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超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速定性和定量篩查貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品非法添加的水楊酸甲酯

2024-04-10 08:35:52劉路皮璟漁余永紅劉小輝胡紅剛梁國東
醫(yī)療裝備 2024年5期
關(guān)鍵詞:水楊酸甲酯醫(yī)療器械質(zhì)譜

劉路,皮璟漁,余永紅,劉小輝,胡紅剛,梁國東

江西省醫(yī)療器械檢測中心 (江西南昌 330000)

現(xiàn)代生活強度高、節(jié)奏快,許多人或因長期體 力勞動,或因長期對著電腦及手機,身體處于亞健康狀態(tài),并伴肩頸、腰椎、關(guān)節(jié)等疼痛。為緩解此類癥狀,一般選擇貼膏劑藥物和貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品。此兩類產(chǎn)品省時、方便、見效快,市場前景廣闊。其中貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品包括醫(yī)用冷敷貼、遠紅外貼、穴位刺激貼、降溫貼、熱療貼、熱灸貼等,屬于第一類醫(yī)療器械。國家藥品監(jiān)督管理局于2021 年12 月組織修訂的《第一類醫(yī)療器械產(chǎn)品目錄》[1]中明確強調(diào),該類醫(yī)療器械產(chǎn)品中不能含有中藥(薄荷、麝香、肉桂、艾葉等)、化學藥物(水楊酸、水楊酸甲酯、布洛芬、鹽酸利多卡因等)、生物制品(血清白蛋白、細胞因子、酶、干擾素等)、消毒和抗菌成分(次氯酸、鹽酸奧替尼啶、苯扎溴銨等)、天然植物(洋甘菊、百里香、薄荷腦、薄荷醇等)及其提取物等發(fā)揮藥理學、免疫學、代謝作用的成分或者可被人體吸收的成分?;颊呷魧Ξa(chǎn)品成分潛在風險不了解,長期大量使用、錯誤使用可能會產(chǎn)生許多不良反應(yīng),嚴重損傷機體的生命系統(tǒng),威脅患者的生命安全[2-5]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定其非法添加化學成分(如雙氯酚酸鈉、潑尼松、萘普生、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、氫化可的松、酮洛芬、醋酸潑尼松、對乙酰氨基酚等)的報道較多[6-10],但對水楊酸甲酯含量測定的報道較少。查詢相關(guān)文獻,水楊酸甲酯的檢測方法主要有液相色譜法[11,15-16]和氣相色譜法[12-13],且多針對藥品,包括橡膠膏劑[11-12]、藥油[13]、軟膏[14-15]、片劑、膠囊劑等[16-18],但關(guān)于高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的報道較少。

目前針對腰腿疼痛有活血化瘀、消腫止痛的貼膏劑和貼敷類醫(yī)療器械。而貼敷類醫(yī)療器械基質(zhì)復雜,多含有粘貼層,膠狀物成分不明,一般包括醫(yī)用壓敏膠和遠紅外陶瓷粉,氣相、液相色譜法檢測易出現(xiàn)假陽性。本研究以貼敷類醫(yī)療器械為對象,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定,利用色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性,實現(xiàn)對目標物的分離、確認和定量分析,旨在為敷貼類醫(yī)療器械的市場監(jiān)督管理提供技術(shù)支持與參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-XEVO-TQD 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters 公司,配置電噴霧離子源ESI)、ME5 超微量電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司], BT25S 電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],CLXXUVFM2 超純水器(威立雅集團上海公司),HH-8 恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)。

水楊酸甲酯對照品(純度100.0%,中國食品藥品檢定研究院);甲醇(質(zhì)譜純,Honeywell公司);甲醇(色譜純,Honeywell公司);氨水(質(zhì)譜純,Aladdin 公司),實驗用水為符合GB/T 6682-2008 的二級水。

供試樣品為各大藥房和網(wǎng)絡(luò)購買所得貼敷類醫(yī)療器械。

1.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品0.01 g(精確至0.01 mg),置于10 ml 棕色容量瓶中,加色譜純甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的對照儲備溶液。分別取適量對照儲備溶液于10 ml 棕色容量瓶中,用色譜純甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,得1~100 μg/ml 水楊酸甲酯對照系列溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取樣品1 貼,撕開粘貼層,貼在定量濾紙上,用剪刀裁去多余濾紙,然后將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm的小片,置于150 ml 燒瓶中,加入色譜純甲醇40 ml,置于恒溫水浴鍋內(nèi)70℃連續(xù)回流2 次,每次2 h;合并浸提液并用色譜純甲醇分3 次沖洗燒瓶,再用色譜純甲醇定容至100 ml 容量瓶,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣分析,同法制備空白溶液進行比較。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件:WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相A 為0.05%氨水,B 為質(zhì)譜純甲醇,按表1 進行梯度洗脫;流速為0.2 ml/min,進樣量為10 μl;柱溫為40 ℃。 質(zhì)譜條件:電離方式為電噴霧電離負離子模式、質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測、毛細管電壓為2.50 kV、脫溶劑溫度為500 ℃、脫溶劑氣流為1000 L/h,其他參數(shù)見表2。

表1 UPLC 流動相梯度洗脫程序

表2 水楊酸甲酯的回收率實驗結(jié)果(n=6)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為10 μg/ml 的水楊酸甲酯對照溶液進行一級質(zhì)譜全掃描和二級質(zhì)譜轟擊,以目標物的分子離子和豐度較強、干擾較小的子離子組成離子對進行監(jiān)測。同時對特征離子及離子間的豐度比作定性分析、豐度最高的特征離子作定量分析,以提高方法的準確性和專屬性。質(zhì)譜的錐孔電壓和碰撞對目標物的裂解起著重要作用,因此重點優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能,以進一步提高該方法的靈敏度。實測水楊酸甲酯在8.12 min處出現(xiàn)色譜峰,響應(yīng)的MRM 母離子為151 m/z,子離子為91 m/z、121 m/z,選取91 m/z 為定量離子、121 m/z為定性離子,碰撞電壓為18 eV,錐孔電壓為26 eV。

2.2 色譜參數(shù)的優(yōu)化

本實驗從靈敏度、分離效果、分析時間、峰形方面綜合考慮BEH C8 柱、 C18 柱,最終選擇BEH C18 柱。流動相的選擇中,觀察乙酸銨(2 mmol/L、10 mmol/L)-甲醇、乙酸銨(2 mmol/L、10 mmol/L)-乙腈、甲酸水(0.05%、0.10%)-甲醇、氨水(0.05%、0.1%、0.2%)-甲醇等多個系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下,對水楊酸甲酯的電離具有抑制作用,導致質(zhì)譜沒有響應(yīng),需使用堿性試劑提高離子化效率、增加信號強度,故采用氨水-甲醇系統(tǒng)。通過考察不同濃度的氨水(0.05%、0.1%、0.2%)發(fā)現(xiàn)氨水濃度為0.05%時,水楊酸甲酯的峰形、響應(yīng)值均較好,選擇0.05%氨水-甲醇作為流動相。鑒于堿性流動性對儀器的損傷較大,分析0.20、0.25、0.30 ml/min 的流速后,采用0.2 ml/min 的流速。

2.3 方法驗證

2.3.1 專屬性試驗

取“1.2 項下的對照品溶液的制備”的溶液,按“1.3.2”項下條件進樣測定,水楊酸甲酯定性和定量離子對的MRM 圖見圖1。取陽性樣品、空白樣品分別按照“1.3.1”項下方法制備,按“1.3.2”項下條件進樣測定,陽性樣品、空白樣品的定性和定量離子對的MRM 圖分別見圖2~3。從圖1、圖2 中可以看出,對照品和陽性樣品的峰型對稱、尖銳,分離度良好,基線較為平穩(wěn),且陽性樣品中的定性離子、定量離子的保留時間及離子豐度比均與對照品的保留時間、離子豐度比一致,則予以確認含有同一物質(zhì)。從圖3 中可看出,空白樣品的定性和定量離子出峰時間、離子豐度比均不一致,則不予確認,表明該方法專屬性較強。

圖1 對照品定性和定量離子對的MRM 圖

圖2 陽性供試品定性和定量離子對的MRM 圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

配制質(zhì)量濃度為1 、2、4、6、8、10、20、50、80、100 μg/ml 水楊酸甲酯標準系列溶液,按“1.3.2”測定,以定量離子的峰面積值對濃度進行線性回歸,線性方程為y=0.50307x+191.14(r=0.9997),結(jié)果表明,相關(guān)系數(shù)r>0.999,水楊酸甲酯 1~100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 檢出限

UPLC-MS/MS 使目標物的精確質(zhì)量數(shù)提取,基線噪音很低,信噪比一般較大,因此本實驗不選擇S/N 為3∶1 的濃度作為化合物檢出限,S/N 為10∶1 的濃度作為化合物定量限[8],而是逐級稀釋對照品溶液,以最小響應(yīng)信號所對應(yīng)的濃度作為檢出限,然后以檢出限的3 倍確定定量限,實驗測得檢出限為0.1 μg/ml、定量限為0.3 μg/ml。

2.3.4 精密度

取樣品按“1.3.1”方法制備的供試品溶液、質(zhì)量濃度為50 μg/ml 的對照品溶液,分別連續(xù)測定6 次。在MRM 模式下計算提取定量離子峰面積的相對標準偏差(relative standard de-viation,RSD)為0.7%(n=6),結(jié)果顯示方法的精密度良好。

2.3.5 回收率

選取陰性樣品分別添加0.1、0.5、2 mg 3 個水平進行加標回收實驗,每個水平各6 份樣品,按照“1.3.1”處理、“1.3.2”測定,結(jié)果顯示回收率為90.3%~100.7%,RSD 為0.5%~0.9%,表明回收率良好,見表2。

2.3.6 穩(wěn)定性

取陽性樣品,按照“1.3.1”處理、“1.3.2”分析,分別在0、12、24、30、36、48 h 測定。在MRM模式下計算提取定量離子峰面積的RSD 為0.6%,RSD<5%(見表3),表明陽性樣品中的目標物48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 水楊酸甲酯的穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.4 樣品制備方法的分析

本研究對貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品進行探討,患者在使用產(chǎn)品時貼于患處,一般以1 貼為1 次用量,貼的大小與患者的部位有關(guān),因此以1 貼為實驗用量。參照相關(guān)文獻[6,14],選擇甲醇為樣品的浸提溶劑并采取冷凝回流的方式,獲得浸提液。供試樣品為各大藥房和網(wǎng)絡(luò)購買所得貼敷類醫(yī)療器械,部分貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品名稱及宣稱功效舉例見表4。以鐵粉或其他粉末致熱為工作原理的熱療貼、熱灸貼等貼敷類醫(yī)療器械一般含有發(fā)熱粉劑,且發(fā)熱粉劑不接觸皮膚,不適用于此樣品制備方法。

表4 部分貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品名稱及宣稱功效舉例

2.5 貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品中水楊酸甲酯的測定

采用建立的UPLC-MS/MS 方法對市售和網(wǎng)購的貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品(包括醫(yī)用冷敷貼、醫(yī)用冷敷凝膠、遠紅外鎮(zhèn)痛貼、暈車貼、雞眼貼等)是否添加水楊酸甲酯進行檢測。114 份樣品中,共檢出陽性樣品29 份,檢出率為25.4%,含量為每貼1~47 mg,且陽性樣品多集中在醫(yī)用冷敷貼、遠紅外鎮(zhèn)痛貼樣品中。

3 討論

面對日益復雜的貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量安全形勢,檢驗、檢測能力亟需高質(zhì)量發(fā)展,以滿足安全監(jiān)管的需要。氣相、液相色譜法是篩查食品、藥品中非法添加物常用的方法,但由于貼敷類醫(yī)療器械基質(zhì)復雜,成分不明,基質(zhì)中的其他成分可能與水楊酸甲酯具有相同的保留時間,所以需高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供準確可靠的信息[5],所以通常利用色譜法進行初篩,再用UPLC-MS/MS 法驗證,試驗過程步驟多且復雜,耗時過長。本研究通過質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化及方法學驗證,證明本研究建立的UPLC-MS/MS 法簡便可靠、快速高效,可有效對貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品中是否添加水楊酸甲酯進行監(jiān)測。另外,貼敷類醫(yī)療器械非法添加成分繁雜,可參考文獻[6-9]與本研究方法同時測定多種成分,省時省力,為批量處理分析樣品提供便捷。本研究對114 份樣品進行測定,發(fā)現(xiàn)陽性樣本29 份,滿足對目標物進行精準分析的要求,進一步驗證了該方法可用于大批量樣品檢測的有效性和實用性。

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