-Fos，和ATF 家族的蛋白質(zhì)組成，TRPV1 刺激的細(xì)胞內(nèi)功能依賴(lài)于刺激調(diào)節(jié)蛋白激酶和刺激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的激活[18]。AKT1 是AKT 在響應(yīng)生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞外刺激的信號(hào)通路中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用，包括營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和存活[19]。MAPK 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的大家庭，MAPK14 和MAPK8 屬于其中一員，主要構(gòu)成了從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的炎性反應(yīng)信號(hào)通路[20]。RELA 是NF-κB 的關(guān)鍵成員，對(duì)炎性反應(yīng)環(huán)境至關(guān)重要[21]。據(jù)國(guó)外研究報(bào)告，磷酸二酯酶4 能抑制磷酸化的NF-κB 亞基p65 的易位，促進(jìn)細(xì)胞核周期蛋白D1 積累的丟失和細(xì)胞周期抑制劑p21 的增加，依那西普能夠使銀屑病患者皮損磷酸化的RELA 顯著下調(diào)，與表皮厚度減少，角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)[22-23]。研究顯示VEGF 在關(guān)節(jié)病型銀屑病患者中，其水平與紅細(xì)胞沉降率（ESR）、健康評(píng)估問(wèn)卷殘疾指數(shù)（HAQ）、銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）和視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）呈正相關(guān)[24]。CXCL8 屬于與血小板因子4 類(lèi)似的結(jié)構(gòu)相關(guān)的小型細(xì)胞因子家族，由吞噬細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞暴露于炎性刺激產(chǎn)生，并激活嗜中性白細(xì)胞誘導(dǎo)趨化性。

GO 功能富集分析顯示，雷公藤治療PsA 的基因功能主要體現(xiàn)在鐵對(duì)翻譯起始的正調(diào)控、維生素D 生物合成過(guò)程的正調(diào)控、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控、降鈣素1-單加氧酶活性的正調(diào)控等；孔復(fù)合體、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜筏、細(xì)胞器膜、核染色質(zhì)等；前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、維生素D 24-羥化酶活性、精氨酸結(jié)合、CCR5 趨化因子受體結(jié)合等。

KEGG 信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤活性成分治療PsA 的主要信號(hào)通路有：癌癥的途徑、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和NFκB 信號(hào)通路等。銀屑病可能與患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，與沒(méi)有銀屑病的患者比較，接受銀屑病治療的患者死于惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加41%[25]。TNF 及其超家族成員可以促進(jìn)免疫細(xì)胞活性，限制炎性因子，TNF 阻滯劑在關(guān)節(jié)病型銀屑病中可有效抑制炎性反應(yīng)和減輕癥狀[26]。Chimenti 等[27]觀察到賽妥珠單抗有效抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成黏附分子的表達(dá)，減少人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成趨化因子的分泌，治療關(guān)節(jié)病型銀屑病效果明顯。有國(guó)外報(bào)告顯示，IL-9、IL-22 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞增殖依賴(lài)于PI3K-Akt 通路，調(diào)節(jié)促炎因子[28-29]。TLR家族成員TLR7 和TIL8 拮抗劑對(duì)銀屑病的治療有較理想效果[30]。MAPK 激酶構(gòu)成了3 個(gè)重要信號(hào)通路，p38，JNK，控制細(xì)胞增殖、分化，基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡。表皮的廣泛增殖失衡導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生[31]。Lories 等[32]報(bào)告顯示依那西普治療關(guān)節(jié)病型銀屑病可導(dǎo)致NF-κB，JNK 和ERK 顯著降低，但p38 激酶不會(huì)降低。

綜上，雷公藤通過(guò)多基因、多通路、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療關(guān)節(jié)病型銀屑病的作用，這與中藥治療疾病多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)是一致的。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)分析了雷公藤治療關(guān)節(jié)病型銀屑病可能的作用機(jī)制，以期為中藥新藥的篩選和開(kāi)發(fā)提供思路和方法。