賈 楠,岳彩旭,呂雪茹,王雪婷,丁 寧,王圣惠

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

0 引言

3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)屬于氯代吡啶類化合物,它是化學(xué)農(nóng)藥毒死蜱、甲基毒死蜱、綠草定及綠草定-2-丁氧基乙酯的高毒難降解殘留物[1-3]。TCP在環(huán)境中的半衰期為65～360天[4],目前已被世界公認(rèn)為持久性有機(jī)污染物[5]。相比于母本化合物,TCP具有更高的水溶性和移動性,更易進(jìn)入地表水體和土壤,從而造成大面積的擴(kuò)散和污染[6-8]。然而,近十年來,由于毒死蜱及綠草定類化學(xué)農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和超量使用,TCP的污染問題日趨嚴(yán)重[9-11],進(jìn)而對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[12,13]。

微生物降解是消除毒死蜱殘留的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而,由于TCP具有抑菌活性,它不但能抑制本身的微生物降解,還能抑制其母體以及其他有機(jī)污染物的生物降解[14]。TCP的這種特性加重了環(huán)境中有機(jī)污染物的積累,嚴(yán)重影響了生態(tài)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力[15]。早期TCP 降解菌的篩選是從毒死蜱降解菌中分離、鑒定并被進(jìn)一步加以研究。近年來,國內(nèi)外科研工作者已從長期施用毒死蜱的農(nóng)田土壤、蔬菜大棚土壤和農(nóng)藥污水處理廠曝氣池中,分離了多株好氧TCP降解菌株。主要包括MicrococcusluteusML[16],Paracoccussp. TRP[17],SerratiaandTrichosporonspp.[18],BacilluslatersprorusDSP[19],Ralstoniasp. T6[20],Cupriavidussp. DT-1[21],Cupriavidussp. P2[22],Pseudomonassp. AY-1[23],Rhodotorulaglutinisspp.andRhodotorularubraspp.[24],BacillusthuringiensisMB497[25],Pseudomonassp. CB2[26],Xanthomonassp. 4R3-M1,Pseudomonassp. 4H1-M3[27]和Ochrobactrumsp. JAS2[28]等。最新研究發(fā)現(xiàn),在缺氧或厭氧的條件下TCP可以被微生物菌群徹底降解,且添加NanoFe3O4能加速TCP的缺氧或厭氧生物降解[29,30]。

在好氧條件下,TCP降解菌株主要通過還原脫氯和氧化脫氯的方式降解 TCP。在還原脫氯過程中,TCP 逐次脫掉吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)上的3個氯原子,分別生成5,6-二氯-2-吡啶酚,6-氯-2-吡啶酚和2-羥基吡啶,如菌株BacilluslatersprorusDSP、Cupriavidussp. DT-1以及Ochrobactrumsp. JAS2[19,21,28]。在氧化脫氯過程中,TCP 脫去3個氯原子生成一種綠色代謝產(chǎn)物3,6-羥基吡啶-2,5-二酮,隨后被完全礦化,如菌株Ralstoniasp. strain T6和Cupriavidussp. P2[20,22]。在缺氧或厭氧的條件下,微生物菌群主要通過還原脫氯途徑,將TCP降解為6-氯-2-吡啶醇,再進(jìn)一步脫氯生成2-羥基吡啶,最后被礦化[29]。最近有研究報道,BacillusthuringiensisMB497 還可以通過反硝化途徑對TCP進(jìn)行降解[25]。目前,還有部分研究報道了一些新的TCP代謝產(chǎn)物[31,32],但TCP的代謝機(jī)制仍不清楚。

為了研究TCP完整的微生物代謝途徑,本課題組從毒死蜱及TCP污染的農(nóng)田土壤中分離出一株TCP降解菌株,隨后對該菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定、TCP降解性能檢測以及代謝產(chǎn)物鑒定,在此基礎(chǔ)上初步推測了該菌株可能的TCP代謝途徑。這將為微生物降解TCP機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

檢測標(biāo)準(zhǔn)品:TCP購買自畢得醫(yī)藥,純度99 %(中國上海)。6-氯-2-吡啶醇(≥97%)和2-羥基吡啶(≥97%)購自上海麥克林生化科技有限公司(中國上海)。3,5-二氯-2-吡啶醇(≥98%)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司(中國上海)。

其余試劑:無水乙醇(≥99.5%)、氫氧化鈉(≥96%)和乙酸(≥99.5 %)購自煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司(中國山東);甲醇(HPLC)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(中國上海);其余藥品和試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方。下列培養(yǎng)基配置時除特殊說明外,均用蒸餾水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌30 min,固體培養(yǎng)基在此配方的基礎(chǔ)上加入2 %(w/v)瓊脂粉末。富集培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L。無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM培養(yǎng)基):硝酸銨 1.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、硫酸銨0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、酵母提取物0.05 g/L。

1.2.2 TCP降解菌的分離鑒定。TCP降解菌株是從毒死蜱污染的農(nóng)田土壤中分離出來的。土壤樣品為山東省聊城市長期噴灑毒死蜱的旱地和韭菜種植場的表層土壤(0～20 cm)混合物。將TCP富集培養(yǎng)物用無菌水稀釋至合適濃度后涂布在LB平板上(TCP 100 mg/L),放入35 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至平板上長出邊緣清晰的單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)接入MSM平板上(TCP 50 mg/L),放入35 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),此時生長的菌落為具有TCP降解能力的目標(biāo)菌株。

將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600 nm≈0.6,8 000 r/min離心5 min收集菌體,采用全式金柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取。

PCR擴(kuò)增:采用細(xì)菌通用引物:27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 對菌株進(jìn)行 16S rDNA 擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將PCR產(chǎn)物送至金唯智測序公司測序,根據(jù)所獲得的16S rDNA序列上傳至GenBank中獲得登錄號 OK 602639.1。用MEGA 4.0軟件對16S rDNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 生物降解性能研究。將菌株在LB培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600 nm≈0.8),8 000 r/min離心5 min收集菌體,用等體積的無菌PBS洗滌菌體兩次,控制菌體濕重在0.1 g。之后轉(zhuǎn)移至200 mL MSM培養(yǎng)基中(TCP 50 mg/L),以不接入微生物的純培養(yǎng)基做對照,37 ℃ 150 r搖床培養(yǎng)。所有處理設(shè)置三組平行,保證實驗準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1.2.4 菌株降解其他氯代吡啶類化合物的研究。選取其他氯代吡啶類化合物:3,5-二氯-2-吡啶酚、6-氯-2-吡啶醇、2-羥基吡啶,進(jìn)行菌株降解性能研究。將培養(yǎng)至合適的菌株(培養(yǎng)條件同1.2.3)接入MSM培養(yǎng)基(含50 mg/L 3,5-二氯-2-吡啶酚、25 mg/L 6-氯-2-吡啶醇、50 mg/L 2-羥基吡啶)中,以未接種菌株的純代謝產(chǎn)物作為對照組,37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng),定期收集培養(yǎng)液并進(jìn)行HPLC檢測。所有處理設(shè)置三組平行,保證實驗準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DFT的分離鑒定

從毒死蜱及TCP污染的農(nóng)田土壤中分離得到幾株細(xì)菌,通過菌株在LB以及以TCP為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài),得到生長最好的一株細(xì)菌命名為DFT。該菌株能在以TCP(50 mg/L)為唯一碳源的無機(jī)鹽平板上生長良好,如圖1所示,初步證明菌株DFT具有降解TCP的能力。隨后,以菌株DFT基因組為模板,采用細(xì)菌擴(kuò)增通用引物,PCR擴(kuò)增菌株DFT的16S rDNA序列并測序分析。將菌株DFT的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對分析,選擇相關(guān)序列,采用MEGA 4.0軟件的Neighbor joining鄰位歸并法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap>95%),如圖2所示。菌株DFT與Delftiatsuruhatensisstrain NBRC 16741的16S rDNA序列相似性為100% (圖2),初步將菌株DFT鑒定為代爾夫特菌屬(Delftia. sp),其Genbank登入號為OK_602639.1。

圖1 菌株DFT在MSM(TCP 50 mg/L)固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)

圖2 菌株DFT(Genbank:OK_602639.1 )的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 菌株DFT對TCP降解性能檢測

將菌株DFT接種到以TCP(50 mg/L)為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中,不同的時間點取樣,檢測菌株DFT生長及其對TCP的降解情況,如圖3所示。 在以TCP為唯一碳源的培養(yǎng)液中,菌株DFT有明顯的生長,其OD600 nm的吸光度值從初始的0.037(0 h)升到了0.108(48 h)。在菌株生長的同時伴隨著TCP的降解,菌株DFT能在48 h內(nèi)對50 mg/L TCP的降解率達(dá)34.28%。這些結(jié)果表明,菌株DFT能夠以TCP為唯一碳源生長,并表現(xiàn)出了較高的TCP降解性能。

圖3 菌株DFT的生長降解曲線

2.3 TCP代謝產(chǎn)物鑒定

收集不同時間點菌株DFT對TCP的降解產(chǎn)物,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測并鑒定TCP的降解產(chǎn)物。在菌株DFT降解TCP過程中,共檢測到12種可能的TCP 代謝產(chǎn)物,其在液相色譜中的保留時間為0.361～6.313 min(圖4)。這12種代謝產(chǎn)物去質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子如表1所示。

表1 菌株DFT的TCP代謝產(chǎn)物分析

圖4 菌株DFT降解TCP過程中中間代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析

其中TCP的去質(zhì)子化分子離子在m/z=195.913 2 (M-H)-、197.910 2 (M-H)-、199.906 9 (M-H)-和201.903 3 (M-H)-〔圖5(a)〕。去質(zhì)子化分子離子在m/z=195.911 3 (M-H)-和m/z=197.910 2 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為3,5,6-三氯-2-甲基吡啶〔圖5(b)〕、m/z=213.936 8 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為3,5,6-三氯-2-甲氧基吡啶〔圖5(c)〕。這兩種代謝產(chǎn)物被鑒定為TCP烷基化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,最終這兩種產(chǎn)物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為CO2[14]。

注:(a) TCP; (b) 3, 5, 6-三氯-2-甲基吡啶; (c) 3, 5, 6-三氯-2-甲氧基吡啶; (d) 3-氯-5,6-二氫吡啶-2(1H)-酮; (e) 尼古丁藍(lán); (f)3-(2,4,5-三氯苯氧基)-1-丙炔; (g) 對丙基苯酚; (h) 3,6-二氯-2,5-二吡啶酮; (i) 3,6-二氯-2,5-二羥基吡啶; (j) 6-氯-3-羥基吡啶-2,5-二酮; (k) 6-氯-2,3,5-三羥基吡啶; (l) 1,3-二氯-2-丁烯氰; (m) 1-醛-2-丁烯酰胺

m/z=129.972 5 (M-H)-和132.945 3 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為3-氯-5,6-二氫吡啶-2(1H)-酮〔圖5(d)〕、m/z=248.915 6 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為尼古丁藍(lán)〔圖5(e)〕。這些代謝產(chǎn)物被鑒定為菌株Cupriavidussp. DT-1的TCP還原脫氯代謝產(chǎn)物[21]。

去質(zhì)子化分子離子在m/z=232.882 7 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為3-(2,4,5-三氯苯氧基)-1-丙炔〔圖5(f)〕。去質(zhì)子化分子離子在m/z=134.916 2 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為對丙基苯酚〔圖5(g)〕。這兩種代謝產(chǎn)物曾在菌株BacillusthuringiensisMB497代謝TCP的過程中有報道[25]。

去質(zhì)子化分子離子在m/z=177.943 9 (M-H)-和m/z=179.942 5 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為3,6-二氯-2,5-二吡啶酮〔圖5(i)〕或3,6-二氯-2,5-二羥基吡啶〔圖5(h)〕、m/z=159.964 7 (M-H)-和m/z=159.962 1 (M-H)-處的產(chǎn)物被鑒定為6-氯-3-羥基吡啶-2,5-二酮〔圖5(j)〕或6-氯-2,3,5-三羥基吡啶〔圖5(k)〕、m/z=135.920 4 (M-H)-處產(chǎn)物被鑒定為1,3-二氯-2-丁烯氰〔圖5(l)〕、m/z=97.959 7 (M-H)-處產(chǎn)物被鑒定為1-醛-2-丁烯酰胺〔圖5(m)〕。這些代謝產(chǎn)物在菌株CupriavidusnantongensisX1T、Ralstoniasp. T6、Cupriavidussp. P2降解TCP過程中被發(fā)現(xiàn)[4,20,22]。

2.4 TCP代謝途徑推測

根據(jù)上述質(zhì)譜結(jié)果,初步推測菌株DFT可能存在四種TCP的降解方式(圖6)。第一種是烷基化途徑,在菌株DFT降解TCP過程中,發(fā)生烷基化反應(yīng),生成3, 5, 6-三氯-2-甲基吡啶或3, 5, 6-三氯-2-甲氧基吡(圖6 ①),最終轉(zhuǎn)化為CO2[14]。第二種是反硝化途徑,菌株DFT代謝TCP生成3-(2,4,5-三氯苯氧基)-1-丙炔和對丙基苯酚(圖6②),最終對丙基苯酚被礦化生成CO2和H2O。 目前研究發(fā)現(xiàn),BacillusthuringiensisMB497在代謝TCP的過程中也存在這種代謝方式[25]。第三種是還原脫氯途徑,菌株DFT將TCP還原脫氯為3-氯-5,6-二氫吡啶-2(1H)-酮,并最終轉(zhuǎn)化為尼古丁藍(lán)被降解(圖6③)。菌株DFT的這種TCP降解方式與Cupriavidussp. DT-1菌株對TCP的降解途徑相似[21]。 第四種是水解-氧化脫氯途徑,菌株DFT通過水解及氧化脫氯依次將TCP轉(zhuǎn)化為 3,6-二氯-2,5-二吡啶酮、3,6-二氯-2,5-二羥基吡啶、6-氯-3-羥基吡啶-2,5-二酮、6-氯-2,3,5-三羥基吡啶、1,3-二氯-2-丁烯氰、1-醛-2-丁烯酰胺(圖6④)。據(jù)文獻(xiàn)報道,菌株CupriavidusnantongensisX1T、Ralstoniasp. T6、Cupriavidussp. P2、PseudomonasnitroreducensAR-3也通過水解-氧化脫氯代謝TCP[4,20,22,33]。

圖6 菌株DFT降解TCP的四種可能代謝途徑

2.5 菌株DFT對其它氯代吡啶類化合物的降解

菌株DFT不但能降解TCP,還能降解其它氯代吡啶類化合物。將菌株DFT接種在同時含有3,5-二氯-2-吡啶醇(50 mg/L)、6-氯-2-吡啶醇(25 mg/L)和2-羥基吡啶(50 mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中,不同時間點取樣,其降解情況如圖7所示。在7天內(nèi),菌株DFT能夠代謝45.4% 的3,5-二氯-2-吡啶醇(50 mg/L)、65.0%的6-氯-2-吡啶醇(25 mg/L)和38.0% 的2-羥基吡啶(50 mg/L)。隨著時間的延長,3,5-二氯-2-吡啶酚和6-氯-2-吡啶醇被逐漸降解,在120 h后達(dá)到穩(wěn)定。2-羥基吡啶在降解過程中濃度先增加后降低,推測可能是菌株DFT前期先脫氯降解3,5-二氯-2-吡啶酚和6-氯-2-吡啶醇過程中產(chǎn)生了2-羥基吡啶,從而導(dǎo)致2-羥基吡啶降解初期有明顯積累,但隨著降解時間延長,2-羥基吡啶濃度不斷減低并被降解。以上結(jié)果表明,菌株DFT能夠降解其他吡啶類化合物,具有明顯的脫氯和降解吡啶環(huán)的能力。

圖7 菌株DFT降解其他氯代吡啶類化合物

3 討論

3.1 Delftia菌屬對環(huán)境污染物的修復(fù)性能

3.2 TCP的微生物代謝途徑

不同的微生物對TCP的代謝途徑不盡相同,據(jù)報道TCP主要有四條不同的代謝途徑,分別是水解-氧化脫氯途徑、還原脫氯途徑、反硝化途徑及烷基化途徑[14,16,48-52]。目前文獻(xiàn)已報道,微生物能通過烷基化途徑降解TCP[14];Cupriavidussp. DT-1通過還原脫氯途徑降解TCP[21];CupriavidusnantongensisX1T、Ralstoniasp. T6、Cupriavidussp. P2通過水解-氧化脫氯途徑降解TCP[4,20,22];BacillusthuringiensisMB497通過反硝化途徑降解TCP[25]。 上述報道僅發(fā)現(xiàn)在同一菌中,可能只存在一種TCP的代謝途徑[4,6,8,25,26]。最近有研究報道BacillusthuringiensisMB497在代謝TCP過程中存在反硝化脫氯途徑和脫氯酶和氧化酶參與的脫氯反應(yīng)兩種不同的TCP代謝方式[25]。還有研究發(fā)現(xiàn),MicrococcusluteusML菌可能同時存在水解氧化脫氯和反硝化兩種TCP代謝途徑[16]。目前,關(guān)于TCP代謝途徑的關(guān)鍵基因報道較少。Cao等人在CupriaviduspauculusP2的突變株文庫中篩選到有關(guān)TCP降解的基因:單加氧酶基因(tcpAl)和黃素還原酶基因(tcpBl),共同催化了TCP的水解脫氯反應(yīng),最終生成3,6-二酮-2,5-二羥基吡啶[22]。Li等人從菌株Ralstoniasp. strain T6中得到兩個TCP降解基因簇tcpRXA和dhpRIJK,其中tcpRXA基因簇編碼產(chǎn)生的酶能夠使TCP轉(zhuǎn)化為3,6-二酮-2,5-二羥基吡啶,dhpRIJK編碼產(chǎn)生的酶能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-氨基-2,4,5-三氧戊酸,最終被礦化[20]。同樣在菌株CupriavidusnantongensisX1T中tcpA和fre是降解TCP的兩個關(guān)鍵基因,編碼產(chǎn)生的酶能夠催化化 3,6-二氯-2,5-二羥基吡啶的鄰位和間位脫氯[4]。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,目前尚未見到關(guān)于TCP四種代謝通路中涉及的關(guān)鍵基因表達(dá)情況的任何分析報道,下一步的研究仍需要完善這些信息。

3.3 Delftia sp. DFT 降解TCP的代謝途徑

在本研究中,我們通過代謝組學(xué)檢測分析發(fā)現(xiàn),菌株DFT降解TCP過程中既有部分烷基化反應(yīng)代謝產(chǎn)物、部分反硝化反應(yīng)代謝產(chǎn)物、部分還原脫氯代謝產(chǎn)物,還有比較完整的TCP水解-氧化脫氯代謝產(chǎn)物?；诰甑拇x組學(xué)分析,我們初步推測四種不同的TCP代謝方式可能共同參與了菌株Delftiasp.DFT對TCP的生物降解。下一步可能還需要借助基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證TCP的完整代謝通路。

4 結(jié)論

本研究分離鑒定了一株能降解TCP的Delftiasp.DFT,該菌株能在48 h內(nèi)對50 mg/L的TCP降解率達(dá)34.28%,同時也能降解3,5-二氯-2-吡啶醇、6-氯-2-吡啶醇和2-羥基吡啶等其他氯代吡啶類化合物。TCP代謝途徑分析表明,水解-氧化脫氯途徑、還原脫氯途徑、反硝化途徑及烷基化反應(yīng)可能共同參與了菌株DFT對TCP的降解。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,這是首次在Delftiasp. 菌中發(fā)現(xiàn)有四種可能的TCP代謝途徑的報道,這為純培養(yǎng)物中TCP降解機(jī)制的研究提供了新的參考信息。